禽流感病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

李天芝，于新友，苗立中 ，沈志強(qiáng)

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

禽流感病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展

李天芝1，于新友，苗立中2，沈志強(qiáng)2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

禽流感是流感病毒引起的一種禽類傳染病，同時(shí)也是一種人和動(dòng)物之間的高度傳染性疾病。本文綜述了禽流感病毒分子生物學(xué)診斷方法研究進(jìn)展，主要包括常規(guī)RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等5種方法，對(duì)禽流感防控有一定的參考價(jià)值。

禽流感病毒；分子生物學(xué)；診斷

禽流感(Avian influenza，AI)是由正黏病毒科流感病毒屬禽流感病毒 (Avian influenza virus，AIV)引起的禽類一種急性、高度接觸性傳染病。主要侵害禽類的呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及消化系統(tǒng)等。根據(jù)AIV致病力不同可分為高致病性病毒(HPAI)、低致病性病毒(PAI)和無(wú)致病性禽流感病毒。高致病性病毒可導(dǎo)致禽類大批死亡，并嚴(yán)重威脅著人類公共衛(wèi)生安全，低致病性病毒低毒力株能明顯降低家禽的生產(chǎn)性能，并在禽類間隱性傳播，經(jīng)抗原漂移或抗原轉(zhuǎn)變形成新毒株或毒力增強(qiáng)。AIV是有包膜的RNA病毒，形態(tài)不規(guī)整，外觀形態(tài)為直徑80~120nm的球狀或長(zhǎng)達(dá)數(shù)千納米的絲狀，其基因組由8條單股負(fù)鏈RNA組成，共編碼10種蛋白質(zhì)。AIV根據(jù)糖蛋白血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同分為16個(gè)HA亞型和10個(gè)NA亞型[1]，理論上可形成160種不同的禽流感病毒亞型，且不同亞型的病毒基因組會(huì)發(fā)生片段重組，造成病毒變異。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將高致病性禽流感列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部將其列為一類動(dòng)物疫病。該病不但嚴(yán)重危害家禽健康，也可感染人，具有重要的公共衛(wèi)生意義。分子生物學(xué)檢測(cè)方法以檢測(cè)快度、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和病毒病的檢測(cè)，并展示良好的應(yīng)用前景。筆者就目前AIV分子生物學(xué)檢測(cè)方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為AIV的防控提供參考。

1 常規(guī)RT-PCR方法

PCR方法是根據(jù)目的片段設(shè)計(jì)引物，借助儀器和DNA聚合酶體外大量擴(kuò)增部分或全部目的片段，是一種快速、簡(jiǎn)便、特異的診斷方法。譚丹等[2]建立一種用于擴(kuò)增H6亞型AIV HA基因的一步法RT-PCR檢測(cè)方法，擴(kuò)增片段為327bp。采用該方法對(duì)H6亞型AIV的尿囊液10倍倍比稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示最低檢出量為102.5EID50/ml。用該方法檢測(cè)其他亞型AIV和雞新城疫病毒(NDV）等病原均為陰性，具有良好的特異性。王云鶴等[3]建立了一步法檢測(cè)H7N9亞型AIV RT-PCR方法，并采取雙盲試驗(yàn)用熒光定量RT-PCR對(duì)該方法進(jìn)行了比對(duì)驗(yàn)證。結(jié)果顯示，用H7亞型特異性引物檢測(cè)H1-H15亞型AIV和NDV等其他禽病病原，除H7亞型流感病毒外，其他樣品均為陰性，用N9亞型特異性引物檢測(cè)N1-N9亞型AIV和其他禽病病原，僅當(dāng)前流行的H7N9亞型AIV樣品有特異性目的條帶，與其他N1-N9亞型AIV和雞新城疫病毒(NDV)等其他禽病病原均無(wú)交叉反應(yīng)。通過(guò)對(duì)H7N9亞型AIV尿囊液進(jìn)行10倍倍比稀釋檢測(cè)，證實(shí)該方法最低檢出量為1.4×102.5EID50.ml-1。喬明明等[4]根據(jù)GenBank中收錄的AIV N9亞型高度保守的基因序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立AIV N9亞型RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行靈敏度、敏感性、特異性試驗(yàn)和臨床樣品檢測(cè)。建立了AIVN9亞型RT-PCR檢測(cè)方法，用該方法檢測(cè)時(shí)，H7N9、H10N9均呈陽(yáng)性，而非 N9亞型的 AIV及NDV等其他禽傳染病病毒均呈陰性，能檢測(cè)到1/32血凝單位的H7N9AIV。羅思思等[5]根據(jù)GenBank中H6亞型 AIV的HA基因、N1亞型 AIV的NA基因和所有亞型AIV的M基因序列，分別設(shè)計(jì)并篩選出3對(duì)特異性引物，優(yōu)化引物之間的濃度，建立了H6N1亞型AIV三重RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，所建立的方法對(duì)H6N1亞型AIV可特異性擴(kuò)增出447(H6亞型AIV)、325(N1亞型 AIV)和 669bp(AIV)目的條帶，對(duì) H6亞型 AIV擴(kuò)增出447bp、669bp目的條帶，對(duì) N1亞型 AIV擴(kuò)增出325bp、669bp目的條帶，對(duì)其他亞型AIV僅擴(kuò)增出669bp目的條帶，對(duì)常見(jiàn)禽病病原體均未擴(kuò)增出任何條帶，該法對(duì)H6N1亞型AIV檢測(cè)下限為0.1pg。

