禽呼腸孤病毒分子生物學診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進展*

李天芝，于新友，王金良，沈志強

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

禽呼腸孤病毒分子生物學診斷技術(shù)及基因工程疫苗的研究進展*

李天芝1，于新友1，王金良2，沈志強2

(1.山東綠都生物科技有限公司，山東 濱州 256600；2.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州 256600)

本文綜述了禽呼腸孤病毒分子生物學診斷方法，主要包括核酸探針、RT-PCR方法、套式RT-PCR方法、多重RT-PCR方法、熒光定量RT-PCR方法、環(huán)介導等溫擴增方法等6種方法，并就其基因工程疫苗方面的研究進行了著重闡述，對禽呼腸孤病毒病的診斷和防控有一定的參考價值。

禽呼腸孤病毒；分子生物學診斷；基因工程疫苗

禽呼腸孤病是由呼腸孤病毒引起的一類禽類傳染病，其臨床表現(xiàn)因毒株和感染宿主的不同而不同[1]。雞感染禽呼腸孤病毒臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、呼吸道病、腸道病、矮小綜合征和吸收障礙綜合征等[2]。引起鴨發(fā)病的呼腸孤病毒有新型鴨呼腸孤病毒(Noval duck reovirus，NDRV)和番鴨呼腸孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)，鴨感染后主要臨床表現(xiàn)為軟腳、腹瀉等，有的能夠引起高達98%的死亡率，病理變化則主要以肝、脾灰白色局灶性壞死為特征[3]。引起鵝發(fā)病的呼腸孤病毒為鵝呼腸孤病毒(Goose reovirus，GRV)，雛鵝感染后也可表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎，病理變化主要是肝、脾壞死和心內(nèi)膜部分出血等，該病給世界養(yǎng)禽業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[4]。1954年，F(xiàn)ahey和Craloley首次從慢性呼吸道疾病的雞呼吸道內(nèi)分離到禽呼腸孤病毒[5]，此后，英國、美國、意大利等相繼報道了禽呼腸孤病毒感染引起的疾病，20世紀80年代我國出現(xiàn)禽呼腸孤病毒引起的疾病相關(guān)報道。本文就近年來禽呼腸孤病毒的分子生物學診斷方法及基因工程疫苗研究進展進行綜述，以期為禽呼腸孤病的快速診斷和防控提供參考。

1 分子生物學診斷

1.1 核酸探針 核酸探針是定性或定量檢測特異RNA或DNA序列的技術(shù)，它具有操作簡單、結(jié)果易于判定等優(yōu)點，適合在基層推廣使用。Liu等[6]通過地高辛標記建立的cDNA探針技術(shù)，最低可檢測0.78ng的禽呼腸孤病毒RNA，該法不僅能定位感染組織中的禽呼腸孤病毒，還能在臨床癥狀出現(xiàn)前檢測到禽呼腸孤病毒，具有較高的靈敏性。謝芝勛等[7]用地高辛標記的禽呼腸孤病毒S1 cDNA制備探針，建立了檢測禽呼腸孤病毒的方法，結(jié)果顯示，該探針能與禽呼腸孤病毒不同毒株核酸抽提物起特異性雜交反應(yīng)，而與對雞傳染性支氣管炎病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、新城疫病毒、大腸桿菌、正常雞胚尿囊液抽提的核酸及載體PBluescript空質(zhì)粒DNA的雜交反應(yīng)均為陰性，該探針對禽呼腸孤病毒RNA的最低檢出量為0.45ng。

