文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友
豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測方法的研究進展
文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友
本文綜述了豬傳染性胃腸炎病毒分子生物學(xué)檢測方法,主要包括核酸探針、普通RT-PCR、套式RT-PCR、多重RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增等6種方法,對豬傳染性胃腸炎病毒病的防控有一定的參考價值。
豬傳染性胃腸炎病毒;分子生物學(xué);檢測方法
傳染性胃腸炎(transmissible gastroenteritis of swine,TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的一種以嘔吐、水樣腹瀉、脫水為主要特征的高度傳染性疾病[1],秋始、冬春為該病高發(fā)期。該病最初發(fā)生在美國,隨后世界各地均有相關(guān)報道,我國20世紀50年代首次報道TGE,1956年臺灣省分離到TGEV。目前我國大部分地區(qū)都有該病發(fā)生流行,各種不同品種和周齡的豬都能感染TGEV并發(fā)病,2周齡受到的危害最為嚴重,一旦感染后,其死亡率可高達100%。5周齡以上的豬感染后雖然死亡率不高,但生長緩慢,飼料利用率低,給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類疾病中必檢的傳染?。?]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,出現(xiàn)了許多新的檢測方法,目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種病毒病和細菌病的檢測,且有很好的發(fā)展前景。本文綜述了TGEV的分子生物學(xué)檢測方法,為TGE的診斷和防控提供參考。
核酸探針檢測方法的原理是核苷酸堿基順序互補,采用標記物標記一段可與被測定的靶序列互補單鏈核酸分子,從而檢測目的核酸序列。Kim等[3]用地高辛標記TGEV核衣殼蛋白cDNA基因序列,制備探針,建立了檢測TGEV的核酸探針方法,對25份臨床樣品進行檢測,陽性率為81%,該法與病毒分離、熒光抗體試驗、掃描電鏡的方法相比,特異性較好,可實現(xiàn)對病毒的快速檢測。史喜菊等[4]分別設(shè)計了豬流感病毒(SIV)、偽狂犬病病毒(PRV)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)和豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)等5種病毒的MLPA探針,將這5種探針混合,建立了可以同時檢測這5種病毒的MLPA擴增方法。該方法特異性試驗表明,針對每種病毒的探針都只能擴增出其對應(yīng)的病毒模板,其余病毒模板的擴增都是陰性結(jié)果,而且5種探針混合物都只能從單個目的病毒中擴增出單一的特異性條帶,而豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的擴增均為陰性。敏感性試驗結(jié)果表明,五重MLPA擴增的最低檢測限可以達到單個病毒核酸3,000~6,000個拷貝。
參照已知的病原相關(guān)目的基因的序列,用軟件設(shè)計引物,采用相關(guān)的試劑和儀器體外大量擴增目的基因,是一種快速的分子生物檢測方法。王黎等[5]成功建立了檢測TGEV的RTPCR方法。以等量同一濃度的同一TGEV陽性病毒液進行重復(fù)性試驗,其3次擴增特異性條帶大小均為590bp。以豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬藍耳病病毒(PRRSV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬輪狀病毒(RV)進行特異性試驗,其結(jié)果顯示,僅TGEV擴增得到預(yù)期特異性目的條帶。以TGEV陽性病毒液提取的cDNA用紫外分析儀確定核酸質(zhì)量濃度為1g/L后,用ddH2O按10倍稀釋,稀釋度為10-1~10-5,其均能擴增出590bp特異性條帶。張作華等[6]試驗根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)N基因序列設(shè)計了1對特異性引物,建立一種TGEV的RTPCR檢測方法,結(jié)果表明:該方法具有高度的特異性和較好的重復(fù)性,可檢測到1×10-3μg/μL的TGEV DNA,并可用于臨床上TGEV感染引起的傳染病病原學(xué)的檢測。
