解析新發(fā)突發(fā)傳染病產(chǎn)品應(yīng)急審評中性能評估和臨床試驗的基本要求

董勁春

(國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044)

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解析新發(fā)突發(fā)傳染病產(chǎn)品應(yīng)急審評中性能評估和臨床試驗的基本要求

董勁春

(國家食品藥品監(jiān)督管理總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心，北京 100044)

近年來，全球頻發(fā)新發(fā)突發(fā)的傳染病疫情，從2009年的新型甲型H1N1流感病毒暴發(fā)流行，到2013年人感染H7N9禽流感病毒暴發(fā)流行，2014年暴發(fā)的埃博拉病毒出血熱疫情，2015年暴發(fā)的中東呼吸綜合征疫情，2016年暴發(fā)的寨卡病毒疫情，為應(yīng)對不同時期境內(nèi)外暴發(fā)的各種傳染病疫情，做好體外診斷試劑應(yīng)急儲備工作，國家開設(shè)了病原體核酸檢測產(chǎn)品的應(yīng)急審評。作為國家藥監(jiān)總局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心審評員，作者下面就應(yīng)急審評方案中的性能評估和臨床試驗的基本要求進行解析和介紹。

1　性能評估的基本要求

1.1所有病原體均應(yīng)完成的性能評價

1.1.1核酸(RNA)提取/純化性能在進行靶核酸檢測前，應(yīng)有適當(dāng)?shù)腞NA提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應(yīng)結(jié)合檢測試劑的特性，對配合使用的RNA提取試劑/方法的提取效率、提取RNA純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。如果申請的試劑產(chǎn)品無需進行RNA提取/純化，應(yīng)進行詳細的說明并提供詳細的驗證資料，以明確產(chǎn)品不進行RNA的提取/純化也可以達到很好的檢測效果，且應(yīng)與需進行RNA提取/純化的質(zhì)量較好的試劑產(chǎn)品進行充分、詳細的比對試驗。

1.1.2最低檢測限

1.1.2.1最低檢測限的確定將含有病原體目的RNA片段的假病毒顆粒(不同基因型)梯度稀釋于(與適用樣本一致的)適當(dāng)基質(zhì)中，用于進行最低檢測限研究，建議采用質(zhì)?；蚱渌m宜的方法標(biāo)定假病毒原液的滴度。每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限[1-3]。提供詳細的假病毒濃度滴定方法，試驗數(shù)據(jù)。

1.1.2.2最低檢測限的驗證采用假病毒在最低檢測限濃度水平進行驗證。應(yīng)達到90%～95%陽性檢出率。最低檢測限的確定和驗證均應(yīng)考慮不同病原體的基因型特點和具有時間和區(qū)域特征性的不同病毒株，原則上應(yīng)包括可檢出的所有基因型以及每個基因型至少具有代表性的3個毒株分別進行最低檢測限的確定和驗證。以上最低檢測限評價采用的是企業(yè)自行合成的假病毒，應(yīng)詳細提供假病毒不同基因型、不同毒株的制備方法，明確基因序列。

1.1.3病原體RNA陽性檢出能力驗證采用病毒檢測目的基因的體外轉(zhuǎn)錄全長RNA進行檢出能力驗證，針對預(yù)期用途包含的每種病毒型別，均應(yīng)選擇NCBI上已登錄毒株中至少3個不同病毒株的基因序列分別完成此項驗證，每個病毒株至少設(shè)置三個濃度水平的RNA樣品，其中包含最低檢測限附近水平的樣品，建議樣品基質(zhì)與預(yù)期適用樣本類型一致。以試劑盒檢測上述樣品，考察病毒核酸檢測試劑的檢出能力，提交相關(guān)研究資料，包括樣本制備方法、滴度確定方法、驗證試驗結(jié)果等。