1.2 RT-PCR方法 RT-PCR是以病毒的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄，再以PCR進行核酸擴增來檢測病毒的方法，以其簡便、迅速、靈敏等優(yōu)點在動物疾病診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。Lee等[8]根據(jù)禽呼腸孤病毒S3基因，設(shè)計引物，建立了檢測禽呼腸孤病毒的RT-PCR方法，該法可擴增大小為672bp目的片段，最低能檢測到0.2pg禽呼腸孤病毒RNA模板，通過印跡轉(zhuǎn)移后雜交還可將靈敏度提高到0.04pg?？棕S等[9]參考GenBank上登錄的NDRV S3基因保守序列設(shè)計特異性引物，建立了檢測NDRV的RT-PCR方法，結(jié)果顯示，該方法僅能從NDRV分離毒中擴增到與預期大小相符、長度為298bp的特異性目的片段，檢測靈敏度達到83.4pg病毒RNA，而對番鴨呼腸孤病毒、禽呼腸孤病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、鴨新城疫病毒和禽流感病毒等樣品的擴增結(jié)果均為陰性。葉偉成等[10]根據(jù)經(jīng)典和新型水禽呼腸孤病毒σA基因的保守序列設(shè)計一對PCR引物，建立了番鴨呼腸孤病毒通用RT-PCR檢測方法，可擴增出大小為436bp目的條帶，其最低病毒檢出量為3.6TCID50，對鴨甲肝病毒、鴨瘟病毒、新城疫病毒、坦布蘇病毒、番鴨細小病毒、產(chǎn)蛋下降綜合征病毒和H9N2亞型禽流感病毒擴增結(jié)果均為陰性。于新友等[11]根據(jù)禽呼腸病毒P10基因保守序列設(shè)計了一對引物，建立了檢測禽呼腸病毒的一步法RTPCR方法，并對其特異性、敏感性進行了研究，該一步法RT-PCR對禽呼腸病毒擴增結(jié)果為陽性，對照毒株擴增結(jié)果均為陰性，對禽呼腸病毒檢測的靈敏性為10pg總RNA。

1.3 套式RT-PCR方法 套式RT-PCR是使用兩對PCR引物擴增完整的片段，以第一對引物的擴增產(chǎn)物為模板進行第二輪擴增反應(yīng)，檢測的特異性更好，敏感性也更高。Liu等[12]發(fā)明了一種用套式RT-PCR擴增σC編碼基因，然后進行限制性內(nèi)切酶分析的診斷禽呼腸孤病毒感染的方法，普通RT-PCR可檢測到100-10-1TCID50的病毒核酸，而用Southern雜交法可檢測到 10-1-10-2TCID50的病毒核酸，當使用套式PCR引物時，敏感性可增加大約103～104倍。畢研麗等[13]根據(jù)GenBank中登錄的ARV基因組序列，設(shè)計合成了2對引物，建立了適合禽呼腸孤病毒快速檢測的套式RT-PCR方法，外部引物的擴增片段大小為478bp，內(nèi)部引物的擴增片段大小為247bp。采用該方法對禽呼腸孤病毒株進行了檢測，均能擴增到247bp的條帶，而禽流感病毒(H9亞型)、新城疫病毒、傳染性腔上囊病病毒、減蛋綜合征病毒、禽白血病病毒、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒、馬立克病病毒和鴨瘟病毒的擴增結(jié)果均為陰性。該方法第1次擴增的敏感性是100pg，第2次擴增的敏感性是1fg，第2次比第1次擴增的敏感性高105倍。

1.4 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR是在常規(guī)RT-PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，在同一PCR體系中，加入多對引物，同時檢測2種或多種病原核酸，它具有快速、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，廣泛用于各種臨床疾病的快速診斷。張琳等[14]禽呼腸孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒的基因保守區(qū)設(shè)計了4對特異性引物，建立了針對四種病毒的多重PCR檢測體系，該體系擴增的禽呼腸孤病毒、禽流感病毒、新城疫病毒和雞傳染性支氣管炎病毒四種病毒基因片斷大小分別為199、264、362和459bp，且特異性、敏感性良好，最低可分別檢測1pg、10pg、10pg和10pg的RNA量。孫曉軍等[15]據(jù)鴨甲肝病毒的3D基因序列和NDRV的S3基因序列，分別設(shè)計了1對特異性引物，通過條件優(yōu)化建立了鑒別鴨甲肝病毒和NDRV的復合RT-PCR方法。該方法對鴨甲肝病毒和NDRV的最低檢出量均為100copies，而對番鴨呼腸孤病毒、鴨瘟病毒、鴨坦布蘇病毒和鴨副粘病毒的檢測結(jié)果均為陰性。

