地中海貧血實驗診斷的研究進展

●陸敏麗

地中海貧血實驗診斷的研究進展

●陸敏麗

貧血是現(xiàn)代人所面臨的主要血液疾病之一，其中地中海貧血癥在我國的發(fā)病幾率較高，目前仍無針對性的治愈模式，但早發(fā)現(xiàn)早治療仍然可以最大限度地保證患者的生命健康。本文即是對地中海貧血癥的實驗診斷技術(shù)進展進行研究，首先介紹了地中海貧血的概念，并對篩查法和基因診斷兩種實驗診斷技術(shù)的進展進行闡述，以期能為相關(guān)工作提供參考。

地中海貧血；實驗診斷；技術(shù)進展

基因是決定生物體生理功能的重要因素，也是一切生物進化的基礎(chǔ)，一旦基因發(fā)生改變就會影響生物體的功能和生存狀態(tài)，其中絕大多數(shù)的基因改變均會給生物體造成負面影響，并且會遺傳給后代。地中海貧血癥是典型的遺傳性疾病之一，也是溶血性貧血癥的一種，給人體帶來的危害性極強，如果未開展及時的診斷和治療，可能會導(dǎo)致患者死亡，而實驗診斷是目前針對地中海貧血癥準確率較高的診斷技術(shù)。

1 地中海貧血癥的概述

地中海貧血癥最早在1925年發(fā)現(xiàn)，由于發(fā)現(xiàn)地點位于地中海地區(qū)，因此而命名，目前其在我國貧血癥中的發(fā)生率也較高，尤其是在廣東、廣西、四川等南方地區(qū)。該疾病是由于人體常染色體存在遺傳性的缺陷，導(dǎo)致細胞內(nèi)珠蛋白鏈無法正常合成，表現(xiàn)為單一或多種珠蛋白缺乏，使得血紅細胞更容易被血漿所溶解，因此地中海貧血癥也屬于溶血性貧血的一種。在健康人群的血紅細胞當中，合成珠蛋白需依靠4條肽鏈，分別是α、β、γ、δ，其分別由細胞內(nèi)相應(yīng)的基因編碼合成，如果編碼基因缺失或突變，就導(dǎo)致了蛋白質(zhì)肽鏈無法合成，珠蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，也就無法發(fā)揮其原有的功能，由此也可將地中海貧血癥分為四個種類，其中發(fā)病率最高的為β型地中海貧血癥[1]。患病者的臨床表現(xiàn)為肝脾腫大、血紅細胞計數(shù)異常下降、黃疸、發(fā)育不良、眼距增大、前額突出等，而且其骨骼造血功能異?；钴S，使得骨髓腔直徑增加，骨質(zhì)厚度相對降低，易引發(fā)長骨骨折性病變，少數(shù)患者還會出現(xiàn)膽囊結(jié)石、下肢潰瘍或心包炎等病變，大多數(shù)患者均可生活到成年，但病情嚴重的新生兒在出生后不久就會死亡，因此及早的診斷能夠為患者贏得更多的治療時間[2]。

2 地中海貧血癥的篩查實驗診斷研究進展

雖然目前對于重癥地中海貧血的治愈仍存在問題，但隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進步，越來越多的患者病情得到了緩解，而這也要歸功于及時準確的實驗診斷技術(shù)。其中篩查實驗技術(shù)不僅操作簡單，而且診斷費用更低，可應(yīng)用于婚檢的男女雙方、孕前和產(chǎn)前檢查的夫婦雙方當中，達到預(yù)防地中海貧血患兒出生的優(yōu)生目的。根據(jù)篩查對象的不同可分為兩種方式，分別是血液常規(guī)檢查、血紅蛋白檢查，具體如下：

