乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR表達(dá)水平與肝損傷程度相關(guān)性

陳衛(wèi)紅 陳艷 曾珍

?

乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR表達(dá)水平與肝損傷程度相關(guān)性

陳衛(wèi)紅 陳艷 曾珍

【摘要】目的 探討乙型肝炎肝硬化（LC）患者血清iNKT細(xì)胞數(shù)量、活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR表達(dá)水平與肝損傷程度的關(guān)系。方法 采用流式細(xì)胞儀檢測LC患者外周血iNKT細(xì)胞頻率及CD38和HLA-DR分子在iNKT細(xì)胞上的表達(dá)水平，分析其與LC患者肝功能Child-Pugh分級、MELD評分及臨床肝功能指標(biāo)相關(guān)性。兩組數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney U檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman rank檢驗。結(jié)果 與健康對照組相比，LC患者組iNKT細(xì)胞頻率為0.106％，顯著降低（P＝0.026），CD4＋iNKT細(xì)胞比例為66.7％，顯著升高（P＜0.01），CD4-iNKT細(xì)胞比例為31.2％，顯著降低（P＜0.01）；CD38和HLA-DR在iNKT、CD4＋iNKT和CD4-iNKT細(xì)胞上表達(dá)水平分別為14.2％、24.9％，18.8％、19.1％，18.4％、36.9％，明顯升高（P＜0.05），隨著Child-Pugh分級有逐漸升高的趨勢，但分級之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CD4＋iNKT細(xì)胞上CD38和HAL-DR分子表達(dá)水平與ALB呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.496，P＝0.019；r＝-0.501，P＝0.018）。結(jié)論 LC患者iNKT細(xì)胞頻率明顯降低；活化水平顯著升高，且與肝功能損害程度相關(guān)，提示iNKT細(xì)胞可能參與LC肝損傷。

【關(guān)鍵詞】乙型肝炎肝硬化；iNKT細(xì)胞；CD4＋iNKT細(xì)胞；CD4-iNKT細(xì)胞

I型NKT細(xì)胞又稱為iNKT（invariant natural killer Tcells）細(xì)胞，在人類中表達(dá)恒定TCRVα24-Jα18，可識別由CD1d分子提呈的一些內(nèi)源性或外源性糖脂類抗原?；罨骾NKT細(xì)胞迅速釋放產(chǎn)生大量細(xì)胞因子，在機體內(nèi)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。近年來研究表明，免疫損傷是乙型肝炎肝硬化發(fā)生發(fā)展的重要因素，尤其是免疫細(xì)胞超活化和清除過強導(dǎo)致機體免疫功能低下，加重肝損傷。iNKT細(xì)胞為固有免疫細(xì)胞，在慢性乙型肝炎感染中發(fā)揮重要的抗病毒作用，并且與肝纖維化和肝損傷密切相關(guān)［1-3］。本試驗通過流式細(xì)胞術(shù)檢測乙型肝炎肝硬化患者外周血中的NKT細(xì)胞數(shù)和功能狀態(tài)，探討其與肝臟損傷程度的關(guān)系。

資料和方法

一、一般資料

解放軍第302醫(yī)院2011年4月至2012年12月收治的乙型肝炎肝硬化住院患者22例，均未接受過抗病毒治療、免疫調(diào)節(jié)治療或激素治療，排除自身免疫性及酒精性肝病和肝占位性病變。同時選取17名健康人作為對照。所有入組對象臨床資料見表1。乙型肝炎肝硬化患者依據(jù)Child-Push肝功能分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級，分為Child A（n＝10），Child B（n＝7），Child C（n＝5）。本研究獲解放軍第302醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有入選患者均簽署知情同意書。

二、研究方法

取入組病例清晨空腹靜脈血4 ML，2000 r/min，離心半徑13.5 cm，離心10 min后，沉淀用一倍的PBS稀釋，混勻，小心疊加至淋巴分離液上層，分離PBMC，取150萬PBMC重懸于100μL的PBS中，按照推薦劑量加入熒光標(biāo)記的單克隆抗體6B11-PE、CD3-APC/Cy7、CD4-PE/Cy7、CD38-FITC和HLADR-PerCp，4℃避光孵育30 min，加入1 MLPBS，振蕩混勻，1500 r/min離心5 min。最后加入250μL1％的多聚甲醛溶液，上機檢測。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.0軟件，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗，兩組比較采用Mann-Whitney U檢驗。相關(guān)性分析采用Spearman rank檢驗。所有分析采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)　果