2 套式RT-PCR方法

套式PCR方法是設(shè)計(jì)內(nèi)外2種引物，同時(shí)擴(kuò)增2次，該法能節(jié)省模板，且敏感性較高。郭捷等[6]針對(duì)H1亞型AIV血凝素(HA)基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)特異性引物，并優(yōu)化反應(yīng)條件進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)，結(jié)果顯示，該P(yáng)CR方法能特異性檢測(cè)到H1亞型AIV，其敏感性最低能檢測(cè)到13.2fg/μl的H1亞型AIV RNA模板。本研究建立的巢式PCR方法為H1亞型AIV的早期診斷及有效防制提供了快速、特異且敏感的檢測(cè)方法。劉婷婷等[7]針對(duì)H3亞型AIV HA基因保守序列，設(shè)計(jì)并篩選出2對(duì)特異性引物，建立了H3亞型AIV巢式PCR檢測(cè)方法，特異性試驗(yàn)結(jié)果表明該法只能檢測(cè)到H3亞型AIV，對(duì)其他常見(jiàn)禽病病原體不擴(kuò)增，敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明該巢式PCR對(duì)H3亞型AIV檢測(cè)下限為 1×103拷貝/μl，靈敏度比常規(guī)PCR高100倍。吳嬡瓊等[8]針對(duì)H4亞型AIV HA基因保守序列，設(shè)計(jì)并篩選出2對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了H4亞型AIV套式RT-PCR檢測(cè)方法。特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法可特異性檢測(cè)出H4亞型AIV，對(duì)其他常見(jiàn)禽病病原體無(wú)交叉，敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法對(duì)H4亞型AIV檢測(cè)下限為360fg/μl，用該法對(duì)106份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，臨床樣品檢測(cè)結(jié)果與病毒分離結(jié)果一致。

