血府逐瘀湯促血管新生中EphB4/ephrinB2信號通路的作用研究*

許曉玲，蔡 飛，林 凡，王一錚，高 冬△，宋 軍

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350108;2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

血府逐瘀湯促血管新生中EphB4/ephrinB2信號通路的作用研究*

許曉玲1，蔡 飛1，林 凡1，王一錚1，高 冬1△，宋 軍2

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福州 350108;2.中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100700)

目的:探討EphB4/ephrinB2信號通路在血府逐瘀湯促血管新生中的作用。方法:運(yùn)用血清藥理學(xué)方法，以1.25%、2.5%、5%濃度的血府逐瘀湯含藥血清和空白血清干預(yù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC-12)48 h，通過MTT法、Boyden小室遷移法、細(xì)胞黏附法、逆轉(zhuǎn)錄PCR法分別檢測細(xì)胞增殖、遷移、黏附、EphB4和EphrinB2基因表達(dá)的情況。結(jié)果:與同血清含量的對照組比較，5%濃度含藥血清對細(xì)胞的增殖能力起抑制作用。1.25%、2.5%和5%3個濃度含藥血清皆有顯著的促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附作用，并能抑制EphB4的表達(dá)，其中1.25%、2.5%濃度含藥血清抑制EphrinB2的表達(dá)。結(jié)論:血府逐瘀湯通過促內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附發(fā)揮促血管新生作用，且該作用可能與EphB4/EphrinB2通路密切相關(guān)。

血府逐瘀湯;EphB4/ephrinB2;血管新生

血府逐瘀湯為清·王清任所創(chuàng)立的活血化瘀經(jīng)典方劑之一。該方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，活血藥與理氣藥并用，臨床防治心腦血管性疾病療效顯著。前期研究證實(shí)，血府逐瘀湯具有較好的促血管新生作用，但具體作用機(jī)制復(fù)雜，呈多途徑、多靶點(diǎn)特征［1-4］。EphB4/ ephrinB2在調(diào)節(jié)血管生成方面受到越來越多的關(guān)注，其獨(dú)特的雙向信號在血管新生活動包括內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、黏附、分化等過程中起著重要的調(diào)控作用［4-5］。探索血府逐瘀湯如何通過 EphB4/ ephrinB2信號通路發(fā)揮促血管新生調(diào)控作用，有助于為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 藥物制備

血府逐瘀湯組成:當(dāng)歸9 g，生地9 g，桃仁12 g，紅花9 g，枳殼6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g。水煎服，每日2次。煎液過濾、混合后加熱濃縮至含生藥量1.3 g/mL，4℃保存?zhèn)溆?，藥物購自福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂第二門診部。

1.2 動物分組及血清制備

SD6周齡大鼠，體質(zhì)量(150±30)g，雌雄各半，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物房常規(guī)飼養(yǎng)，3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)后按隨機(jī)數(shù)字表法分為藥物組(血府逐瘀湯組)和對照組(生理鹽水組)各20只。藥物組按13 g/k g(相當(dāng)于人臨床用量的10倍)劑量即10 mL/kg灌胃，對照組用等劑量生理鹽水，每天2次，連續(xù)灌胃7 d。于末次灌胃2 h后，采用10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，4000 r/min，離心30 min分離血清，56℃滅活30 min，0.22 μm濾膜過濾除菌后置－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑及設(shè)備

DMEM高糖培養(yǎng)液和胎牛血清(美國 Hyclone公司)，MTT粉劑(美國 Biosharp公司)，Trizol(美國Invitrogen公司)，Oligo D(t)18(大連寶生物)，Taq DNA聚合酶(美國Fermentas公司)，PCR Buffer(美國Fermentas公司)，Goldview核酸染液(上海賽百盛生物有限公司)，瓊脂糖(美國 Sigma公司)，Boyden小室(江蘇省海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)，IX70倒置相差顯微鏡及數(shù)碼攝像裝置(日本尼康公司)，ELX800全自動酶標(biāo)儀 (美國 BioTek公司)，Barnstead純水系統(tǒng)(美國 Thermo公司)，Eppendorf高速臺式離心機(jī)和基因擴(kuò)增儀(德國 Eppendorf公司)，DYY-6C型電泳儀 和DYCP-3K型電泳槽(北京市六一儀器廠)，SHP250型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)，全自動凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.4 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)及藥物誘導(dǎo)處理

