豬傳染性胸膜肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

文/山東綠都生物科技有限公司　張文通

豬傳染性胸膜肺炎的實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究進(jìn)展

文/山東綠都生物科技有限公司張文通

山東綠都生物科技有限公司 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院 魏 鳳 王金良 沈志強(qiáng)

豬胸膜肺炎是引起呼吸系統(tǒng)疾病的重要傳染病之一，嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。正確診斷豬胸膜肺炎病對(duì)防制本病極為關(guān)鍵。文章就本病病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷3方面展開(kāi)闡述。

豬胸膜肺炎；診斷方法；研究進(jìn)展

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）感染引起的豬的、以急性出血性和慢性的纖維素性胸膜肺炎病變?yōu)樘卣鞯囊环N嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)傳染病［1］。本病廣泛存在于全世界所有的養(yǎng)豬國(guó)家，特別是對(duì)現(xiàn)代集約化養(yǎng)豬危害更大，是影響現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重大疫病之一。本病可依據(jù)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀及剖檢時(shí)病理變化做出初步診斷。但隨著集約化養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬病越來(lái)越復(fù)雜，僅靠傳統(tǒng)診斷方法對(duì)該病診斷已顯得較為困難，進(jìn)一步確診必須依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。自1978年首次分離該病的病原以來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)本病的診斷方法進(jìn)行了大量研究，取得了顯著的成績(jī)。本文就本病實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)展方面，進(jìn)行了如下綜述。

1　細(xì)菌分離鑒定

無(wú)菌采取病死豬的肺臟病變組織塊或急性死亡豬的心血、胸水以及鼻腔血色分泌物，立即接種培養(yǎng)基［2］。37℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察結(jié)果。典型的胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌菌落為黏液型蠟樣菌落。革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陰性，兩極著染略深的小球桿菌。胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌對(duì)葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和果糖發(fā)酵產(chǎn)酸，尿酸酶試驗(yàn)為陽(yáng)性［3］。胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌在金黃色葡萄球菌菌株培養(yǎng)物接種可形成衛(wèi)星現(xiàn)象，即NAD生長(zhǎng)依賴(lài)株。胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌為典型的β溶血。將待檢菌株培養(yǎng)物直接與標(biāo)準(zhǔn)分型血清做活菌凝集檢查，可進(jìn)行菌株血清定型。

細(xì)菌分離鑒定方法優(yōu)點(diǎn)為病原學(xué)診斷最可靠，缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng)。

2　補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complement Fixation Test， CFT）

1971年Nicolet建立了CFT方法，該方法在國(guó)際上被公認(rèn)為檢測(cè)APP的標(biāo)準(zhǔn)方法［4］。

Lombin等于1982年改良了Nicolet的方法。其基本操作程序?yàn)椋撼暡ㄌ幚砑?xì)菌，收集上清作為抗原；待檢血清56℃滅活后加入補(bǔ)體，再加入抗原，反應(yīng)過(guò)夜；第2d加入小牛血清（溶血素）和綿羊紅細(xì)胞（SRBCs）。如果被檢血清中含特異抗體，則抗原抗體復(fù)合物結(jié)合補(bǔ)體而不出現(xiàn)溶血，呈陽(yáng)性反應(yīng)；反之，補(bǔ)體和溶血素與SRBCs結(jié)合，則出現(xiàn)溶血，呈陰性反應(yīng)。

1990年朱士盛等通過(guò)將多種血清型抗原以一定比例混合成全細(xì)胞抗原凍干后應(yīng)用，其抗原穩(wěn)定，改良補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)更適合豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌病的診斷。

CFT的優(yōu)點(diǎn)是敏感性高和特異性強(qiáng)，缺點(diǎn)是操作繁鎖、費(fèi)時(shí)、成本高，且檢測(cè)樣品不易標(biāo)準(zhǔn)化，一般只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

3　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）

自Nicolet等于1981年首次建立檢測(cè)APP的ELISA方法以來(lái)，隨后以不同抗原（如莢膜、脂多糖、外膜蛋白等）包被建立的ELISA方法也得以應(yīng)用。國(guó)外已有商品化的ELISA試劑盒，敏感性和特異性較高。該方法可替代CEF作為APP的分型方法。

4　凝集試驗(yàn) （Agglutination Assay， AA）

凝集試驗(yàn)是一種簡(jiǎn)單快速檢測(cè)APP，并可用于血清型分型的方法。凝集試驗(yàn)包括試管凝集、玻片凝集、協(xié)同凝集等。

Rapp等比較玻片凝集試驗(yàn)與間接熒光抗體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，玻片凝集試驗(yàn)比間接熒光抗體試驗(yàn)的特異性和敏感性高。Mittal等比較了各種凝集試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，協(xié)同凝集試驗(yàn)和2-巰基乙醇試管凝集試驗(yàn)的特異性與敏感性均優(yōu)于玻片凝集試驗(yàn)和試管凝集試驗(yàn)。Habrun等比較2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)與ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)適合于早期感染檢測(cè)，ELISA試驗(yàn)對(duì)老齡豬群的檢測(cè)較2-巰基乙醇微量凝集試驗(yàn)敏感性高。

雖然快速平板凝集試驗(yàn)和協(xié)同凝集試驗(yàn)的敏感性不及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，但它們快速、簡(jiǎn)便，因而也成為實(shí)驗(yàn)室劃分APP的常規(guī)方法。