一、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞頻率及亞群的變化

乙型肝炎肝硬化患者外周血中iNKT細(xì)胞的頻率，選取CD3和6B11雙陽性細(xì)胞為iNKT細(xì)胞，根據(jù)是否表達(dá)CD4，將iNKT細(xì)胞分為CD4＋iNKT和CD4-iNKT細(xì)胞兩個亞群。結(jié)果乙型肝炎肝硬化患者iNKT細(xì)胞頻率顯著低于健康對照組（P＝0.026），Child A、B和C3組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CD4＋iNKT細(xì)胞在所有iNKT細(xì)胞中所占比例顯著升高（P＜0.01），而CD4-iNKT細(xì)胞所占比例顯著下降（P＜0.01）。見圖1。

二、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亞群細(xì)胞表面活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR表達(dá)水平

根據(jù)iNKT細(xì)胞表面CD38和HLA-DR表達(dá)水平不同，評價iNKT細(xì)胞的活化程度。乙型肝炎肝硬化患者iNKT細(xì)胞及亞群表面活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR表達(dá)水平顯著下降，統(tǒng)計分析結(jié)果如圖2所示，乙型肝炎肝硬化患者iNKT細(xì)胞表面CD38和HLA-DR分子的表達(dá)水平顯著低于健康對照（Z值分別為-5.138和-4.130，均P＜0.01）。在CD4＋iNKT細(xì)胞亞群上，乙型肝炎肝硬化患者CD38和HLA-DR分子表達(dá)水平顯著高于健康對照組（Z值分別為-3.186和-4.143，均P＜0.01）。同樣在CD4-iNKT細(xì)胞亞群上，乙型肝炎肝硬化患者CD38和HLA-DR分子表達(dá)水平也顯著高于健康對照組（Z值分別為-5.340和-5.314，均P＜0.01）。

表1　入組對象臨床資料

圖1　乙型肝炎肝硬化患者iNKT細(xì)胞及亞群頻率

圖2　乙型肝炎肝硬化患者iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志物表達(dá)水平

三、乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亞群CD38和HLA-DR表達(dá)水平與肝功能相關(guān)性分析

進(jìn)一步分析乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT及亞群頻率、活化標(biāo)志物表達(dá)水平與ALT、AST、Alb、PTA、TBil及MELD分值之間的相關(guān)性，統(tǒng)計分析結(jié)果見圖3所示，CD38在CD4＋iNKT細(xì)胞上表達(dá)水平與Alb呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.496，P＝0.019）。HLA-DR在CD4＋iNKT細(xì)胞上表達(dá)水平與Alb呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝-0.443，P＝0.039）。CD38和HLADR在iNKT及亞群上表達(dá)水平與PTA、TBil及MELD分值之間無明顯相關(guān)性。iNKT細(xì)胞頻率及亞群比值與ALT、AST、Alb、PTA、TBil及MELD分值之間之間無明顯相關(guān)性。

圖3　iNKT細(xì)胞表面活化標(biāo)志物表達(dá)水平與白蛋白相關(guān)性

討　論

NKT是一類天然存在的介導(dǎo)先天免疫和獲得性免疫的新型免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，是具有NK受體及功能的T細(xì)胞亞群，能特異性識別CD1d遞呈的糖脂類抗原，是肝臟固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一。有學(xué)者認(rèn)為，NKT細(xì)胞以CD3＋CD56＋作為表面標(biāo)志［4］，但近年來研究認(rèn)為CD3＋CD56＋細(xì)胞為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（cytokine induced killer cell，CIK細(xì)胞）主要的效應(yīng)細(xì)胞，CIK細(xì)胞表面也同時表達(dá)T細(xì)胞和NK細(xì)胞的表面標(biāo)志，是一類NKT樣細(xì)胞群［5］。國內(nèi)有些研究將NKT細(xì)胞完全等同于CD3＋CD56＋CIK細(xì)胞［6，7］。目前利用流式細(xì)胞術(shù)鑒定iNKT細(xì)胞的試劑，如負(fù)載α-Galcer的CD1d多聚體、單抗6B11（特異針對Vα24-Jα18 TCR）、Vα24和Vβ11單抗聯(lián)合使用都是鑒定iNKT細(xì)胞的試劑［8-10］。單獨用Vα24特異性單抗能鑒定大部分的iNKT細(xì)胞，但是一些非iNKT細(xì)胞也表達(dá)Vα24［11，12］。該研究使用的是抗iNKT細(xì)胞Vα24Jα18的單抗6B11，6B11和CD3雙陽性淋巴細(xì)胞定義為iNKT細(xì)胞，是目前用流式細(xì)胞術(shù)鑒定人類iNKT細(xì)胞最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)姆椒?。由于iNKT細(xì)胞在外周血中所占比例較低，首先從全血中分離PBMC，利用多色流式細(xì)胞儀能夠提供更多數(shù)據(jù)的長處，同時每個樣本收集PBMC細(xì)胞數(shù)在50萬以上，增加所分析的iNKT細(xì)胞數(shù)量，減少人為誤差。