3 多重RT-PCR方法

多重PCR是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，在同一PCR體系中，加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。郝明飛等[9]根據(jù)GenBank中已登錄的鴨病毒性肝炎病毒(DHV)、AIV和NDV的基因序列，設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鑒別診斷技術(shù)，并對(duì)體系進(jìn)行了優(yōu)化和特異性、敏感性試驗(yàn)。結(jié)果表明，該體系所擴(kuò)增的3種病毒基因片段大小分別為 174bp(DHV)、264bp(AIV)和 362bp(NDV)，且特異性、敏感性良好，能夠分別檢出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。郭捷等[10]據(jù)H1亞型、H3亞型AIV HA基因和M基因的核苷酸序列，分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物，以含有H1亞型AIV和H3亞型AIV的cDNA為模板，對(duì)三重PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行優(yōu)化，驗(yàn)證其特異性和敏感性，并對(duì)臨床樣品進(jìn)行AIV檢測(cè)。結(jié)果顯示，H1和H3亞型AIV混合模板經(jīng)三重PCR擴(kuò)增可獲得3條特異性條帶，其中302bp為H1亞型 HA基因、453bp為 M基因、626bp為 H3亞型HA基因，含有H1或H3亞型AIV的模板均出現(xiàn)兩條特異性條帶，大小分別為302bp和453bp、453 bp和626bp，含有其他亞型AIV的模板僅出現(xiàn)一條特異性條帶(453bp)，而其他禽呼吸道疾病病毒均未擴(kuò)增出任何條帶。優(yōu)化后的三重PCR最低能同時(shí)檢測(cè)出7.00pg的H1亞型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亞型AIV，對(duì)100個(gè)臨床樣品進(jìn)行AIV檢測(cè)，AIV總陽(yáng)性率為36%，其中H1亞型陽(yáng)性率4%、H3亞型陽(yáng)性率9%、其他亞型陽(yáng)性率23%。袁萬(wàn)哲等[11]根據(jù)GenBank登錄的AIV M1基因與NDV M基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增AIV與NDV的RT-PCR引物，建立了AIV與NDV二重RT-PCR檢測(cè)方法。敏感性和特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對(duì)AIV與NDV的最低核酸檢出量分別為38和27pg，可同時(shí)擴(kuò)增出428bp(AIV)與297bp(NDV)的特異性片段，而對(duì)傳染性法氏囊病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)與DHV的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。李海琴等[12]根據(jù)GenBank發(fā)表的 H5、H9亞型AIV HA基因和鴨坦布蘇病毒(DTMUV)的NS5基因序列，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，通過(guò)優(yōu)化擴(kuò)增條件，建立了同時(shí)檢測(cè)H5亞型AIV、H9亞型 AIV和 DTMUV的多重PCR檢測(cè)方法，對(duì)其特異性及敏感性進(jìn)行檢驗(yàn)，并在臨床中進(jìn)行初步應(yīng)用。結(jié)果表明，該多重PCR方法具有良好的特異性和敏感性，可同時(shí)擴(kuò)增出大小分別為 732bp(H9亞型 AIV)、380bp(H5亞型 AIV)、250bp(DTMUV)的特異片段，利用本試驗(yàn)建立的多重PCR對(duì)其他鴨病病原體進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，利用這3對(duì)引物對(duì)H5、H9亞型AIV和DTMUV進(jìn)行敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示最低檢測(cè)極限分別為533pg·μl-1、56pg·μl-1和 6.6ng·μl-1。趙虹等[13]針對(duì)Gen Bank中DTMUV NS2基因、所有亞型AIV的M基因和H9亞型AIV的HA基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，建立了DTMUV和AIV多重PCR檢測(cè)方法。該方法對(duì)混有H9亞型AIV和DTMUV的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了3個(gè)大小與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符的特異性擴(kuò)增條帶，對(duì)其他鴨病病原體進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性。敏感性測(cè)定結(jié)果表明，該方法能檢測(cè)到45pg的DTMUV、7.6pg的H9亞型AIV和76pg的M基因。屈素潔等[14]根據(jù) GenBank中 H5、H7和 H9亞型 AIV 的 HA 基因序列的保守區(qū)域，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)3對(duì)分別針對(duì)AIV H5、H7和H9亞型的特異性引物，預(yù)期特異擴(kuò)增H5AIV片段大小為380bp、H7AIV為501bp、H9AIV為732bp。經(jīng)過(guò)反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測(cè)H5、H7和 H9亞型 AIV的一步法多重RT-PCR方法。該方法特異性強(qiáng)，對(duì)其他亞型AIV和禽呼吸道病原體檢測(cè)結(jié)果為陰性，敏感性高，H5、H7和H9亞型AIV RNA的最低檢出量分別為 10-4、10-4、10-2拷貝/μl。