5　間接血凝試驗(yàn)（Indirect Hemagglutination Test，IHA）

Mittal等建立了IHA用于檢測(cè)APP并對(duì)其進(jìn)行血清分型。Nielson報(bào)道，IHA在血清型6和8之間有交叉反應(yīng)，但能區(qū)分4型和7型。Pat Blackall應(yīng)用本方法發(fā)現(xiàn)，仍不能區(qū)分血清型6和8及血清型9和11。然而，由于此方法操作簡(jiǎn)便，目前已成為主要的檢測(cè)和分型方法。

6　間接熒光抗體試驗(yàn) （Indirect Fluorescence Antibody Test， IFA）

Rosendal等用IFA對(duì)APP進(jìn)行檢測(cè)與血清學(xué)分型。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，除血清型6與非對(duì)應(yīng)的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng)外，血清型4與7之間及血清型4與5之間均發(fā)生交叉反應(yīng)。另外還發(fā)現(xiàn)，IFA試驗(yàn)不能檢測(cè)血清型1?？傊g接熒光抗體試驗(yàn)的敏感性和特異性相對(duì)較低，在實(shí)際中應(yīng)用也較少。

7　乳膠凝集試驗(yàn)（Latex Agglutination Test， LAT）

LAT是一種簡(jiǎn)捷快速的檢測(cè)方法，不僅可用于檢測(cè)，亦可用于血清分型。

Inzana用同型無(wú)莢膜突變菌對(duì)有莢膜菌的抗血清進(jìn)行吸附，然后用處理過(guò)的抗血清致敏乳膠。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法特異性好、敏感性高，且簡(jiǎn)捷、快速，適合在生產(chǎn)中應(yīng)用。

8　免疫擴(kuò)散試驗(yàn)（Immunodiffusion Test，IDT）

這是一種經(jīng)典的免疫學(xué)方法。1979年，Gunnarsson等將這種方法用于APP檢測(cè)，并用于血清分型。該試驗(yàn)有較好的型特異性，是1986 年國(guó)際嗜血桿菌胸膜肺炎研究協(xié)作組推薦的方法之一。

李開(kāi)玉等用酚水抗原檢測(cè)血清，發(fā)現(xiàn)特異性最高，但仍不能區(qū)分血清型1和9，血清型3、6和8。Blackall等用該方法檢測(cè)APP時(shí)，血清型15與7之間也有交叉反應(yīng)。

該方法雖然簡(jiǎn)單，但耗時(shí)較長(zhǎng)，在孔周?chē)某恋砭€(xiàn)有的很難解釋?zhuān)⑶医Y(jié)果可能不明顯。Gunnarson等建議用試管凝集試驗(yàn)代替免疫擴(kuò)散試驗(yàn)來(lái)確定APP的血清型。然而，由于每種特異的抗原-抗體復(fù)合物均可形成明顯的沉淀線(xiàn)，所以免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是研究APP出現(xiàn)附加抗原的有效方法。

9　沉淀試驗(yàn) （Precipitation Test）

Mittal等建立了環(huán)狀沉淀試驗(yàn)，用于檢測(cè)APP及血清分型，結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性較好，而且該方法可以對(duì)凝集試驗(yàn)不能確定血清型的APP進(jìn)行分型。Mittal等建議環(huán)狀沉淀試驗(yàn)可取代試管凝集試驗(yàn)作為常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室確定APP血清型的方法。但Mittal等認(rèn)為環(huán)狀沉淀試驗(yàn)所需試劑較多，應(yīng)用不便。Hommez等用APP的可溶性抗原建立了玻片沉淀試驗(yàn)，這種方法具有與環(huán)狀沉淀試驗(yàn)相同的特異性，但操作上比環(huán)狀沉淀試驗(yàn)簡(jiǎn)單。

10　聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction， PCR）

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于疾病病原地診斷。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了多種用于診斷APP的PCR方法，這些方法的敏感性和特異性均較高，且耗時(shí)短。國(guó)外已研制了一種商品化的APP PCR診斷試劑盒，可以直接用于病料中APP的檢測(cè)。

PCR方法除應(yīng)用于感染動(dòng)物的快速診斷外，還可用于APP的分型。與常規(guī)的血清學(xué)分型方法相比，這種分子生物學(xué)的分型方法快速、簡(jiǎn)便，但也存在交叉反應(yīng)［6］。因此，將分子生物學(xué)的分型方法與常規(guī)血清學(xué)方法相結(jié)合，無(wú)疑會(huì)提高分型的速度和準(zhǔn)確性［7，8］。■

［1］ 白文彬，于康震.動(dòng)物傳染病診斷學(xué)［M］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2002，476～482.

［2］ 杜宗沛，解慧梅，吳植，等.豬放線(xiàn)桿菌性傳染性胸膜肺炎的診斷與預(yù)防［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2010，46（11）：78～79.

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［4］ 余燕，馬金友，王天有，等.豬接觸傳染性胸膜肺炎的診治［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：107～112.

［5］ 陳小玲，楊旭夫，朱士盛，等.豬傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制措施［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001（7）：33～35.

［6］ 呂素芳，郭廣君，唐娜，等.豬胸膜肺炎放線(xiàn)桿菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2011（27）：574～577.

［7］ 徐公義，王海麗，刁有祥，等.豬傳染性胸膜肺炎血清型與溶血毒素型的調(diào)查［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（6）：37～38.

［8］ 華云龍，張應(yīng)國(guó)，鐘南，等.云南豬傳染性胸膜肺炎血清抗體調(diào)查［J］.動(dòng)物檢疫，1992，9（3）：27.

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