2.1 血液常規(guī)實驗診斷進展

血常規(guī)實驗診斷是臨床診斷中較為常用的技術(shù)之一，也是地中海貧血癥篩查中必須開展的一項檢查，其中以血細胞計數(shù)診斷為主，利用計數(shù)儀可對臍帶血中血紅細胞、白細胞等的數(shù)量和形態(tài)進行檢查，其中血紅細胞數(shù)量減少、體積降低（平均體積低于79FL）、血紅蛋白含量下降（平均含量低于27pg）是懷疑為地中海貧血癥的主要依據(jù)[3]。

同時對紅細胞膜滲透脆性的實驗檢查也是診斷依據(jù)之一，其主要是利用不同滲透壓濃度下紅細胞膜對于外界物質(zhì)滲透的抵抗能力進行測試，也就是對血紅細胞發(fā)生溶解的臨界值進行診斷，該臨界值也代表了血紅細胞表面積與體積之間的比例。如血紅細胞膜的滲透脆性較低，則說明細胞膜對于外界滲透壓的抵抗能力較低，容易導(dǎo)致外界物質(zhì)大量進入細胞內(nèi)，使得細胞體積膨脹而發(fā)生破裂，引發(fā)溶血性貧血病變。根據(jù)現(xiàn)代研究證明地中海貧血患者血紅細胞存在不同程度的形變和滲透脆性的減弱情況，因此該實驗診斷具有科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)支持[4]。

2.2 血紅蛋白實驗診斷進展

根據(jù)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，地中海貧血癥患者血液中血紅蛋白存在明顯的不穩(wěn)定性，這主要是由于珠蛋白合成障礙使得血紅蛋白本身結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了性質(zhì)的不穩(wěn)，在實驗診斷當中可利用異丙醇沉淀法，即將實驗溫度控制在37℃下，異丙醇溶液濃度控制在17%，此時將患者血紅蛋白樣本加入其中，如5min后出現(xiàn)沉淀、20min后出現(xiàn)絮狀物質(zhì)，則說明樣本中存在不穩(wěn)定的血紅蛋白，可懷疑該患者具有地中海貧血癥

[5]。

同時還可以根據(jù)包涵體生成量測定法進行診斷，其利用了不穩(wěn)定血紅蛋白和煌焦油藍等試劑反應(yīng)后產(chǎn)生的特殊包涵體為依據(jù)，在溫度為37℃的環(huán)境下進行恒溫孵化，如2h內(nèi)出現(xiàn)了數(shù)量較多的包涵體（以α型地中海貧血癥最多），則說明患者具有地中海貧血癥，該實驗診斷方法操作簡單，但相比于異丙醇沉淀法所需要的檢測時間更長。

還可以利用血紅蛋白電泳診斷技術(shù)，因為人體內(nèi)所有的血紅蛋白的等電點均在7以下，在pH=8.5的鹽環(huán)境當中帶有大量的負電荷，如果此時環(huán)境中具有一個電場的作用力，則血紅蛋白就會以不同的速度相陽極移動，通過其移動速度就可以判斷血紅蛋白的穩(wěn)定性。加之利用醋酸纖維薄膜，可定量地分析不穩(wěn)定血紅蛋白，確定地中海貧血癥的發(fā)病程度。根據(jù)實驗當中所使用的電泳介質(zhì)不同可分為毛細管、Hb瓊脂糖等，該實驗診斷技術(shù)具有操作簡便、靈敏度高、準確率高、樣本消耗量低等諸多特征，在孕婦妊娠期檢測中應(yīng)用范圍較廣，其中Hb瓊脂糖診斷可借助全自動檢測儀完成，使得診斷時間進一步縮減，并且定量定性檢測更加準確，所獲得的電泳圖譜可永久性保存，但在實際應(yīng)用時會出現(xiàn)假陰性的情況，因此如患者異丙醇沉淀呈陽性，則需要結(jié)合醋酸纖維薄膜檢測結(jié)果進行綜合分析。