1.5 熒光定量RT-PCR方法 實時熒光定量PCR是在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種高度靈敏的核酸定量技術(shù)，它融匯了傳統(tǒng)PCR技術(shù)靈敏、快速、特異的特點以及光譜技術(shù)的高敏感性和高精確定量的優(yōu)點，具有特異性強、靈敏度高、重復性好、定量準確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點。韓宏宇等[16]建立了NDRV基于SYBR GreenⅠ的實時熒光定量RT-PCR檢測方法。該方法最低可檢出15個拷貝的病毒cDNA，其病毒最低檢出量為0.5TCID50。該方法具有良好的特異性，對鴨坦布蘇病毒、A型鴨甲肝病毒、C型鴨甲肝病毒、番鴨呼腸孤病毒、減蛋綜合征病毒、鴨新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌的檢測結(jié)果均為陰性。該方法重復性好，組內(nèi)變異系數(shù)為0.32%～0.91%，組間變異系數(shù)為1.03%～1.51%。李天芝等[17]利用RTPCR技術(shù)擴增出禽呼腸孤病毒 S1基因中 298bp的保守序列，并克隆到pMD18-T載體中作為標準品制作標準曲線，建立了ARV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達4.8×101拷貝，與NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復性。

1.6 環(huán)介導等溫擴增技術(shù) 環(huán)介導等溫擴增(LAMP)方法是日本學者Notomi等發(fā)明的一項恒溫核酸擴增技術(shù)，具有操作簡便、快速、高效、敏感、特異、經(jīng)濟等特點，特別適合在現(xiàn)場和基層部門應(yīng)用。馬利等[18]建立了一種基于熒光顯色的禽呼腸孤病毒LAMP檢測方法。該檢測方法使用針對禽呼腸孤病毒的p10基因8個區(qū)域的6條LAMP引物，能夠在63℃恒溫條件下1h內(nèi)完成反應(yīng)，具有良好的敏感性和特異性，最低能夠檢出102個拷貝的病毒，敏感性比普通PCR高100倍，而對其他病毒檢測結(jié)果為陰性。在熒光顯色中分別應(yīng)用SYBR GreenⅠ和鈣黃綠素作為顯色劑，其結(jié)果與瓊脂糖凝膠電泳一致。于可響等[19]建立適于基層實驗室快速檢測NDRV的一步RT-LAMP方法。基于新型鴨呼腸孤病毒S3基因的6個保守區(qū)域設(shè)計了4條LAMP引物，利用Bst DNA聚合酶在63℃恒溫保持45min即可完成反轉(zhuǎn)錄和擴增反應(yīng)，由此建立了RT-LAMP檢測方法。該方法具有良好的特異性，除NDRV外對其他6種常見鴨病的檢測結(jié)果均為陰性。該方法對病毒RNA的最低檢出量為 0.1pg，是常規(guī) RT-PCR方法的 100倍。臨床應(yīng)用結(jié)果表明，該方法與病毒分離鑒定方法的符合率為98%。

