連南縣茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析

李華鋒，滕杰，莫嵐，曾雯，晏嫦妤，黃亞輝

連南縣茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析

李華鋒，滕杰，莫嵐，曾雯，晏嫦妤*，黃亞輝*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，廣東廣州510642)

用RAPD分子標記對廣東連南縣渦水、黃連和大龍3處茶樹群體的45份種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析，從DNA角度深入探討了連南茶樹的分類及其親緣關(guān)系。利用已篩選好的17條擴增效果良好的引物進行RAPD擴增反應(yīng)后，共擴增出124條譜帶。其中多態(tài)性帶為119(占96.0%)，總的Nei's基因多樣性指數(shù)(H)和香濃信息指數(shù)(I)分別為0.491和0.684。根據(jù)RAPD分析結(jié)果，通過UPGMA類平均法聚類法，對45份茶樹種質(zhì)資源進行聚類分析，結(jié)果表明:3處茶樹群體的供試材料基本上都可以各組聚成一類。從上述的結(jié)果可得:連南茶樹種質(zhì)資源的遺傳多樣性高、遺傳基礎(chǔ)豐富且具有明顯的地域獨特性;連南茶樹種質(zhì)資源群體之間存在著較大的遺傳分化。

連南;茶樹種質(zhì)資源;遺傳多樣性;RAPD

連南瑤族自治縣，位于廣東省的西北部，東北與連縣交界，東南與陽山相連，南接懷集縣，西鄰連山壯族瑤族自治縣，西北與湖南江華瑤族自治縣接壤。連南地處萌諸嶺山脈南麓，四面環(huán)山，中部比較平坦，屬于中亞熱帶季風濕潤氣候區(qū)，光照強，雨量充沛，有雨熱同季的優(yōu)勢，四季分明，立體氣候明顯，素有“九山半水半分田”之稱［1］，適合各種農(nóng)作物生長，也是茶樹生長的好地方。茶葉是連南的特色農(nóng)產(chǎn)品之一，早在清朝末年就有栽種。民國時期的《連縣志》記載到:“茶葉產(chǎn)量以大龍最多，并將黃連茶作為地方特產(chǎn)茶?！蹦壳斑B南大力發(fā)展茶業(yè)，茶園面積和茶葉產(chǎn)量大大增加，全縣有7個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(大麥山鎮(zhèn)、寨崗鎮(zhèn)、大坪鄉(xiāng)、盤石鄉(xiāng)、金坑鄉(xiāng)、山聯(lián)鄉(xiāng)、寨南鄉(xiāng))產(chǎn)茶，茶園面積達到500 hm2，茶葉年產(chǎn)量達到50 t。連南的黃連紅茶、大葉茶、天堂茶、高界茶、中坑茶、大龍茶等品質(zhì)均較好，廣受外界關(guān)注［2］。邱陶瑞，方金福，余宗澤等于1982年10月和1983年4月對連南茶樹資源的植物學(xué)特征、制茶品質(zhì)、生化成分做了相關(guān)的調(diào)查和研究，取得了一定的成果，但至今尚未從DNA分子水平對連南茶樹種質(zhì)資源進行分析。

隨機擴增多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphic DNA，RAPD)是以基因組DNA為模板，以一個隨機的寡核苷酸單鏈做引物，通過PCR擴增反應(yīng)產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，經(jīng)電泳檢

測其多態(tài)性。RAPD分子標記技術(shù)于20世紀90年代中期應(yīng)用在茶樹遺傳多樣性研究中，世界主要茶產(chǎn)區(qū)學(xué)者利用此分子技術(shù)研究茶樹遺傳多樣性都有相關(guān)報道。吳美貞［3］對韓國35個自生茶樹的RAPD分析表明其遺傳多樣性達84.5%;Warchira等［4］用RAPD標記技術(shù)對肯尼亞茶樹種質(zhì)資源進行研究分析，得出其遺傳多樣性高達93%;陳亮［5－7］、陳海軍［8］、沈程文［9］、邵宛芳［10］等的研究結(jié)果表明我國的茶樹種質(zhì)資源也具有很高的遺傳多樣性。筆者利用RAPD標記技術(shù)對連南45份茶樹資源的遺傳多樣性進行研究，旨在為了解連南茶樹種質(zhì)資源的遺傳背景和進一步發(fā)掘、利用和保護該地區(qū)茶樹種質(zhì)資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料分別采自黃連、渦水和大龍，其地理分布點見圖1。黃連25份茶樹資源，海拔為300 m左右;渦水13份茶樹資源，海拔為400～500 m;大龍7份茶樹資源，海拔為620 m左右。各茶樣的基本情況見表1。其茶葉鮮葉采摘于2016年4月 5～9日，采摘標準為1芽2葉，樣品采摘后儲存于－80℃冰箱備用。

