農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因商業(yè)化應(yīng)用及檢測(cè)方法綜述

陳　曉　王朝陽(yáng)　趙　能　周新?！∷涡吕颉№n贊平

（1河南省種子管理站，鄭州450002；2河南科技大學(xué)，洛陽(yáng)471023）

農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因商業(yè)化應(yīng)用及檢測(cè)方法綜述

陳曉1王朝陽(yáng)2趙能2周新保1宋新莉1韓贊平2

（1河南省種子管理站，鄭州450002；2河南科技大學(xué)，洛陽(yáng)471023）

我國(guó)在玉米、水稻等主要農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究方面取得了較大的進(jìn)展。農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因監(jiān)管需要高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)；而我國(guó)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因快速檢測(cè)技術(shù)尚不成熟。本文總結(jié)了當(dāng)前農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)的相關(guān)技術(shù)，為快速高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究提供參考。

農(nóng)作物；轉(zhuǎn)基因；檢測(cè)

1　轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物發(fā)展的基本情況

農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)使農(nóng)作物獲得自身不具有的抗除草劑、抗病蟲(chóng)害、耐鹽堿、富營(yíng)養(yǎng)、抗干旱、高產(chǎn)量、抗重金屬等特性［1］，該技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)取得了飛速的發(fā)展。1988年M.A.W.Hinchee等［2］和D.E.McCabe等［3］率先獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株，標(biāo)志著大豆轉(zhuǎn)基因研究的成功。轉(zhuǎn)基因大豆商業(yè)化自1994年開(kāi)始，截止到2009年，大豆已成為世界上種植面積最大的轉(zhuǎn)基因作物。自C.James［4］首次利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化成功以來(lái)，由于抗蟲(chóng)、抗除草劑玉米較好的性狀表現(xiàn)，在美國(guó)等國(guó)家獲得較大面積的推廣，并為相關(guān)種子企業(yè)帶來(lái)豐厚的利潤(rùn)回報(bào)，迄今玉米已經(jīng)成為最成功的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。全球轉(zhuǎn)基因植物的種植面積由1996年的260萬(wàn)hm2迅速增至2014年的1.815億hm2［5］。目前，全球主要的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物大約有25種，其中大豆種植面積約占全球轉(zhuǎn)基因種植作物面積的47%［6］，其次是玉米，約占32%，緊跟其后的是棉花和油菜，分別占比15%和5%。

2　我國(guó)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因現(xiàn)狀

全球轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化種植已有20余年。我國(guó)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展也很快，到20世紀(jì)90年代中期，我國(guó)已掌握自主研究的轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)棉育種技術(shù)，并擁有相關(guān)專利，打破了國(guó)外在轉(zhuǎn)基因技術(shù)上的壟斷地位。自國(guó)家“十二五”規(guī)劃轉(zhuǎn)基因重大專項(xiàng)實(shí)施以來(lái)，隨著技術(shù)和設(shè)備的不斷更新，我國(guó)科學(xué)家在玉米、水稻等作物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了大量的研究，特別是轉(zhuǎn)基因水稻方面的研究，走在世界前列，在許多方面取得較理想的發(fā)展成果。2009年12月，農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)了2個(gè)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因水稻品種（華恢1號(hào)、Bt汕優(yōu)63）和1個(gè)轉(zhuǎn)植酸酶基因玉米品種的安全證書(shū)。

3　 轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)是轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物有序發(fā)展的保障

隨著轉(zhuǎn)基因作物在全球范圍內(nèi)種植面積的日益擴(kuò)大，人們對(duì)轉(zhuǎn)基因安全性的關(guān)注及擔(dān)憂日益增加［7］。我國(guó)對(duì)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因監(jiān)管嚴(yán)格，行政執(zhí)法部門對(duì)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因的監(jiān)管，應(yīng)以檢測(cè)為技術(shù)依據(jù)來(lái)加大執(zhí)法力度，防范非法轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及食品加工行業(yè)造成危害。另外，有關(guān)轉(zhuǎn)基因知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)中，對(duì)于侵權(quán)的認(rèn)定，也需要通過(guò)檢測(cè)來(lái)確認(rèn)。因此，當(dāng)前形勢(shì)下，加強(qiáng)農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)，是確保我國(guó)農(nóng)業(yè)安全、維護(hù)法律尊嚴(yán)的要求。加快大批量農(nóng)作物種子盲樣轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)研究，已成為轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化推廣進(jìn)程的重要內(nèi)容。

