QuEChERS-高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中9種新煙堿類殺蟲劑殘留

粟有志， 李 芳， 齊 鑫， 史秀麗， 王振寶*

(1.伊犁出入境檢驗檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，新疆伊寧 835000； 2.新疆維吾爾自治區(qū)蜂業(yè)發(fā)展中心，新疆烏魯木齊 830054)

新煙堿類殺蟲劑源于植物源農(nóng)藥煙堿，是繼有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類殺蟲劑之后的第四大類殺蟲劑，為一類昆蟲乙酰膽堿受體激動劑[1]。近年來，昆蟲學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)新煙堿類殺蟲劑與蜂群落崩潰綜合癥(Colony Collapse Disorder，CCD)有關(guān)[2]。有研究表明：當(dāng)蜜蜂接觸新煙堿類殺蟲劑時，會迷失回巢方向，蜂王繁殖能力顯著下降，從而導(dǎo)致蜂群的數(shù)量明顯減少[3，4]。因此，建立蜂蜜中新煙堿類殺蟲劑殘留的分析方法不僅可為保證蜂蜜質(zhì)量提供技術(shù)支持，也可為CCD的研究提供新的分析手段。

當(dāng)前新煙堿類殺蟲劑的分析主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6，7]，氣相色譜-質(zhì)譜法[8]，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9，10]。Fidente等人[11]建立了蜂蜜中啶蟲脒，吡蟲啉，噻蟲啉和噻蟲嗪四種新煙堿類殺蟲劑殘留的液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析方法，但該方法選用單極質(zhì)譜，基質(zhì)干擾較大，同時方法檢出限也較高。Kamel[12]利用固相萃取前處理，LC-MS/MS同時分析了蜂蜜中7種新煙堿類農(nóng)藥殘留，但該法前處理較為費時，成本較高。本文選擇高效快捷的QuEChERS技術(shù)[13]前處理樣品，結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)同時分析測定蜂蜜中9種新煙堿類殺蟲劑殘留。該方法操作快速，簡單，精密度和回收率均較好，適用于蜂蜜中新煙堿類殺蟲劑殘留的快速檢測和確證。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1260-6460A型高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，Agilent公司)；MiIIi-Q AdvangtageA10型超純水系統(tǒng)(美國，Millipore公司)；Sigma3-18K型臺式冷凍離心機(Sigma公司)；MS3型渦旋振蕩器(德國，IKA公司)。

啶蟲脒、吡蟲啉、吡呀酮、噻蟲嗪、噻蟲啉、烯啶蟲胺、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度不低于98%，德國Dr Ehrensterfer公司)；呋蟲胺、氯噻啉(100 mg/L，中國農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)所)。準(zhǔn)確稱取上述固體標(biāo)準(zhǔn)品10 mg(精確至0.01 mg)于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于4 ℃冰箱中備用。將上述9種新煙堿類殺蟲劑用純水稀釋并配成10.0 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液，用蜂蜜空白基質(zhì)提取液逐級稀釋，配制成0.5、1、2、5、10、20 ng/mL基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。石墨化碳粉(GCB)、N-丙基乙二胺粉(PSA)、C18粉、酸性Al2O3均購自于Agilent公司。實驗用水為超純水。

1.2 樣品前處理

對于無結(jié)晶的樣品，將其攪拌均勻。結(jié)晶樣品，在密閉情況下，溫度40 ℃水浴，將其全部融化后，攪拌均勻，冷卻至室溫。稱取樣品5 g(精確到0.01 g)于25 mL容量瓶中，加水定容至刻度，上下顛倒容量瓶使蜂蜜充分溶解。吸取定容后的提取液1.0 mL置于2 mL塑料離心管，加入PSA和酸性Al2O3各200 mg，渦旋30 s，8 000 r/min離心2 min，取上清液過0.22 μm尼龍膜，濾液待測。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

1.3.1液相色譜條件色譜柱：Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)；流動相：A相為0.1%甲酸溶液，B相為乙腈。梯度洗脫程序：0.0～2.0 min，10%B；2.0～12.0 min，10%～50%B；12.0～12.5 min，50%～90%B；12.5～13.5 min，90%B；13.51～14.50 min，10%B。流速：0.4 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。