內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC-12購于中南大學(xué)湘雅中心實(shí)驗(yàn)室，采用5%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)液，以2.5× 105/mL密度進(jìn)行接種，25 cm2培養(yǎng)瓶接種量為每瓶1mL，于37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)，待5 h細(xì)胞貼壁后棄去培養(yǎng)液隨機(jī)分成藥物組和對照組，藥物組換1.25%、2.5%、5%含藥血清的DMEM培養(yǎng)液，對照組分別換含等量對照血清的 DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h備用。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)在96孔板內(nèi)的HUVEC-12共計(jì)6組經(jīng)藥物和生理鹽水分別干預(yù)48 h后，每孔加入20 μL，5 mg/mL的MTT，孵育4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 200 μL，振蕩15 min后于酶標(biāo)儀檢測530 nm波長的OD值，參比波長630 nm。

1.6 遷移實(shí)驗(yàn)

收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清液于Boyden小室的下室，室間置以8 μm的聚碳酸酯膜，上室加入對應(yīng)組別的細(xì)胞2×104，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，聚碳酸酯膜經(jīng)棉簽輕輕刮去上室面的細(xì)胞，中性甲醛固定下室面的細(xì)胞，蘇木素常規(guī)染色，高倍視野(200×)隨機(jī)計(jì)數(shù)下室面12個視野下的細(xì)胞個數(shù)。

1.7 黏附實(shí)驗(yàn)

收集各組細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以9×103/孔細(xì)胞數(shù)種入96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)60 min，PBS洗去未貼壁的細(xì)胞，每孔加入200 μL中性甲醛固定20 min，100 μL/孔蘇木素常規(guī)染色15 min，蒸餾水洗去染液后于200倍鏡下進(jìn)行觀察(每孔在固定位置取10個視野)。

1.8 RT-PCR(兩步法)Trizol法提取

表1顯示，HUVEC-12細(xì)胞內(nèi)總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。EphB4、EphrinB2和βactin基因序列從 PUBMED的 Gene Bank數(shù)據(jù)庫中獲得，由大連寶生物公司設(shè)計(jì)并合成。反應(yīng)體系為10 × Taq buffer5 μL，25mmolMgCl26 μL，10mmmoldNTP 1 μL，模板1.2 μL，1U/μL TaqDNA聚合酶2 μL，10 μmol/L的上下游引物各2 μL，無核酸酶超純水補(bǔ)齊到50 μL。93℃預(yù)變性3 min，變性、退火、延伸各1 min，35個循環(huán)，72℃補(bǔ)齊2 min。應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測目的基因表達(dá)。

表1 引物序列

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù) ±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用 t檢驗(yàn)，若不符合正態(tài)分布則用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組細(xì)胞增殖能力檢測比較

表2顯示，與同血清含量的對照組比較，5%濃度含藥血清對細(xì)胞的增殖起到抑制作用，1.25%和2.5%濃度的組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明較低濃度的藥物對細(xì)胞增殖不起作用。

2.2 2組細(xì)胞遷移能力比較

表2顯示，與同血清含量的對照組比較，1.25%、2.5%、5%濃度的含藥血清皆能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力(P＜0.01)。

2.3 2組細(xì)胞黏附能力比較

表 2顯示，與同血清含量的對照組比較，1.25%、2.5%、5%濃度的含藥血清皆能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞的黏附能力(P＜0.01)。

表2 不同濃度含藥血清對HUVEC-12細(xì)胞的增殖、遷移、黏附能力影響(±s)

表2 不同濃度含藥血清對HUVEC-12細(xì)胞的增殖、遷移、黏附能力影響(±s)

注:與同血清含量對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù) 血清含量 增殖 遷移 黏附含藥血清空白血清39.0±1.1＊＊51.9±2.5＊＊40.6±5.2＊＊11.9±1.0 21.5±2.0 27.0±1.9 10 10 10 10 10 10 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.086±0.016 0.111±0.027 0.085±0.024*0.099±0.028 0.100±0.012 0.092±0.010 24.0±5.5＊＊34.3±1.3＊＊36.0±0.8＊＊14.2±0.4 7.6±1.1 13.0±1.2

2.4 RT-PCR檢測結(jié)果

表3顯示，藥物血清可以抑制 EphrinB2和EphB42個基因的表達(dá)，但具體情況稍有不同。與同血清含量的對照組比較，只有1.25%，2.5%2個較低濃度含藥血清抑制 EphrinB2的表達(dá)，而對于EphB4，3個濃度含藥血清皆抑制其表達(dá)。