圖1 連南茶樹種質(zhì)資源地理分布點ig.1Geographical distribution of tea germplasms from Liannan

表1 茶樹45份試驗材料Table 1Names and codes of 45 tea germplasms

1.2 DNA提取

樣品DNA提取采用的是改良后的CTAB法［11］。DNA樣品加ddH2O稀釋至100 μg·L－1，取溶解后的5 μL，加1 μL上樣緩沖液，采用1.2%瓊脂糖凝膠，在120 V電壓下電泳20 min后，于凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，G:Box EF)下鑒定DNA片段大小并拍照(圖2)，其余DNA樣品放在－20℃冰箱分裝保存。

圖2 基因DNA瓊脂糖電泳檢測圖Fig.2Genomic DNA by agarose gel electrophoresis

1.3 RAPD擴增反應(yīng)

20條隨機引物由上海生物工程公司合成，從中篩選出17條多態(tài)性好、清晰度高的隨機引物(S3、S4、S11、S28、S35、S53、S78、S86、S89、S94、S1010、S1106、S1127、S1130、S1464、S1469、S1510)對45份茶樹葉片DNA樣品進行RAPD擴增反應(yīng)，其編號和序列見表2。RAPD－PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括，模板DNA 1μL，引物0.5 μL，ddH2O 11μL，2(PCR mix(含taq酶，dNTP，Mg2+等)12.5 μL。PCR反應(yīng)在PCR儀(Eppendorf 5331 Mastercy Cler Gradient)上進行。PCR擴增程序: 94℃預(yù)變性3 min，94℃變性50 s，37℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4℃保存。RAPD－PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠在120 V電壓下電泳50 min，電泳結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)(Syngene，G:Box EF)觀察與拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

假定圖譜中每條譜帶代表一個獨立遺傳位點的顯性等位基因，各樣品中每一位點條帶(只記錄強帶)顯現(xiàn)記為“1”，無帶和弱帶記為“0”，重復(fù)的條帶不記入數(shù)據(jù)分析。為了減少人為誤差，是由2人分別進行記錄與核對。根據(jù)“0/1”原始矩陣，使用NTSYS2.10e(Exter Software，NY，USA)軟件計算所有樣品間得到相似系數(shù)，并基于UPGMA構(gòu)建聚類樹圖。計算每個引物的多態(tài)性百分數(shù)(多態(tài)性條帶數(shù)/總條帶數(shù))［12］。利用POPGEN 1.32軟件計算3個茶樹群體的Nei's遺傳多樣性指數(shù)(H)，Shannon信息指數(shù)(I)，總基因多樣度(Ht)，群體內(nèi)基因多樣度(Hs)，群體間基因分化系數(shù)(Gst)，基因流(Nm)，Nm=0.5(1－Gst)/Gst［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD多態(tài)性分析

由上海生物工程公司合成的20個隨機引物中篩選出17個引物對供試樣品進行RAPD擴增，篩選的依據(jù)主要是多態(tài)性程度和擴增的重現(xiàn)性［6］。這17個引物在連南45份茶樹資源中共擴增出124條譜帶，其中119條為多態(tài)性帶，其多態(tài)性程度高達96.0%，平均每個引物產(chǎn)生7.3條帶和7.0條多態(tài)性帶(表2)。每個引物擴增的條帶數(shù)在4條(S1010)到10條(S28、S89)之間，多態(tài)性條帶3～10條。部分引物擴增結(jié)果見圖3。

表2 篩選出引物的RAPD擴增結(jié)果及其多態(tài)性Table 2Amplified products using selected primers and their polymorphism

圖3 引物S1127對45個供試樣品的RAPD擴增電泳結(jié)果Fig.3Amplified results of 45 tea samples using S1127 primer

2.2 基于RAPD－PCR結(jié)果的連南茶樹種質(zhì)資源的多樣性水平分析

對連南渦水(G)、黃連(H)和大龍(D)茶樹群體共45份資源基于RAPD－PCR結(jié)果進行了多樣性水平分析，其具體結(jié)果見表3。3個群體總的Nei' s基因多樣性指數(shù)和Shannon指數(shù)分別為0.491和0.684，高于G(H=0.489，I=0.682)、H(H=0.481，I=0.674)和D(H=0.472，I=0.664)。同時也可得3個群體中渦水茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性比其他2個茶樹群體豐富。