1.3.2質(zhì)譜條件電離模式：電噴霧正離子源模式(ESI+)；多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；毛細(xì)管電壓：4 kV；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min。9種新煙堿類殺蟲劑質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 9種新煙堿類殺蟲劑的質(zhì)譜采集參數(shù)

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制10.0 mg/L的9種新煙堿類殺蟲劑單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，在不接色譜柱的條件下，采用電噴霧正離子模式(ESI+)和負(fù)離子模式(ESI-)分別對9種單標(biāo)溶液進(jìn)行母離子掃描，9種殺蟲劑的[M+H]+峰均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于[M+H]-峰，故實驗選擇正離子模式。利用安捷倫Optimizer軟件對子離子、碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化?；趦?yōu)化結(jié)果建立的多重反應(yīng)監(jiān)測(MRM)質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動相的選擇分別比較了甲醇-0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸銨)、甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液(含10 mmol/L乙酸銨)、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水6種不同流動相條件下，9種殺蟲劑的離子對信號強度。結(jié)果表明：流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時，9種殺蟲劑的離子對信號強度均大于其他流動相組合。故本文選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相。

2.2.2色譜柱的選擇以乙腈-0.1%甲酸水為流動相，通過設(shè)置梯度洗脫程序(1.3.1)，比較9種殺蟲劑在Zorbax SB-Aq柱(100×3.0 mm,1.8 μm)、Zorbax Bonus-RP柱(100×3.0 mm,1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18柱(100×3.0 mm,1.8 μm)三種色譜柱上的分離效果。從圖1可以看出：9種殺蟲劑在Zorbax Eclipse Plus C18柱上的峰形、響應(yīng)信號明顯優(yōu)于其他兩種色譜柱。

圖1 10 ng/mL 9種新煙堿類殺蟲劑混標(biāo)在Zorbax Eclipse Plus C18(a)、Zorbax SB -Aq(b)和Zorbax Bonus-RP(c)色譜柱上的MRM色譜圖Fig.1 The MRM Chromatograms of nine neonicotinoid insecticides (10 ng/mL each) in Zorbax Eclipse Plus C18(a),Zorbax SB-Aq (b) and Zorbax Bonus-RP(c) column1.Pymetrozine;2.Dinotefuran;3.Nitenpyram;4.Thiamethoxam;5.Clothianidin;6.Imidacloprid;7.Imidaclothiz;8.Acetamiprid;9.Thiacloprid.

2.3 提取劑和吸附劑的選擇

新煙堿類殺蟲劑極性較強，本文選擇極性較強的溶劑作為提取劑。實驗考察了水、丙酮、甲醇、乙腈的提取效果。其中以丙酮、乙腈為提取劑時，蜂蜜與提取劑混不相溶，殺蟲劑被蜂蜜中糖分吸附，提取效果較差，9種殺蟲劑的回收率均不足10%；甲醇和水均與蜂蜜混溶，均能將殺蟲劑完全提取，經(jīng)凈化后兩者提取效果相當(dāng)?？紤]分析成本，同時水較為環(huán)保和清潔，故本文最終選擇水為提取劑。

QuEChERS前處理過程中固相吸附劑對分析農(nóng)藥的吸附會導(dǎo)致回收率降低，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。本文分別考察了吸附劑GCB、PSA、C18粉和酸性Al2O3對9種新煙堿類殺蟲劑的吸附效果。以純水配制的10 ng/mL混標(biāo)溶液為分析對象，吸附劑GCB、PSA、C18粉、酸性Al2O3用量均為100 mg時，按照公式：吸附率=(純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)品的峰面積-經(jīng)吸附后純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)品的峰面積)/純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)品的峰面積×100%，計算吸附劑對殺蟲劑的吸附效果，結(jié)果表明：GCB對9種殺蟲劑的吸附率均在50%以上；C18粉對9種殺蟲劑吸附率均在40%以上；PSA和酸性Al2O3對9種農(nóng)藥無吸附作用。故本文選擇PSA和酸性Al2O3共同凈化樣品。以顏色較深的雜花蜜為分析對象，9種殺蟲劑加標(biāo)至100 μg/kg，進(jìn)一步確定吸附劑的用量，比較PSA和酸性Al2O3均為0、50、100、150、200、250、300 mg時樣品的凈化效果。結(jié)果表明：二者的用量均為0～150 mg時，蜂蜜提取液仍然有淺顏色存在，吡呀酮 、呋蟲胺 、烯啶蟲胺的基質(zhì)效應(yīng)較大；二者的用量在200～300 mg時，9種殺蟲劑的基質(zhì)干擾相對減弱，并且基質(zhì)效應(yīng)無明顯差異。故本文最終確定PSA和酸性Al2O3各200 mg作為吸附劑。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評價