1.1.4分析特異性

1.1.4.1交叉反應(yīng)用于交叉反應(yīng)驗證的病原體種類主要考慮以下幾方面可能性：核酸序列具有同源性，易引起相同或相似的臨床癥狀，采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物。建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細菌感染的水平為106cfu/mL或更高，病毒為105pfu/mL或更高。除特別說明外，應(yīng)盡量采用滅活的臨床樣本，或添加了滅活病原體培養(yǎng)物的陰性臨床樣本，樣本基質(zhì)應(yīng)與預(yù)期檢測樣本類型一致。如病原體培養(yǎng)物不能符合如上要求，企業(yè)應(yīng)詳細說明理由。交叉反應(yīng)的病原體一般包括各種RNA病毒，如流行性感冒病毒、HIV、丙型肝炎病毒、腸道病毒等；細菌一般包括傷寒桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腦膜炎奈瑟菌、銅綠假單胞菌等；其他病原體如肺炎支原體、腺病毒、乙型肝炎病毒等；還應(yīng)包括人類基因組DNA。同時還應(yīng)考慮不同病原體的各自特點，選擇交叉反應(yīng)的病原體種類，以充分反映產(chǎn)品檢測的特異性。如H7N9病毒應(yīng)選擇新型H1N1流感病毒、H5N1流感病毒、H3N2流感病毒，埃博拉病毒選擇馬爾堡病毒、登革熱病毒、新型布尼亞病毒、漢坦病毒；寨卡病毒選擇登革病毒(4個型別)、基孔肯雅病毒、黃熱病毒、乙型腦炎病毒等；中東呼吸綜合征冠狀病毒選擇腺病毒(如3型、7型)、冠狀病毒229E、冠狀病毒OC43、冠狀病毒HKU1、冠狀病毒SARS等。申請人應(yīng)提供所有用于交叉反應(yīng)驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別信息和濃度確認等試驗資料。

1.1.4.2干擾試驗根據(jù)所采集樣本類型，進行干擾物質(zhì)驗證。如適用樣本包括全血、血清或血漿，則至少應(yīng)驗證血液中存在的膽紅素、三酰甘油、血紅蛋白。如有鼻咽拭子、痰液等還應(yīng)驗證血液、鼻分泌物或黏液等的干擾，同時還應(yīng)包括患者可能使用的抗病毒藥物等的干擾情況。建議申請人在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度(“最差條件”)條件下進行評價。申請人應(yīng)至少采用兩個濃度水平的病毒(假病毒)稀釋液進行干擾試驗研究，其中應(yīng)包括最低檢測限附近水平。

1.1.5精密度測量精密度的試驗方法可以參考相關(guān)的CLSI-EP文件或國內(nèi)有關(guān)體外診斷產(chǎn)品性能評估的文件進行。企業(yè)應(yīng)對每項精密度指標(biāo)的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)的范圍等。精密度評價中應(yīng)考慮檢測試劑本身以及其他要素的可能造成的精密度波動，包括PCR分析儀、操作者、地點等要素；應(yīng)設(shè)定合理的精密度評價周期，從而對批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間精密度進行綜合評價；用于精密度評價的質(zhì)控品應(yīng)至少包括3個水平(陰性、臨界陽性和中、強陽性)，可采用包含目的RNA的假病毒，基質(zhì)應(yīng)與適用樣本類型一致[3]。

1.2需采用真實病原體完成的性能評估對于埃博拉出血熱這樣的高病死率傳染病，病毒實驗操作要求非常高，歸為生物安全第4級病毒，我國當(dāng)時并沒有一個實驗室可以達到病毒培養(yǎng)及實驗的要求，因此實際上無法完成真實病毒株的性能驗證，所以只能采用企業(yè)自行合成的假病毒進行所有性能的驗證[4]。對于H7N9流感病毒、新型甲型H1N1流感病毒，由于國內(nèi)病例較多，企業(yè)可以獲得真實病毒株，因此需采用病毒株自行進行性能驗證，也可委托其他有資質(zhì)的機構(gòu)代為完成性能評價。而對于中東呼吸綜合征冠狀病毒[5]、寨卡病毒[6]，由于國內(nèi)病例較少，企業(yè)無法獲得病毒株，但是中國疾病預(yù)防控制中心通過病毒分離培養(yǎng)或向境外購買的方式可以獲得病毒株。對于此類病毒，企業(yè)需委托中國疾病預(yù)防控制中心進行產(chǎn)品部分性能的驗證。對于病毒株至少應(yīng)驗證以下性能。

1.2.1最低檢出限的驗證應(yīng)對不同的型別或是境內(nèi)主要流行的型別分別進行最低檢測限的驗證，應(yīng)明確病毒株的確認方法、病毒滴度的確定方法，有條件時應(yīng)對不同地域流行的主要毒株也進行詳細驗證。與國家疾病預(yù)防控制中心公認的檢測方法進行比對時，企業(yè)產(chǎn)品的最低檢測限應(yīng)不低于國家疾病預(yù)防控制中心公認檢測方法的最低檢測限。

1.2.2重復(fù)性采用病毒株進行驗證，應(yīng)對高、低兩個濃度的樣本分別進行驗證，其中一個濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。

1.2.3交叉反應(yīng)對于一些較難獲得的交叉反應(yīng)病原體也可委托國家疾病預(yù)防控制中心進行產(chǎn)品性能的驗證，如基孔肯雅病毒、黃熱病毒、登革病毒等。