4　農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因成分的檢測(cè)方法

本文綜述的農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因檢測(cè)方法主要有3類：第1類方法在市場(chǎng)監(jiān)管檢測(cè)中最為常用，是以外源基因的特定DNA序列為對(duì)象的檢測(cè)技術(shù)；第2類是蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)；第3類是紅外檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品化學(xué)性質(zhì)及空間構(gòu)型。

4.1基于DNA序列的檢測(cè)方法

4.1.1PCR檢測(cè)方法依據(jù)其檢測(cè)對(duì)象不同分為4類：元件特異性PCR［7］、基因特異性PCR［8］、構(gòu)建特異性PCR［9］、轉(zhuǎn)化體特異性PCR［10］。通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化載體攜帶的啟動(dòng)子、標(biāo)記基因、終止子等特定序列，判斷其是否為轉(zhuǎn)基因作物。該方法特異性較好、效率較高、費(fèi)用低，是目前我國(guó)農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管部門進(jìn)行轉(zhuǎn)基因監(jiān)管檢測(cè)的主要方法，目前已發(fā)布此類檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)逾50項(xiàng)。該方法通過(guò)普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR對(duì)轉(zhuǎn)基因作物通用元件進(jìn)行檢測(cè)，是一種較快速、高效的方法，但缺陷是目前通量較小、周期較長(zhǎng)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

4.1.2基因芯片法基因芯片法又稱為DNA微探針陣列法，其實(shí)質(zhì)就是高度集成化的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)，通過(guò)將外源基因的特異性片斷制成檢測(cè)芯片，與待測(cè)樣本的DNA進(jìn)行雜交，反應(yīng)結(jié)果掃描后，通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件分析，來(lái)判斷出待測(cè)樣品是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品［11］。該方法通量高，但是試驗(yàn)過(guò)程繁瑣，尤其是費(fèi)用很高，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求高，可普及性較低。

4.2基于表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)的檢測(cè)方法以抗體、抗原為基礎(chǔ)的免疫學(xué)蛋白質(zhì)檢測(cè)方法［12］，通過(guò)定性、定量外源基因表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)來(lái)判斷作物是否為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。外源表達(dá)蛋白的檢測(cè)方法有3種：生化反應(yīng)檢測(cè)法；免疫學(xué)檢測(cè)法，主要有Western雜交、ELISA法及免疫沉淀法；外源表達(dá)蛋白生物學(xué)活性的檢測(cè)。外源表達(dá)蛋白的檢測(cè)是轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)及安全性評(píng)價(jià)最有效的方法之一，但此種方法只針對(duì)某一個(gè)轉(zhuǎn)化事件，需要采取逐個(gè)排除的方法來(lái)達(dá)到檢測(cè)目的，繁瑣、成本高，不適于大批量盲樣檢測(cè)。此外還要考慮轉(zhuǎn)基因后基因表達(dá)沉默的問(wèn)題，易出現(xiàn)漏檢。

4.2.1蛋白印跡法該方法利用特異性抗體對(duì)凝膠電泳處理過(guò)的蛋白樣品著色，通過(guò)著色的位置和著色深度，來(lái)獲知特定蛋白質(zhì)在目標(biāo)樣品中的表達(dá)情況，再通過(guò)電泳圖譜分析，可定性及定量目標(biāo)蛋白。

4.2.2ELISA法陽(yáng)性表達(dá)蛋白的抗體與被檢測(cè)樣品中的轉(zhuǎn)基因蛋白結(jié)合，再與酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)二抗結(jié)合，加入底物后通過(guò)酶促反應(yīng)形成有色物質(zhì)，根據(jù)顏色深淺或酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷。

4.2.3試紙條法所謂的試紙條法，就是利用外源表達(dá)蛋白特異結(jié)合的抗體與顯色劑結(jié)合后被固定在試紙條內(nèi)，試紙條浸入含有外源蛋白的植物組織液中，當(dāng)特異抗體與外源蛋白結(jié)合時(shí)，會(huì)呈現(xiàn)出特定的顏色，從而進(jìn)行判斷。目前，一張?jiān)嚰垪l只能檢測(cè)一種外源基因，而農(nóng)作物種子尤其是玉米樣品的盲樣檢測(cè)，可能會(huì)多到20多種轉(zhuǎn)化事件，而且大部分轉(zhuǎn)化事件的試紙條還沒(méi)有研發(fā)成功，因此，此類方法更適合轉(zhuǎn)基因科學(xué)研究中已知基因的陽(yáng)性檢測(cè)，還不適宜于市場(chǎng)監(jiān)管中的大批量盲樣檢測(cè)。