大量的研究已證實，肝臟內(nèi)iNKT細(xì)胞在HBV感染中的抗病毒作用。有報道顯示，在慢乙型肝炎患者外周血iNKT細(xì)胞頻率降低，并且與抗病毒療效有關(guān)［13，14］。該研究發(fā)現(xiàn)在乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞頻率也是降低的，但并未發(fā)現(xiàn)與外周血中病毒載量及肝功能指標(biāo)有明顯相關(guān)性，可能是乙型肝炎肝硬化是HBV感染的終末期肝病，有些患者病毒載量在檢測的下限。相反，黃曉剛等［12］研究顯示，健康人組與乙型肝炎肝硬化組NKT細(xì)胞無明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，由于該作者是以Vα24單抗鑒定的NKT細(xì)胞，與本研究的iNKT細(xì)胞有所不同。iNKT細(xì)胞頻率與病毒載量的關(guān)系，有待加大樣本量，并且納入不同感染期的慢乙型肝炎患者作為對照，動態(tài)觀察iNKT細(xì)胞頻率和病毒載量的關(guān)系。乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞降低的原因尚不清楚，有可能是免疫調(diào)節(jié)的作用，iNKT細(xì)胞募集到肝臟中發(fā)揮抗病毒作用，也有可能是iNKT活化后標(biāo)志物TCR表達(dá)下調(diào)或凋亡［13，14］，使能檢測到的iNKT細(xì)胞數(shù)量偏低。

DC細(xì)胞產(chǎn)生IL-12和HBV誘導(dǎo)的磷脂抗原均可能促進(jìn)iNKT1細(xì)胞的活化［15］。該研究檢測了iNKT細(xì)胞表明活化標(biāo)志物CD38和HLA-DR分子的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞上CD38和HLA-DR的表達(dá)水平顯著高于健康對照，并且與患者肝功能生化指標(biāo)明顯負(fù)相關(guān)。上述研究提示乙型肝炎肝硬化患外周血iNKT細(xì)胞處于活化狀態(tài)，在疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，與肝損傷有關(guān)，但是iNKT細(xì)胞參與肝損傷的具體作用機制有待深入研究。

本研究檢測了乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞及亞群的頻率和活化水平，并分析了與肝功能的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙型肝炎肝硬化患者外周血iNKT細(xì)胞頻率顯著降低，CD4＋iNKT細(xì)胞所占比例顯著升高，CD4-iNKT細(xì)胞比例顯著減低，活化水平顯著升高且與肝功能損害程度相關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Godfrey DI，Uldrich AP，Baxter AG. NKTcells-an early warning system for HBVinfection. Nat Med，2012，18：1014-1016.

2 Jin Z，Sun R，Wei H，et al. Accelerated liver fibrosis in hepatitis Bvirus transgenic mice：involvement of natural killer Tcells. Hepatology，2011，53：219-229.

3 Zhang Z，Zhang S，Zou Z，et al. Hypercytolytic activity of hepatic natural killer cells correlates with liverinjury in chronic hepatitis Bpatients. hepatology，2011，53：73-85.

4 Sch midt-Wolf IG，Negrin RS，Kiem HP，et al. Use of a SCIDMouse/hu man ly Mpho ma Model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitu Mor cell activity. JExp Med，1991，174：139-149.

5 Alvarnas JC，Linn YC，Hope EG，et al. Expansion of cytotoxic CD3＋CD56＋cells fro Mperipheral blood progenitor cells of patients undergoing autologous hematopoietic cell transplantation. Biol Blood Marrow Transplant，2001，7：216-222

6 馮偉華，蔡蓓，王蘭蘭，等CD3＋CD56＋NKT細(xì)胞及CD3-CD56 ＋NK細(xì)胞在惡性腫瘤患者的臨床意義研究.中國肺癌雜志，2007，10：429-432.

7 邱大鵬，邱雙健，吳志全，等.NKT細(xì)胞在肝癌組織中的分布狀況與肝癌局部免疫的研究.中國臨床醫(yī)學(xué)，2004，11：567-569.