3 地中海貧血的基因?qū)嶒炘\斷研究進展

地中海貧血癥本身是由于常染色體內(nèi)基因變異或缺失所引發(fā)的病癥，因此利用基因?qū)嶒炘\斷技術(shù)能夠更加準確地判斷患者的病癥。我國最早利用基因?qū)嶒炘\斷地中海貧血癥的技術(shù)為DNA點雜交技術(shù)，后隨著醫(yī)療技術(shù)的進步又發(fā)展出了限制性內(nèi)切酶譜系診斷技術(shù)、寡核苷酸探針雜交、聚合鏈酶反應(yīng)體外擴增、芯片技術(shù)等，其中聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)目前國內(nèi)應(yīng)用范圍更大。

3.1 限制性內(nèi)切酶譜系診斷技術(shù)

根據(jù)生物體DNA的特點，利用限制性內(nèi)切酶可以有效地識別和切割DNA上特定的序列，從而獲得長度已定的片段，但是如果DNA的堿基發(fā)生變異，就會導(dǎo)致其上內(nèi)切位點喪失，使得限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段長度發(fā)生變化，從而確定人體內(nèi)是否存在變異的基因序列。這種實驗診斷技術(shù)的準確性非常高，基本不存在假陰性的情況，但其無法診斷被檢測對象基因突變的具體情況，而且對操作人員技術(shù)的要求較高，即使明確了檢測對象存在基因突變的病癥，但無法確診為地中海貧血癥，因此可將其作為準確輔助診斷數(shù)據(jù)之一[6]。

3.2 探針斑點雜交技術(shù)

該診斷技術(shù)主要依據(jù)DNA序列互補原則，以引物來擴增診斷對象珠蛋白的基因鏈，并合成與突變序列相互互補的DNA序列，利用尼龍膜作為載體，分別就正?；蚝妥儺惢虻碾s交探針進行對比標記，如雜交探針不完全與正?；蚧パa，則可以在一定條件下進行洗脫，可直接利用發(fā)射自顯影技術(shù)對實驗診斷結(jié)果進行觀察。該項診斷技術(shù)的優(yōu)勢在于操作時間更短，且診斷結(jié)果的靈敏性更高，但其對于目標DNA的準確性和純度要求也較高，因為一旦所選擇的突變DNA錯誤，就會導(dǎo)致合成的互補鏈錯誤，實驗結(jié)果無任何意義，目前我國將其主要應(yīng)用在β型地中海貧血癥診斷當中。

3.3 聚合鏈酶反應(yīng)診斷技術(shù)

我國所應(yīng)用的地中海貧血基因診斷技術(shù)中聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)的范圍最大，其可以在體外環(huán)境下開展擴增實驗，從而降低了對DNA片段選擇的難度，根據(jù)所使用的聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)不同可分為多種形式。多重聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)是其中之一，該技術(shù)下包含了四對等位基因的引物，根據(jù)每對等位基因引物突變?yōu)辄c的特異性擴增來判斷患者的患病情況，可利用其對α型SEA缺失、3.7缺失（右缺失）以及4.2缺失（左缺失）進行鑒別。

同時可利用缺口性聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)，在診斷時需設(shè)計2或3對引物，在靠近基因缺失位點的外側(cè)設(shè)計1對引物，內(nèi)側(cè)設(shè)計1對或2對引物。其中在缺失位點內(nèi)側(cè)的引物能夠誘導(dǎo)缺失DNA或正常DNA擴增出相應(yīng)片段，但前提是該診斷DNA內(nèi)純合子不能缺失，此時在缺失位點外側(cè)的1對引物就會使缺失的兩端不斷擴增拉近，從而檢測出診斷DNA中的純合子情況。目前，我國臨床應(yīng)用該項技術(shù)能夠分辨出3種地中海貧血癥[7]。