2 基因工程疫苗

2.1 亞單位疫苗 只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機體產(chǎn)生特應(yīng)性免疫應(yīng)答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。凌珊珊等[20]構(gòu)建了禽呼腸孤病毒σC基因的原核表達載體pET32a-σC，成功表達了重組蛋白σC，純化后，進行動物試驗，并用S1133毒株進行攻毒，結(jié)果顯示，σC蛋白刺激機體產(chǎn)生保護性的中和抗體同商品化S1133全病毒滅活苗的效果大致相當。Kuntz-Simon等[21]將桿狀病毒中表達的σC蛋白，隔3周免疫2次，攻毒后發(fā)現(xiàn)可以部分甚至完全防止臨床癥狀的出現(xiàn)，而且免疫后可以減少呼腸孤病毒導致的腱炎和心包炎的產(chǎn)生。徐延偉等[22]根據(jù)已公布的禽呼腸孤病毒S1133毒株σC基因克隆至pPIC9K酵母表達載體當中，成功構(gòu)建了重組酵母菌株pPIC9K-σC/GS115。將畢赤酵母表達的重組σC蛋白用法國佐劑乳化后，免疫3周齡SPF雞，并進行攻毒實驗，結(jié)果顯示，該重組σC蛋白可以阻止ARV在體內(nèi)的復制，且能夠?qū)Ω腥静《具M行清除。吳曉平等[23]將番鴨呼腸孤病毒σC與σB基因的重組大腸桿菌 pET-30a-S3/BL21和 pET-30a-S4ORF2/BL21，分別成功表達出重組蛋白σC與σB，將DRVσB蛋白、DRVσC蛋白、DRVσB+σC蛋白分別免疫雛番鴨，并設(shè)PBS對照組和攻毒對照組，攻毒保護試驗結(jié)果顯示使用原核表達的番鴨呼腸孤病毒外殼蛋白σC與σB制備油乳劑，聯(lián)合免疫可誘導雛番鴨快速產(chǎn)生一定效價的抗體，并提供良好的免疫保護力。

2.2 核酸疫苗 構(gòu)建含有外源抗原基因的重組質(zhì)粒，免疫動物后，表達的特異性抗原蛋白通過與MHC-Ⅰ類或MHC-Ⅱ類抗原分子結(jié)合，刺激機體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA疫苗。謝志勤等[24]構(gòu)建含禽呼腸孤病毒S1133毒株的σ3基因重組質(zhì)粒pcDNA3.1-σ3，免疫7日齡SPF雛雞，同時設(shè)滅活S1133、表達σ3蛋白及生理鹽水對照，二次加強免疫兩周后，用S1133毒株進行攻毒，結(jié)果表明，pcDNA3.1-σ3處理、滅活S1133處理、表達σ3蛋白處理和生理鹽水處理的病毒檢出率分別為7.4%、3.7%、11.1%和29.6%，pcDNA-σ3處理與生理鹽水處理的差異顯著(P＜0.05)，但與滅活S1133處理、表達σ3蛋白處理的差異不顯著(P＞0.05)。蔣慷慨等[25]成功構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒 pCIS3和 pCIS4ORF2，分別以pCIS3、pCIS4ORF2、pCIS3+pCIS4ORF2，100μg的免疫劑量分別肌肉注射免疫2日齡番鴨，對照番鴨則以PBS肌肉注射免疫。首次免疫1周后以相同劑量和途徑加強免疫，加強免疫后1周后用TCID50為10-7.1934/0.1ml病毒液肌肉注射攻毒，攻毒量為：0.2ml/只，結(jié)果顯示，所有免疫組在加強免疫后攻毒前抗體均轉(zhuǎn)陽，攻毒后pCIS3+pCIS4ORF2聯(lián)合免疫組可對免疫番鴨形成100%完全保護，pCIS3免疫組可對免疫番鴨形成 80%保護，pCIS4ORF2免疫組對免疫番鴨形成90%保護。