4 熒光定量RT-PCR方法

熒光定量PCR技術(shù)是指采用熒光探針或SYBR GreenⅠ熒光染料通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，不需要分離PCR產(chǎn)物，即能準(zhǔn)確定量起始模板數(shù)。且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等優(yōu)點(diǎn)。曹軍平等[15]根據(jù)H5亞型AIV HA基因上的保守序列，設(shè)計(jì)合成引物，以H5亞型AIV HA基因重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)方法。結(jié)果表明，本試驗(yàn)建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線循環(huán)閾值 (Ct值)與模板濃度具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為 0.995，靈敏度約為 8拷貝/μl，相當(dāng)于 8個(gè)AIV顆粒，對(duì)NDV和其他禽病病毒無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好、重復(fù)性佳。徐守振等[16]通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增H9亞型AIV的HA基因保守片段，將其克隆到pMD18-T載體，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證正確作為陽(yáng)性質(zhì)粒。以陽(yáng)性質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，建立SYBR Green I熒光定量RT-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該方法靈敏性可達(dá)74.3copies/μl，且特異性好、重復(fù)性佳。郭捷等[17]根據(jù)對(duì)GenBank中H1亞型AIV HA基因序列的分析，設(shè)計(jì)針對(duì)H1亞型AIV的HA基因特異性引物，并以H1亞型AIV的cDNA為模版，構(gòu)建重組陽(yáng)性質(zhì)粒。采用梯度稀釋重組標(biāo)準(zhǔn)品陽(yáng)性質(zhì)粒DNA的方法，建立SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，擴(kuò)增效率和標(biāo)準(zhǔn)誤差分別為100.9%和0.0117，熔解曲線呈單一熔解峰。在35個(gè)Ct值內(nèi)該方法可檢測(cè)到100個(gè)拷貝的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對(duì)于其他亞型AIV和禽呼吸道病原體不能檢出，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，組內(nèi)變異系數(shù)小于1%。劉婷婷等[18]根據(jù)H3和N8亞型AIV的HA和NA基因保守序列，設(shè)計(jì)合成了2對(duì)特異性引物和2條Taq Man探針，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了H3N8亞型AIV一步法實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR。結(jié)果表明：該方法敏感型好，對(duì)H3N8亞型AIV檢測(cè)敏感性達(dá)100個(gè)模板拷貝數(shù)。該方法特異性強(qiáng)，僅對(duì)H3和N8亞型AIV檢測(cè)為陽(yáng)性，應(yīng)用該方法對(duì)96份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。周其偉等[19]針對(duì)H7N9AIV的HA和NA基因分別設(shè)計(jì)特異性引物和Taq Man-LNA探針，建立H7N9AIV特異性實(shí)時(shí)熒光RT-PCR快速檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法對(duì)檢測(cè)H7N9AIV株的靈敏度達(dá)到10PFU/ml。該方法特異性強(qiáng)，與其他亞型流感病毒株及呼吸道病原體無(wú)交叉反應(yīng)。與對(duì)照方法相比，本研究方法的檢測(cè)陽(yáng)性符合率為99.07%，陰性符合率為100%，Kappa值為0.993。劉婷婷等[20]根據(jù)H3和H4亞型AIV HA基因的保守序列，分別設(shè)計(jì)合成特異性引物和用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的Taq Man探針。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了H3和H4亞型AIV雙重實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)方法。結(jié)果顯示，該法特異性好，敏感性達(dá)1000拷貝/μl，組內(nèi)重復(fù)與組間重復(fù)性的平均變異系數(shù)均小于3%，應(yīng)用該法對(duì)96份臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果與病毒分離鑒定結(jié)果一致。羅思思等[21]根據(jù) GenBank中 H6、N1亞型 AIV的 HA、NA基因序列，設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物和2條用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的TaqMan探針。經(jīng)反應(yīng)條件優(yōu)化，本試驗(yàn)建立了檢測(cè)H6N1亞型AIV的二重?zé)晒釸T-PCR方法。該法特異性強(qiáng)，只對(duì)H6亞型和N1亞型AIV進(jìn)行特異性擴(kuò)增，對(duì)其他H亞型AIV、N亞型AIV及NDV、IBV等病原體的檢測(cè)均為陰性，該法敏感性好，對(duì)H6N1亞型AIV的檢測(cè)限為100拷貝/μl。