熒光聚合鏈酶反應(yīng)技術(shù)的診斷敏感性更高，其是常規(guī)技術(shù)的1000倍左右，而且還可以利用不同的熒光素對體外擴增的DNA片段進行標記，從而使診斷者更容易分辨正常的DNA片段、雜合子以及純合子。目前我國高等醫(yī)療機構(gòu)內(nèi)已經(jīng)配備了相關(guān)掃描儀器，主要針對常見的β型地中海貧血癥實驗診斷，其操作更加簡單，且對DNA提取量要求較高低，診斷時間更短，但相對應(yīng)的成本較高[8]。

3.4 反向點雜交診斷技術(shù)

該雜交技術(shù)的基本理念與探針點雜交相似，但反向點雜交技術(shù)是將固定的靶向DNA更換為固定的探針，可通過單一雜交分別診斷DNA上多個變異位點，提升了臨床診斷的效率。在診斷過程中以DNA末端的轉(zhuǎn)移酶為目標，使其轉(zhuǎn)變?yōu)槎嗑畚舶?，并將其固定在制定的生物膜上進行序列擴增雜交，雜交完成后可利用電泳法對基因片段進行確定，包括不同類型的純合子、雜合子等的診斷，目前廣泛地應(yīng)用在突變型β型地中海貧血癥、缺失型α型地中海貧血癥的診斷當中。

3.5 基因芯片雜交診斷技術(shù)

隨著當前國內(nèi)對地中海貧血癥研究的不斷深入，使得該類疾病突變型患者的診斷技術(shù)得到了較大的發(fā)展，其中基因芯片技術(shù)的科技含量較高。該技術(shù)本身也屬于DNA雜交技術(shù)的一種，其以基因序列核苷酸的擴增技術(shù)為實驗基礎(chǔ)，以熒光素標記或引物檢測等為方式，判斷發(fā)生突變基因的情況。其中熒光標記法中不同突變位點所表現(xiàn)出的熒光顏色深淺具有一定差異，因此可根據(jù)其標記后顏色的變化來判斷貧血癥的具體類型，這樣的診斷技術(shù)更加直接、快速、有效。同時，由于基因芯片本身的通量較高，使得多個待測DNA樣本可以在同一張芯片上進行診斷，這樣有利于如我國這種人口數(shù)量較多的國家開展地中海貧血癥的普查工作[9]。但也由于該項診斷的技術(shù)含量較高，基因芯片的成本居高不下，臨床診斷成本是普通人難以接受的，在我國目前也僅適用于地區(qū)人口疾病普查工作當中，限制了該技術(shù)的應(yīng)用范圍。

3.6 Southern印記雜交

該技術(shù)是對檢查的DNA片段雜交情況進行鑒別，即利用靶向DNA作為模板形成雜交DNA片段，并將其以電泳的方式進行分離，再結(jié)合在固相支持物上利用探針進行鑒別的技術(shù)。該技術(shù)與其它DNA雜交技術(shù)一樣，均能夠?qū)z測基因中存在的問題進行鑒別，但該技術(shù)主要應(yīng)用在基因缺失型地中海貧血癥，以α型缺失型病癥為主，目前已經(jīng)成為了該類疾病實驗室診斷中所的“金標準”[10]。

4 結(jié)語

隨著國際上醫(yī)療技術(shù)發(fā)展速度的加快，對于地中海貧血癥的實驗診斷技術(shù)也在不斷提升，血液篩查和基因診斷方式層出不窮。但由于目前我國各地區(qū)貧富差距仍較為明顯，使得各基層醫(yī)院內(nèi)并沒有充足的條件來開展產(chǎn)前檢查工作，使得地中海貧血癥的診斷率下降。而導(dǎo)致這一情況的原因在于檢查費用過高、操作步驟繁瑣等，因此在未來地中海貧血癥實驗診斷技術(shù)發(fā)展時，應(yīng)向著更加快捷、簡便、低廉等方向。

（作者單位：廣西平南縣婦幼保健院檢驗科）

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