4.2.4蛋白芯片法蛋白芯片法與基因芯片法原理類似，可以定性定量檢測(cè)目標(biāo)蛋白。用不同的探針陣列測(cè)定外源基因的表達(dá)產(chǎn)物，彌補(bǔ)了基因芯片檢測(cè)技術(shù)的不足。該技術(shù)對(duì)設(shè)備和技術(shù)要求較高，不具備普遍性。

4.3利用紅外線檢測(cè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品近紅外光譜法（NIR）是一種利用波長(zhǎng)在780～2526nm范圍內(nèi)的透射光及反射光譜，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行定性和定量分析的新技術(shù)，在食品、煙草、制藥等轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)方面有所應(yīng)用。該技術(shù)綠色、無(wú)損、快速、高效，適合在線分析［13］。

5　討論

隨著轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物商業(yè)化進(jìn)程的不斷推進(jìn)，外源基因的種類不斷增加，越來(lái)越多的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物將會(huì)逐步進(jìn)入市場(chǎng)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，也要求轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行不斷升級(jí)與改進(jìn)。

目前國(guó)內(nèi)外常用的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)主要基于蛋白質(zhì)和核酸水平的檢測(cè)。結(jié)合國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，可以得出：蛋白質(zhì)水平上的檢測(cè)主要適用于轉(zhuǎn)基因初產(chǎn)品檢測(cè)。其次，由于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)通用元件進(jìn)行檢測(cè)是一種快速、高效的轉(zhuǎn)基因檢測(cè)技術(shù)，因此成為我國(guó)目前轉(zhuǎn)基因作物核酸水平檢測(cè)上最為主要的方法，但是還需繼續(xù)提高準(zhǔn)確率、檢測(cè)通量和效率，滿足日益增長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因樣品檢測(cè)需求。因此，為了更有效地應(yīng)對(duì)未來(lái)轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)帶來(lái)的新挑戰(zhàn)，需要不斷探索、創(chuàng)新和綜合應(yīng)用其他相關(guān)檢測(cè)方法，以求更加準(zhǔn)確、高效地做好轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物相關(guān)檢測(cè)工作，保障我國(guó)農(nóng)業(yè)和食品安全。

［1］葉興國(guó)，王艷麗，丁文靜．主要農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因研究現(xiàn)狀和展望．中國(guó)生物工程雜志，2006，26（5）：93-100

［2］Hinchee M A W，Connor-Ward D V，Newell C A，et al．Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated DNA transfer．Nat Biotechnol，1988，6（8）：915-922

［3］McCabe D E，Swain W F，Martinell B J．Stable transformation of soybean（Glycine max）by particle acceleration．Nat Biotechnol，1988，6（8）：923-926

［4］James C．Global status of commercialized Biotech，GM Crops：2009，Isaaa Briefs，2006，25（4）：1-2

［5］郭三堆，王遠(yuǎn)，孫國(guó)清，等．中國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花研發(fā)應(yīng)用二十年．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（17）：3372-3387

［6］王新桐．轉(zhuǎn)基因棉花中新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（NPTII）雙抗體夾心ELISA定量檢測(cè)方法的建立．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014

［7］鄭新利，陳書(shū)田．農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展及存在問(wèn)題．中國(guó)種業(yè)，2009（3）：14-15

［8］Matsuoka T，Kuribara H，Takubo K，et al．Detection of recombinant DNA segments introduced to genetically modified maize（Zea mays）．Agric Food Chem，2002，50（7）：2100-2109

［9］Grohmann L，Brünen-Nieweler C，Nemeth A，et al．Collaborative trial validation studies of real-time PCR-based GMO screening methods for detection of the bar gene and the ctp2-cp4esps construct．Agric Food Chem，2009，57（19）：8913-8920

［10］Shrestha H K，Hwu K K，Wang S J，et al．Simultaneous detection of eight genetically modified maize lines using a combination of event-and construct-specific multiplex-PCR technique．Agric Food Chem，2008，56 （19）：8962-8968

［11］Liu J，Guo J，Zhang H，et al．Development and in-house validation of the event-specific polymerase chain reaction detection methods for genetically modified soybean MON89788 based on the cloned integration flanking sequence．Agric Food Chem，2009，57（22）：10524-10530

［12］李少騫．轉(zhuǎn)基因植物外源基因的檢測(cè)方法及整合位點(diǎn)的研究．長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002

［13］Holst-Jensen A．Testing for genetically modified organisms（GMOs）：Past，present and future perspectives．Biotechnol Adv，2009，27（6）：1071-1082

2016-03-16）

河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目（152102110149）通信作者： 韓贊平