2.3 活載體疫苗 采用弱毒或無毒病原微生物作為表達載體，對其導入外源抗原基因，制成疫苗后，接種動物，誘導機休產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。萬俊杰等[26]構(gòu)建了能表達禽呼腸孤病毒σB、σC基因的重組減毒沙門氏菌SL7207(pVAX-σB)、SL7207(pVAX-σC)、SL7207(pVAXAB-σB-σC)，并分別以 1.0× 109CFU的劑量每隔2周免疫雛雞3次，設(shè)空質(zhì)粒和PBS組作，結(jié)果顯示，首免后2周SL7207 (pVAX-σC)與空質(zhì)粒SL7207(pVAX1)以及PBS對照組相比產(chǎn)生了較高的血清抗體IgG(P＜0.05)，而SL7207(pVAXAB-σB-σC)與空質(zhì)粒以及PBS對照組相比產(chǎn)生了較高水平的粘膜抗體IgA(P＜0.01)，各疫苗免疫組在二免后第二周均能產(chǎn)生較高的血清抗體IgG和粘膜抗體IgA，SL7207(pVAX-σC)與其它免疫組相比差異顯著(P＜0.01)，到三免后第二周各組抗體水平進一步升高，其中SL7207(pVAX-σC)與SL7207(pVAXAB-σB-σC)組較其它組產(chǎn)生了較高的血清抗體和粘膜抗體水平(P＜0.01)。王存?zhèn)サ葘W者[27]成功構(gòu)建了介導禽呼腸孤病毒。σC基因疫苗的重組減毒沙門氏菌株，制備出禽呼腸孤病毒。σC基因疫苗，應(yīng)用于雛雞，以1.0×l09CFU劑量1次免疫6口齡雛雞，并于2周后進行二免，結(jié)果顯示，免疫2周后，可誘導機體產(chǎn)生ARVσC蛋白的特異血清IgG抗體，差異顯著(P＜0.01)，二免后3周進行攻毒試驗，保護率可達66.7%，重組減毒沙門氏菌株對雛雞具有良好的免疫原性和安全性。

3 小結(jié)與展望

想成功的控制和清除禽呼腸孤病毒的感染，需要采用常規(guī)監(jiān)測和疾病診斷相結(jié)合的方法，雖然禽呼腸孤病毒分子生物學鑒別診斷方法有很多，但各有利弊，常規(guī)RT-PCR方法雖然檢測速度快、特異性強，但不能準確的定量，且敏感性有限。熒光定量 RT-PCR方法雖然克服了常規(guī)RT-PCR的缺陷，但儀器和探針的合成價格昂貴，檢測成本比較高，不適合大面積推廣應(yīng)用。LAMP方法雖然簡單、方便，適合基層進行推廣應(yīng)用，但靈敏度太高，易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此，對于所有的情況和動物，目前仍沒有一種監(jiān)測技術(shù)是100%可靠的，近年來，各國專家、學者對禽呼腸孤病毒基因工程疫苗進行了一定的探索和研究，并取得了一定的成績，但各種新型疫苗都有其自身的缺陷和不足，如亞單位疫苗當前沒有獲得自然形態(tài)的蛋白，抗原獲得困難。核酸疫苗可能存在基因突變或整合到宿主基因組的危險?；钶d體疫苗可以引起炎癥反應(yīng)。相信隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展和新技術(shù)的引入，一些檢測速度快、結(jié)果準確、價廉的檢測方法將會被建立，安全、高效、易于保存和運輸?shù)男滦突蚬こ桃呙绫貙⒀兄瞥晒?，從而最大程度的預防或控制禽呼腸孤病毒病的爆發(fā)流行。

[1]劉紅，朱朝輝.禽呼腸孤病病毒檢測方法的研究進展[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2008，(05)：5-6.

[2]卡爾尼克B W.禽病學[M].高福，蘇敬良，譯.10版.北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，1999：902-908.

[3]胡奇林，陳少鶯，林鋒強，等.番鴨呼腸孤病毒的鑒定[J].病毒學報，2004，20(3)：242-248.

[4]李巨銀，胡新崗，魏寧，等.禽呼腸孤病毒病的研究進展[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2011，(4)：38-39.

[5]殷震，劉景華.動物病毒學第2版[M].北京：科學出版社，1997，544-548.

[6]Liu HJ,Giambrone JJ.In situ detection of reovirus in formalin-fixed，paraffin-embedded chicken tissues using a digoxigenin-labeled cDNA probe[J].Avian Dis，1997，41(2)：447-451.

[7]謝芝勛，廖敏，劉加波，等.禽呼腸孤病毒地高辛探針的制備及應(yīng)用[J].中國預防獸醫(yī)學報，2001，23 (06)：7-10.

[8]LeeLH，Shien JH，Shieh HK.Detection ofavian reovirus RNA and comparison ofa portion of genome segmentS3 bypolymerase chain reaction and restriction enzyme fragmentlength polymorphism[J].Res Vet Sci，1998，65(1)：11-15.