參照文獻(xiàn)方法[14]計算基質(zhì)效應(yīng)，即：基質(zhì)效應(yīng)=(1-基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)×100%。結(jié)果表明：在雜花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4種蜂蜜樣品中吡呀酮、噻蟲嗪、吡蟲啉、啶蟲脒基質(zhì)效應(yīng)均大于20%；其他5種殺蟲劑的基質(zhì)效應(yīng)均小于20%。一般認(rèn)為當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)(增強或抑制)超過20%，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對定量檢測具有顯著影響，不可忽略[15]。若選用純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線會使定量結(jié)果產(chǎn)生偏差，因此本文選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 方法的線性關(guān)系與檢出限

配制0.5～20 ng/mL系列空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以峰面積對質(zhì)量濃度做線性回歸。雜花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4種基質(zhì)中9種新煙堿類殺蟲劑在各自的線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(r2>0.9969)；采用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，確定檢出限和定量限，結(jié)果見表2。9種新煙堿類殺蟲劑的檢出限(LOD，以信噪比大于3計)為0.3～0.8 μg/kg；定量限(LOQ，以信噪比大于10計)為1.0～2.5 μg/kg。

2.6 回收率和精密度

選擇空白樣品進(jìn)行添加9種新煙堿類殺蟲劑的回收率試驗，在2.5、10、25 μg/kg三個添加水平，每個水平至少重復(fù)6次。結(jié)果見表2，雜花蜜、油菜蜜、棉花蜜和葵花蜜4種基質(zhì)中9種新煙堿類殺蟲劑的平均回收率為81.7%～106.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.2%～9.4%。該方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性良好。

表2 9種新煙堿類殺蟲劑的檢出限、定量限、加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

2.7 實際樣品的測定

按照本方法對送檢的60余批蜂蜜樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果在油菜蜂蜜樣品中檢出陽性樣品一批，吡蟲啉含量為5.2 μg/kg，但未超過歐盟等發(fā)達(dá)國家的限量要求。吡蟲啉是防止油菜蚜蟲常用殺蟲劑之一，蜂蜜中的吡蟲啉可能來自蜂蜜采集的噴灑有農(nóng)藥的花蜜。代表性樣品的MRM圖如圖2。

圖2 油菜蜜基質(zhì)(a)、空白油菜蜜中加標(biāo)至2.5 μg/kg(b)和含量為5.2 μg/kg吡蟲啉油菜蜜樣品(c)的9種新煙堿類殺蟲劑MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatograms of nine neonicotinoid residues in rape honey matrix(a),blank matrix rape honey spiked with 2.5 μg/kg residues(b) and rape honey containing 5.2 μg/kg imidacloprid(c)1.Pymetrozine;2.Dinotefuran 3.Nitenpyram 4.Thiamethoxam 5.Clothianidin 6.Imidacloprid 7.Imidaclothiz 8.Acetamiprid 9.Thiacloprid.

3 結(jié)論

本文以水為提取劑，樣品采用QuEChERS方法凈化，建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蜂蜜中吡呀酮、吡蟲啉、啶蟲脒、噻蟲嗪、噻蟲啉、烯啶蟲胺、噻蟲胺、呋蟲胺和氯噻啉9種新煙堿類殺蟲劑殘留的分析方法。該方法具有簡便快捷、提取溶劑環(huán)保、準(zhǔn)確度好等特點，適用于蜂蜜中新煙堿類殺蟲劑殘留的快速檢測和確證。