8 Montoya CJ，Pollard D，Martinson J，et al. Characterization of hu man invariant natural killer Tsubsetsin health and disease using a novel invariant natural killer Tcell-clonotypic Monoclonal antibody，6 B11.Im Munology，2007，122：1-14.

9 Chan AC，Neeson P，Leeansyah E，et al. Testing the NKTcell hypothesis in lenalido mide-treated Myelodysplastic syndro me patients. Leukemia，2010，24：592-600.

10 Berzins SP，SMyth MJ，Godfrey DI. Working with NKTcells--pitfalls and practicalities. Curr Opin Im Munol，2005，17：448-454.

11 Gadola SD，Dulphy N，Salio M，et al. Valpha24-Jalpha Q-independent，CD1d-restricted recognition of alpha-galactosylcera mide by hu man CD4（＋）and CD8alphabeta（＋）Tly Mphocytes. JIm Munol 2002，168：5514-5520.

12 黃曉剛，蘇毅，林世德，等.慢性HBV感染者外周血Vα24 NKT細(xì)胞數(shù)量變化及其與肝臟損害程度的關(guān)系.世界華人消化雜志，2010，18：601-605.

13 Jiang X，Zhang M，Lai Q，et al. Restored circulating invariant 段Tcells are associated with viral controlin patients with chronic hepatitis B. PLoSOne，2011，6：e28871.

14 Shi TD，Zhang JM，Wang XF，et al. Effects of antiviral therapy with Telbivudine on peripheral iNKTcells in HBeAg（＋）chronic hepatitis Bpatients. Clin Exp Med，2012，12：105-113.

15 Zeissig S，Murata K，Sweet L，et al. Hepatitis Bvirus-induced lipid alterations contribute to natural killer Tcell-dependent protective im Munity. Nat Med，2012，18：1060-1068.

（本文編輯：錢燕）

Elevated expression of activation marker CD38 and HLA-DRon peripheral blood iNKTcell and their correlation with liver injury in patients with HBV-related liver cirrhosis

CHENWei-hong，CHENYan，ZENGZhen. Departmentof Nutrition and Related Diseases，NationalInstitute for Nutrition and Food Safety，Chinese Center for Disease Control and Prevention，Beijing 100050，China

【Abstract】Objective To investigate potential correlation between frequency of peripheral blood invariant nature killer T（iNKT）cell，expression of activation markers CD38 or HLA-DRand severity of hepatic injury in patients with hepatitis Bvirus（HBV）-related liver cirrhosis（LC）. Methods Frequency of peripheral blood iNKTcells and expression of CD38 or HLA-DRMolecules were detected by flow cyto metry to analyze their correlations with Child-Pugh score，Model of end-stage liver disease（MELD）score and seru Mbiochemical parameters for liver function in HBV-related LCpatients. comparison and correlation analysis between the two groups were performed by Mann-Whitney Utest and Spearman rank test，respectively. Results When compared to healthy controls，LCpatients displayed significantly lower frequency of iNKTcells and proportion of CD4-iNKTcells（0.106％，P＝0.026；31.2％，P＜0.01），w hile higher proportion of CD4＋iNKTcells（66.7％，P＜0.01），higher expression of CD38 and HLA-DRMolecules on iNKT，CD4＋iNKTand CD4-iNKTcells（14.2％，24.9％，18.8％，19.1％，18.4％，36.9％respectively，P＜0.05），respectively. However there was no statistically different expression of CD38 and HLA-DRam ong different Child-Pugh score. Mean w hile，expression of CD38 and HLA-DRon CD4＋iNKTcells was negatively correlated with albu min level（r＝-0.496，P＝0.019；r＝-0.501，P＝0.018）. Conclusion compared to those in healthy controls，peripheral blood iNKTcells in LCpatients manifested significantly lower frequency，but higher cellular activation level w hich was associated with aggravation of hepatic injury.In another word，iNKTcells might play a role in the pathogenesis of liver injury in LCpatients.

【Key words】iNKTcell；CD4＋iNKTcell；CD4-iNKTcell；Liver cirrhosis

收稿日期：（2015-07-15）

Corresponding author：ZENGZhen，Email：zengzhen1970@sina.com

通信作者：曾珍，Email：zengzhen1970@sina.com

基金項目：軍隊“十二五”課題（CWS12J024）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81372248）

作者單位：100050 北京 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所營養(yǎng)與疾病室（陳衛(wèi)紅）；解放軍第三○二醫(yī)院肝臟腫瘤診療與研究中心（陳艷，曾珍）