[9]孔豐，袁遠華，肖成謀，等.新型鴨呼腸孤病毒RTPCR檢測方法建立與初步應(yīng)用[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2014，39(01)：24-27.

[10]葉偉成，余斌，劉躍生，等.番鴨呼腸孤病毒通用RT-PCR檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2014，26(06)：1453-1456.

[11]于新友，李天芝，莫玲，等.一步法RT-PCR快速檢測禽呼腸孤病毒方法的建立及應(yīng)用[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2015，9：2-4.

[12]Liu HJ，Chen JH，Liao MH，etal.Identification of the sigma σC-encoded gene ofavian reovirus by nested PCR and restriction endonuclease analysis[J]. J Virol Methods，1999，81(1-2)：83-90.

[13]畢研麗，王金良，郭廣君，等.禽呼腸病毒套式 RTPCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學進展，2011，32 (08)：21-24.

[14]張琳，胡北俠，楊少華，等.禽四種病毒多重 PCR診斷技術(shù)的建立和應(yīng)用[J].家畜生態(tài)學報，2011，32(04)：71-74.

[15]孫曉軍，王曉藝，韓宏宇，等.鴨甲肝病毒與新型呼腸孤病毒復合 RT-PCR檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學報，2015，23(03)：50-54.

[16]韓宏宇，馬秀麗，黃兵，等.用熒光定量RT-PCR方法檢測新型鴨呼腸孤病毒[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2015，27(08)：1331-1336.

[17]李天芝，于新友，王金良，沈志強.禽呼腸孤病毒SYBR GreenⅠ熒光定量 PCR檢測方法的建立[J].家禽科學，2015，10：10-14.

[18]馬利，張琳，張秀美，等.基于熒光顯色的環(huán)介導等溫擴增技術(shù)(LAMP)檢測禽呼腸孤病毒[J].中國獸醫(yī)學報，2013，33(02)：166-170.

[19]于可響，馬秀麗，韓宏宇，等.新型鴨呼腸孤病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J].生物技術(shù)通報，2015，31(08)：71-75.

[20]凌珊珊.禽呼腸孤病毒σC基因的克隆表達及其免疫原性初步研究[D].四川：四川農(nóng)業(yè)大學，2008.

[21]Kuntz-Simon G，Blanchard P，Cherbonnel M，et al. Baculovirus-expressed muscovy duck reovirus sigmaC protein induces serum neutralizing antibodies and protection against challenge[J]. Vaccine，2002，20(25-26)：3113-22.

[22]徐延偉.禽呼腸孤病毒σC蛋白在畢赤酵母中的表達及免疫保護性研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2012.

[23]吳曉平，吳異健，韓典霖，等.原核表達番鴨呼腸孤病毒 σC與σB蛋白對雛番鴨的免疫保護[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2013，46(14)：3040-3045.

[24]謝志勤，謝芝勛，劉加波，等.重組禽呼腸孤病毒S1133σ3基因表達及其免疫原性研究[J].南方農(nóng)業(yè)學報，2012，43(08)：1223-1226.

[25]蔣慷慨.表達禽（番鴨）呼腸孤病毒σC、σB蛋白基因DNA疫苗的構(gòu)建及免疫效力監(jiān)測[D].福建：福建農(nóng)林大學，2007.

[26]萬俊杰.減毒沙門氏菌介導的禽呼腸孤病毒σB/σC基因疫苗的構(gòu)建及其免疫特性研究[D].四川：四川農(nóng)業(yè)大學，2011.

[27]王存?zhèn)?減毒沙門氏菌介導的禽呼腸孤病毒。σC基因疫苗的構(gòu)建及其免疫特性的初步研究[D].四川：四川農(nóng)業(yè)大學，2009.

Q789

：A

：1673-1085（2016）05-0014-05

2016-04-09

山東省現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-13-011-10)；山東省省級引進國外智力項目。作者簡介：于新友(1983-)，男，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動物傳染病診斷及防控研究。