套式PCR方法是設(shè)計內(nèi)、外2對引物,通過2次擴增對樣品檢測,該法能節(jié)省時間和試劑用量,且敏感性較高。沈海娥等[7]根據(jù)豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒的S基因核苷酸序列,設(shè)計合成了2對引物,以豬傳染性胃腸炎病毒和豬呼吸道冠狀病毒細胞培養(yǎng)物為模板,進行PCR特異性片段擴增,豬傳染性胃腸炎病毒擴增片段大小為886bp,豬呼吸道冠狀病毒擴增片段大小為214bp。王玉潔等[8]根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)基因序列,利用Primer5.0程序軟件,設(shè)計并合成了M基因的2對引物,以mRNA為模板,通過RT-PCR、RT-nested PCR方法,成功擴增出長度為1,328bp和1,037bp 的TGEV目的片段,但未擴增出豬傳染性腹瀉病毒(PEDV)片段。在優(yōu)化RTPCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上,建立了快速檢測TGEV的診斷方法。母文華等[9]根據(jù)GenBank中收錄的豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)纖突蛋白S基因的核酸序列設(shè)計了2對引物,以mRNA為模板,通過RT-PCR、RT-nestedPCR方法,在優(yōu)化RT-PCR反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上,建立了快速檢測TGEV的RT-nested PCR診斷方法。試驗結(jié)果成功擴增出長度為886bp和690bp的TGEV目的片段,但未擴增出豬傳染性腹瀉病毒(PEDV)片段。
多重RT-PCR檢測方法是在普通PCR檢測方法基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,可以實現(xiàn)在一個PCR反應(yīng)體系中加入多對引物,通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,能同時檢測多種病原,可節(jié)約成本,節(jié)省時間,目前也廣泛用于臨床各種疾病的快速診斷。郭容利等[10]建立了一種同時檢測PEDV、TGEV和豬A群輪狀病毒(PARV)的三重RTPCR方法,并對其進行特異性與敏感性試驗,該法能檢測約50TCID50的混合病毒,能夠擴增出3條長度為750bp(PEDV),544bp(TGEV),275bp(PARV)特異性片段,而其他病毒無特異性條帶。吳洋等[11]建立了可同時檢測PEDV、TGEV、PRV進行多重RT-PCR擴增,結(jié)果顯示,該方法可以同時擴增PEDV(682bp)、TGEV(480bp)和PRV(297bp)的特異性DNA片段,而對豬瘟病毒和豬偽狂犬病毒的PCR擴增結(jié)果均為陰性,該法對PEDV、TGEV和PRV的檢測得到最低拷貝數(shù)分別為3.3×103拷貝/μL、3.2×103拷貝/μL和2.8×103拷貝/μL。鄭世民等[12]根據(jù)GenBank中TGEV和PEDV 的S蛋白基因序列分別設(shè)計1套特異性引物,建立了TGEV和PEDV的RTPCR快速檢測方法,該法對TGEV和PEDV擴增的目的片段的大小分別為426bp和583bp,經(jīng)優(yōu)化確立最佳反應(yīng)體系:引物、MgCl2和dNTP濃度分別為8μmol/L、9μmol/L和14μmol/ L,退火溫度為54℃。賈銳等[13]根據(jù)GenBank中已收錄的TGEV、PEDV的序列,利用Primer5.0計合成了2對特異性引物,并用這2對引物對TGEV、PEDV cDNA模板首先進行單項PCR條件優(yōu)化,然后采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化多重RT-PCR反應(yīng)條件,結(jié)果同時擴增到2條與試驗設(shè)計相符的492bp(PEDV)和211bp(TGEV)特異性條帶,建立了能夠同時檢測2種病毒混合感染的特異、靈敏的多重PCR檢測方法,可檢測出約11pg的PEDV和13pg的TGEV。徐引弟等[14]建立了可同時檢測PEDV、TGEV、RV的多重RT-PCR方法,該法能同時檢測PEDV、TGEV和RV,但對CSFV、PRRSV、PRV、PCV2、JEV、PPV等無擴增,檢測的抗原稀釋極限為107。