表33 個茶樹群體種質(zhì)資源的多樣性水平Table 3Diversity of 3 tea germplasms

表4顯示45份茶樹種質(zhì)資源總的基因多樣度Ht=0.49，其基因多樣度Hs=0.37，因此可得基因多樣度(Hst=Ht－Hs)為0.12，進而可知3處群體的45份茶樹資源內(nèi)基因多樣度結(jié)果(1－Hst/ Ht=75.51%)，群體內(nèi)的遺傳變異占3個群體總變異的遺傳多樣性的75.51%，證明75%以上遺傳變異來自這個群體內(nèi)。另外，3個茶樹群體間的基因分化系數(shù)Gst=0.24，進一步說明遺傳差異少部分來自群體間。由此可得，3個茶樹群體資源攜有連南茶樹原種相近的基因源。本研究可得基因流Hm =1.57＞1，表明連南茶樹種質(zhì)資源群體之間有一定的基因流。

表43 個茶樹群體種質(zhì)資源的Ht、Hs、Gst及Nm值Table 4Ht，Hs，Gst and Nm of 3 tea germplasms

2.3 基于RAPD－PCR結(jié)果的連南茶樹種質(zhì)資源的聚類分析

根據(jù)RAPD擴增數(shù)據(jù)，使用NTSYS2.10e軟件計算所有供試材料得到相似系數(shù)，并基于UPGMA構(gòu)建聚類樹圖(圖4)。分析結(jié)果可得其遺傳相似系數(shù)0.44～0.89，在45份茶樹資源中黃連8號和黃連9號的親緣關(guān)系最近，其遺傳相似系數(shù)為0.89，說明其在基因組成和核苷酸序列上極為相似。黃連5號與渦水4號的遺傳相似系數(shù)為0.44，說明它們之間的親緣關(guān)系較遠。在遺傳相似系數(shù)為0.66時，分成3個大類群和1個小類群:類群Ⅰ為渦水1～6，8～13號、黃連1，2號、大龍3號;類群Ⅱ為黃連6～25號;類群Ⅲ為大龍1，2，4～7號、黃連3號;類群Ⅳ為小類群，有渦水7號與黃連4，5號。3個群體的供試樣品基本上都可以各自聚成一類，特別是類群Ⅱ，說明連南茶樹種質(zhì)資源具有很強的地域性。此處等級劃分突出了連南縣3個茶樹群體之間的遺傳多樣性以及親緣關(guān)系。

3 討論與結(jié)論

3.1 連南茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性

圖445 個供試樣品的分子系統(tǒng)樹狀圖Fig.4Molecular dendrograms on 45 tea germplasms

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息的總和，是群居生存、發(fā)展和進化的基礎(chǔ)［13］。在參考遺傳多樣性的參數(shù)中，多態(tài)性位點百分率(PPL)、多態(tài)性百分數(shù)(P)、Nei's基因多樣性指數(shù)(H)和Shannon's信息指數(shù)(I)能夠反映的遺傳多樣性程度。沈程文等［9］對安化云臺山茶樹品種種群內(nèi)遺傳多樣性的RAPD分析表明，其P=79.33%;林鄭和等［14］對我國39個茶樹品種的RAPD分析結(jié)果表明，其P=87.2%;鄢東海等［15］對貴州地方茶樹品種資源遺傳多樣性RAPD分析表明，其PPL= 100%、H=0.36與I=0.54。在本研究中，連南茶樹種質(zhì)資源的PPL=100%、P=96.0%、H= 0.491和I=0.684都處于較高的水平，反映出連南茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。