2　臨床試驗要求

2.1總樣本量要求應(yīng)急產(chǎn)品都是全新病原體導(dǎo)致疾病的暴發(fā)和流行，因此臨床的總樣本數(shù)均應(yīng)大于1 000例，申請人應(yīng)按照《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求在相應(yīng)的臨床環(huán)境中對試劑的臨床性能進行系統(tǒng)性研究[2]。如檢測試劑適用于不同的樣本類型，原則上不同的樣本類型的病例數(shù)之和大于1 000例即可，但每種樣本類型的病例數(shù)不能過少，病例數(shù)須差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2陽性樣本量要求

2.2.1對于境內(nèi)大范圍流行的疾病，陽性病例數(shù)不得少于300例，如新型甲型H1N1流感病毒。

2.2.2如在境內(nèi)屬于散發(fā)病例，但病例數(shù)相對較多，則至少完成境內(nèi)陽性病例數(shù)的50%以上，如人感染H7N9禽流感病毒。

2.2.3如在境內(nèi)陽性病例數(shù)極少，也應(yīng)至少完成境內(nèi)陽性病例數(shù)的50%以上，同時應(yīng)采用假病毒與臨床樣本混合的方式進行臨床試驗，陽性例數(shù)應(yīng)大于200例，如中東呼吸綜合征病毒。

2.2.4如境內(nèi)沒有陽性病例，應(yīng)采用假病毒與臨床樣本混合的方式進行臨床試驗，陽性例數(shù)應(yīng)大于200例。同時如果有條件，可以采用去疫區(qū)(境外)檢測的方式進行臨床試驗，陽性病例數(shù)也應(yīng)大于200例，如埃博拉病毒。

2.2.5如在境內(nèi)陽性病例數(shù)極少，但滅活的病毒株可以獲得，病毒的致病性也較低，除必須至少完成境內(nèi)陽性病例數(shù)的50%病例外，還應(yīng)采用滅活的病毒株與臨床樣本混合的方式進行臨床試驗，陽性例數(shù)應(yīng)大于200例，如寨卡病毒。

2.3陰性樣本要求對特異性驗證所需的陰性樣本，應(yīng)當(dāng)選擇易引起相同或相似的臨床癥狀、采樣部位正常寄生或易并發(fā)的其他微生物感染的患者。一般建議考慮有呼吸道疾病、發(fā)熱、腹瀉、出血熱等癥狀的患者，所有樣本均應(yīng)為獨立的臨床樣本。臨床數(shù)據(jù)匯總表格中應(yīng)明確臨床診斷結(jié)果，包括感染病原體名稱。以上所有樣本編盲后進行RNA提取和病毒RNA檢測，以交叉四格表的形式總結(jié)檢測結(jié)果，并對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析，如四格表卡方檢驗或kappa檢驗。根據(jù)以上臨床研究結(jié)果，對檢測試劑的臨床性能進行預(yù)評價。

總之，由于每種疫情暴發(fā)都有自己的特點，如不同的流行傳播方式、不同的病原體特點、不同的致病性等。因此應(yīng)根據(jù)不同病原體的特點，分別制定了不同病原體性能評估和臨床試驗的研究及評價方法，以更科學(xué)、更充分的評價核酸檢測試劑的基本性能，使其能夠適于臨床使用，最大程度的減少漏檢率和假陽性率。

[1]體外診斷試劑注冊管理辦法．國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第5號[Z]，2014．

[2]李嚴(yán)亮.體外診斷試劑質(zhì)量體系中企業(yè)參考品的管理研究[J].科技資訊,2013，12:176.

[3]Nucleic Acid Based In Vitro Diagnostic Devices for Detection of Microbial Pathogens.Center for devices and radiological health[Z],2005.

[4]Ebola Z,Rrt-Pcr(taqman?)assay On Abi?7500 Fast Dx LC,JBAIDS.The naval medical research center for the U[Z],2014.

[5]Corman VM,Olschlager S,Wendtner CM.Performance and clinical validation of the RealStar MERS-CoV Kit for detection of Middle East respiratory syndrome coronavirus RNA[J].J Clin Virol,2014,60(2):168-171.

[6]Giovanetti M,Milano T,Alcantara LC．Zika Virus spreading in South America:Evolutionary analysis of emerging neutralizing resistant Phe279Ser strains[J]．Asian Pac J Trop Med,2016,9(5):445-452．

董勁春(1974-)，副主任技師，碩士，主要從事體外診斷產(chǎn)品的技術(shù)審評。

·短篇及病例報道·doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2016.26.049

R373.1

C

1671-8348(2016)26-3741-02

2016-03-18

2016-06-06)