5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法是一種新興的分子生物學(xué)檢測(cè)方法，已廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌病和病毒病的檢測(cè)，以操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、敏感性好、特異性高等優(yōu)勢(shì)適合基層部門應(yīng)用。蔣菲等[22]建立了H9亞型AIV的反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)，檢測(cè)方法，該方法使用了對(duì)應(yīng)于H9亞型AIV HA基因的8個(gè)不同區(qū)域的6條特異引物，在63℃的等溫條件下反應(yīng)，最低可檢測(cè)到103拷貝的目的基因重組質(zhì)粒片段，較RT-PCR方法敏感10倍。通過(guò)對(duì)15種H亞型AIV、NDV、IBV的檢測(cè)表明，該方法具有良好的特異性。在反應(yīng)體系中使用鈣黃綠素與Mn2+的混合溶液作為熒光指示劑可以用于RT-LAMP結(jié)果判定，并且其判斷結(jié)果與濁度判斷結(jié)果一致。對(duì)109份禽咽喉拭子及泄殖腔拭子臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，RT-LAMP與RTPCR檢出陽(yáng)性樣本數(shù)分別為61份和46份，表明RT-LAMP方法陽(yáng)性檢出率高于RT-PCR。彭宜等[23]根據(jù)GenBank中AIV M基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)所有亞型AIV的通用檢測(cè)引物，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)AIV的RT-LAMP可視化檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的檢測(cè)方法對(duì)AIV總RNA最小檢出限為10fg，靈敏度為RT-PCR的1 000倍，能特異地檢測(cè)出所有不同的HA亞型AIV，對(duì)其他禽呼吸道病原體無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，該法快速，在常規(guī)水浴鍋或金屬恒溫槽中50min就可完成，反應(yīng)結(jié)束后不需開(kāi)蓋即可直接用肉眼根據(jù)反應(yīng)液的顏色變化對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。但曉雅等[24]利用改良RT-LAMP技術(shù)建立一種快速、靈敏的檢測(cè)方法用于H9亞型AIV檢測(cè)。該法根據(jù)H9亞型AIV血凝素(HA)基因保守區(qū)序列中的8個(gè)區(qū)段設(shè)計(jì)6條特異性引物，在恒溫條件下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)，并以瓊脂糖凝膠電泳和目視檢查綠色熒光兩種方法對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行判定。結(jié)果表明，RT-LAMP的最小檢測(cè)限為100fg，靈敏度比PT-PCR高100倍，且與H5亞型、H7亞型AIV，NDV無(wú)交叉反應(yīng)。目視檢查綠色熒光與常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的判定結(jié)果一致。整個(gè)擴(kuò)增檢測(cè)過(guò)程在35min內(nèi)即可完成。利用臨床樣本對(duì)RT-LAMP法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與RTPCR一致。由實(shí)時(shí)濁度分析得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出臨床樣本中的病毒質(zhì)?？截悢?shù)均在2×107~2×104之間。包紅梅等[25]根據(jù)GenBank中登錄的H7亞型AIV HA基因序列，設(shè)計(jì)引物，建立了一種基于RT-LAMP技術(shù)的H7亞型AIV診斷方法。結(jié)果顯示，該方法對(duì)H7AIV RNA的最小檢測(cè)限為0.1pg，靈敏度高于普通一步法RT-PCR 100倍，全部反應(yīng)可在1.5h內(nèi)完成，在反應(yīng)體系中添加Fluorescent Detection Reagent染料后，可通過(guò)肉眼觀察有無(wú)熒光直接判定結(jié)果。靈敏性及特異性試驗(yàn)證明，該方法靈敏度高、特異性好，能夠作為H7亞型AIV的快速診斷方法。石霖等[26]針對(duì)AIV M基因設(shè)計(jì)了4個(gè)不同區(qū)段的特異性引物，并對(duì)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，建立了AIV的RTLAMP方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)AIV H1~H16亞型的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而對(duì)其他禽類病毒的擴(kuò)增均為陰性，具有良好的特異性。對(duì)AIV的最低檢測(cè)限為13.43EID50/ml，靈敏度為普通一步RT-PCR的10倍，擴(kuò)增反應(yīng)可以在恒溫水浴內(nèi)60min內(nèi)完成，在反應(yīng)體系中添加熒光染料后，肉眼即可判定檢測(cè)結(jié)果。該檢測(cè)方法與RT-PCR方法和熒光定量RT-PCR方法對(duì)臨床樣品檢測(cè)的符合率均為81.8%。陳兵等[27]將AIV、NDV和IBDV三種病毒性疾病作為一個(gè)檢測(cè)整體，建立了對(duì)三種疫病同時(shí)進(jìn)行篩選檢測(cè)的多重RT-LAMP檢測(cè)方法，建立了AIV、NDV和IBDV三種病毒實(shí)時(shí)熒光多重 RTLAMP檢測(cè)方法，結(jié)果顯示：該法可對(duì)AIV、NDV和IBDV同時(shí)進(jìn)行篩選檢測(cè)，靈敏度可達(dá)到10個(gè)基因拷貝，與單重LAMP檢測(cè)的靈敏度相當(dāng)，所建立的方法特異性強(qiáng)，與其他病原體無(wú)交叉反應(yīng)。

6 小結(jié)與展望

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，各國(guó)專家、學(xué)者先后建立了多種AIV分子生物學(xué)檢測(cè)方法，

但這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，如常規(guī)PCR方法、套式PCR方法和多重PCR方法，雖然檢測(cè)簡(jiǎn)單、快速、方便但不能精確定量，且敏感性有限，容易漏檢。熒光定量PCR技術(shù)彌補(bǔ)了常規(guī)PCR方法的缺點(diǎn)，但由于所用儀器和試劑價(jià)格昂貴，成本高，且對(duì)操作人員有很高的要求，不利于其在基層獸醫(yī)部門大規(guī)模推廣應(yīng)用。LAMP方法是一種新興的方法，不需要特殊的儀器設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，但敏感性太高，易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，且單獨(dú)使用任何一種方法都很難正確診斷該病，做好將各種方法結(jié)合起來(lái)，綜合判斷，不同單位可根據(jù)自身的情況選擇適合的方法，

相信隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，將會(huì)有更多的新型分子生物學(xué)診斷方法建立，從而為鴨病毒性肝炎的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查和防控提供保障。

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