遺傳分化是指遺傳多樣性在群體內(nèi)和群體間的分布。Wright［16］指出遺傳分化系數(shù)Gst在0～0.05之間表明遺傳分化極弱，在0.05～0.15表明Gst遺傳分化中等，在0.15～0.25表明遺傳分化較大。本研究中得出Gst=0.24，說明連南茶樹種質(zhì)資源群體之間存在著較大的遺傳分化?；蛄鱊m是影響植物種群遺傳結(jié)構(gòu)的重要因子，在瀕危植物的保護中有重要的意義［17］，也是影響自然植物遺傳變異度的關(guān)鍵因子之一。Wright［18］表明如果Nm＜1，則是由于遺傳漂變導(dǎo)致群體間明顯的遺傳分化，本研究中基因流Nm=1.57＞1，說明群體間的遺傳分化不是由于遺傳漂變產(chǎn)生的，而不同海拔高度上群居所處生境的各種生態(tài)因子(氣候、溫度、土壤等)的差異性可能是導(dǎo)致品種間遺傳分化的主要原因。衡量群體間遺傳分化程度的另一個重要的指標是遺傳相似系數(shù)。在本研究中，不同海拔的茶樹群體間的遺傳相似系數(shù)差異較大，結(jié)果可得渦水、黃連和大龍茶樹群體間的遺傳相似系數(shù)分別為:0.56～0.85、0.52～0.88和0.65～0.80，由此可得3個茶樹群體間的遺傳相似度呈現(xiàn)出低－高－低的規(guī)律。

3.2 連南茶樹種質(zhì)資源的利用與保護

一個物種的進化潛力和抵御不良環(huán)境的能力取決于種內(nèi)遺傳變異的大?。?9］。高的遺傳多樣性是維持物種長期生存的基礎(chǔ)，一個只有純合子構(gòu)成的物種是很難長期維持穩(wěn)定的，因為它很難適應(yīng)不斷變化的環(huán)境壓力。多態(tài)性百分數(shù)是衡量一個種群遺傳變異水平高低的一個重要指標。一個種群多態(tài)性百分數(shù)高說明這個物種適應(yīng)環(huán)境能力較強，反之，種群多態(tài)性百分數(shù)低，適應(yīng)環(huán)境的能力弱，在長期的進化過程中就有被淘汰的可能性［20］。本研究結(jié)果表明連南茶樹種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富，這說明其物種適應(yīng)環(huán)境的能力較強，但是由于當?shù)氐目可酱迕裰活櫜烧奖悖簧俨铇湮膊慷急豢车袅?，也有不少茶樹被砍掉當柴火或者建筑用，使得茶樹資源受到嚴重破壞。從圖4的聚類分析中可以看出渦水7號、黃連4號和黃連5號聚成一小類，說明它們有著獨特的遺傳關(guān)系。它們的基因與其他樣品比較，差異較大，也很有望成為連南茶樹種質(zhì)資源中的特色資源。但這些資源一旦滅絕就意味著其中一個群居的喪失，將嚴重地影響到連南茶樹種質(zhì)資源整個種群的群居規(guī)模和遺傳多樣性，因此對于這些具有獨特遺傳特性的資源應(yīng)加以重點保護。

本研究初步從DNA水平證實了連南茶樹種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，為進一步發(fā)掘優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源，建立連南茶樹種質(zhì)資源信息庫，培育新良種提供了分子生物學(xué)依據(jù)。從而減少了育種過程中的工作量和盲目性，提高了育種效率

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RAPD Analysis on Genetic Diversity of Tea Germplasms from Liannan County

LI Hua-feng，TENG Jie，MO Lan，ZENG Wen，YAN Chang-yu*，HUANG Ya-hui*
(College of Horticulture South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China)

Random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis was applied to determine the genetic variations among the 45 tea germplasms from Guoshui，Huanglian，and Dalong in Liannan County，Guangdong.Based on their DNA makeups，the classification and genetic relationship of the germplasms were analyzed.From the 124 bands amplified by 17 selected primers，119 polymorphic bands were found，and the total Nei's gene diversity and Shanon indices were determined to be 0.491 and 0.684，respectively.It appeared that the 45 tea germplasms from Liannan could be classified by UPGMA into 3 categories with a significant genetic diversity and regional distinction.

Liannan;tea germplasms;genetic diversity;RAPD

S571.1

A

2096－0220(2016)04－0166－06

2016－10－11初稿;2016－10－29修改稿

廣東省科技計劃項目(2013B020201003、2015B020202007、2016A020208012、2016A020210070);福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(閩教〔2015〕75號);廣東省產(chǎn)業(yè)體系(2016LM1117);桂科AB16380063。

李華鋒(1992－)，男，在讀研究生，研究方向:茶樹種質(zhì)資源與生物技術(shù)研究。E－mail:13422059960@163.com

*通訊作者:晏嫦妤(1981－)，女，助理研究員，博士，研究方向:茶樹資源及利用。E－mail:sally8191@126.com黃亞輝(1969－)，男，研究員，博士，研究方向:茶葉加工及深加工。E－mail:13501513191@163.com