熒光定量PCR檢測方法是在反應(yīng)體系中加入SYBR GreenⅠ熒光染料或用熒光探針標記反應(yīng)產(chǎn)物,然后根據(jù)反應(yīng)儀器收集熒光信號的強弱來確定產(chǎn)物的量,從而實現(xiàn)對起始模板進行準確定量,與常規(guī)RT-PCR相比,不需要電泳檢測就可以檢測樣品,更方便、直觀,可減少產(chǎn)物對環(huán)境的污染。王慧珊等[15]建立了能鑒別檢測豬傳染性胃腸炎病毒和呼吸道冠狀病毒的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR檢測方法,該法能同時檢測這兩種病毒,通過與常規(guī)RT-PCR試驗比較表明,所建立的熒光RT-PCR檢測技術(shù)快速、敏感,檢測限3h以內(nèi),具有很好的特異性和重復(fù)性。董玲娟等[16]建立了TGEV熒光定量RTPCR檢測方法,該法特異性高、重復(fù)性好、敏感性比普通PCR檢測方法高2個數(shù)量級,對質(zhì)粒標準品的線性檢測范圍為1.0×107~1.0×101拷貝/μL。用建立的檢測方法對從陜西楊凌周邊豬場采集的30份樣品進行檢測,檢出1份陽性,與普通PCR檢測方法符合率為100%。王建中等[17]參照GenBank發(fā)表的TGEV S基因序列設(shè)計引物,通過優(yōu)化反應(yīng)條件,建立了檢測TGEV的熒光定量PCR檢測方法,結(jié)果顯示,該法具有良好的特異性,對其它病原的檢測結(jié)果為陰性,其檢測敏感性可達43.07拷貝/μL,是普通RT-PCR檢測方法的100倍。張雪等[18]建立一種基于SYBR GreenⅠ來進行檢測TGEV的實時熒光定量PCR方法,結(jié)果顯示,擴增效率為103%,相鄰擴增曲線之間間距均勻,所有產(chǎn)物的熔解曲線都具有單一整齊的峰,標準曲線具有優(yōu)良的線性關(guān)系,最低可準確檢測63拷貝/μL的核酸模板,重復(fù)性試驗的變異系數(shù)小于3%,然后用建立的PCR對3種常見豬源RNA病毒的檢測結(jié)果均為陰性,對65份臨床樣品的檢出率高于常規(guī)PCR。
環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增檢測方法(LAMP)是一種新興的分子生物學(xué)檢測方法,已廣泛應(yīng)用于多種細菌病和病毒病的檢測,該法具有檢測速度快、敏感性好、特異性高且操作比較簡單等特點,適合基層獸醫(yī)部門的應(yīng)用。高睿澤等[19]建立針對TGEV N基因的RT-LAMP快速檢測方法,并對該檢測方法的特異性與靈敏性進行了評價。該方法在63℃恒溫下作用50min,使TGEV N基因獲得了高效率特異性擴增,與豬流行性腹瀉病毒等其它豬易感病毒無交叉反應(yīng),具有很好的特異性,同時該方法具有極高的靈敏性,可檢測到131.4fg/μL的目標病毒DNA,比普通PCR的靈敏度高3個數(shù)量級。反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ在紫外燈下觀察顏色變化,結(jié)果顯示陽性擴增產(chǎn)物呈現(xiàn)綠色熒光。
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,各國專家、學(xué)者先后建立了多種TGEV分子生物學(xué)檢測方法,但這些方法各有利弊,普通RT-PCR、套式RT-PCR和多重RT-PCR等方法雖然檢測簡單、快速、方便但不能精確定量,且敏感性有限,容易漏檢。熒光定量RTPCR檢測方法彌補了普通PCR方法的缺點,但所用器材和試劑成本高,且對操作人員有更高的要求,不利于其在基層獸醫(yī)部門大規(guī)模推廣應(yīng)用。LAMP方法是一種新興的方法,操作簡便,不需要特殊儀器和設(shè)備,更適合基層應(yīng)用。單獨使用任何一種方法都很難正確診斷豬傳染性胃腸炎病,將各種方法結(jié)合起來,綜合判斷,不同部門應(yīng)該根據(jù)自己的試劑情況選擇相應(yīng)的方法,相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,在不久的將來會有更多新型分子生物學(xué)診斷方法建立,從而為豬傳染性胃腸炎病毒病的診斷、分子流行病學(xué)調(diào)查和防控提供保障。
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山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(SDAIT-06-022-15);山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2013CQ006);山東省自然科學(xué)基金青年基金項目(ZR2014CQ010)。