3 討論

血管新生是指在原有毛細(xì)血管網(wǎng)基礎(chǔ)上，通過內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、黏附和分化形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)的過程。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，血府逐瘀湯1.25%、2.5%、5%3個濃度含藥血清對HUVEC-12的遷移、黏附都有顯著的促進(jìn)作用，與課題組前期其他細(xì)胞株的研究結(jié)果一致［1］，說明藥物從細(xì)胞水平通過影響內(nèi)皮細(xì)胞遷移和黏附發(fā)揮促血管生長作用。有學(xué)者［6］認(rèn)為，血府逐瘀湯含藥血清可抑制牛內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并與濃度呈正相關(guān)，其所用的含藥血清濃度為10%以上。本實(shí)驗(yàn)中高濃度5%含藥血清抑制了細(xì)胞的增殖，與上述學(xué)者更高濃度的藥物血清作用一致，提示藥物促血管生長的局限性。本課題組前期在體實(shí)驗(yàn)［4，7］顯示，血府逐瘀湯在缺血損傷早期有效促進(jìn)肉芽組織血管新生的作用隨肉芽組織的纖維化而消失，出現(xiàn)短暫促血管生長的特點(diǎn)。檢測不同濃度藥物血清對內(nèi)皮細(xì)胞ECV304增殖、遷移和體外成血管的影響提示存在濃度限定范圍［8］。在體和離體實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致體現(xiàn)血府逐瘀湯促血管新生作用限制于某個較適宜的濃度和作用時間點(diǎn)［1，5］，體現(xiàn)了藥物對血管生長的獨(dú)特調(diào)控性。

表3 藥物對HUVEC-12細(xì)胞目的基因表達(dá)的影響結(jié)果(±s)

表3 藥物對HUVEC-12細(xì)胞目的基因表達(dá)的影響結(jié)果(±s)

注:與同血清含量對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù) 血清含量 EphB4灰度值 ephrinB2灰度值含藥血清空白血清0.44±0.12*0.27±0.08＊＊0.34±0.11 0.70±0.15 0.64±0.04 0.49±0.09 4 4 4 4 4 4 1.25% 2.5% 5.0% 1.25% 2.5% 5.0% 0.25±0.04＊＊0.70±0.02*0.15±0.04＊＊0.85±0.02 0.77±0.05 0.33±0.04

EphB4與 EphrinB2是酪氨酸蛋白激酶受體家族成員，二者互為配、受體。前期大量實(shí)驗(yàn)集中于EphB4/EphrinB2在胚胎發(fā)育期與動靜脈分化的關(guān)系，隨后發(fā)現(xiàn)其影響細(xì)胞遷移等功能，在調(diào)控血管新生過程中發(fā)揮著重要作用。如有研究［9］表明，顯微注射信號EphrinB2可以不依賴于受體EphB4的結(jié)合直接增加 HUVECs細(xì)胞的遷移速度，提示該信號本身就可獨(dú)立發(fā)揮作用，但更多實(shí)驗(yàn)關(guān)注通路對血管新生的影響。該通路并不局限于信號 EphrinB2與受體EphB4的正向傳導(dǎo)，還可通過細(xì)胞間的接觸形成EphB4作為信號。EphrinB2作為受體的獨(dú)特反向信號傳遞，由于雙向信號的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的差異性，除少數(shù)研究得出相反的結(jié)論［10-11］外，目前多數(shù)研究認(rèn)為正向信號抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、黏附和血管新生，反向信號促進(jìn)上述過程進(jìn)而促血管新生［12-13］。本實(shí)驗(yàn)中藥物對 HUVEC-12的遷移、黏附都有顯著的促進(jìn)作用，同時 EphB4和EphrinB2基因皆下調(diào)表達(dá)，說明藥物促血管新生的作用機(jī)制確實(shí)與 EphB4/EphrinB2通路密切相關(guān)。究竟藥物調(diào)控血管生長主要通過影響正向還是反向抑或雙向信號均發(fā)生反應(yīng)，尚需進(jìn)一步的開展EphB4和EphrinB2蛋白磷酸化改變的研究才能得到明確結(jié)論。

EphB4/EphrinB2影響血管生長的研究已持續(xù)10余年，鑒于其重要作用，有學(xué)者推測 EphB4/ EphrinB2通路有望成為又一抗血管生成的靶向目標(biāo)。采用特定的 EphrinB2抗體代替或與現(xiàn)有的抗血管生成藥聯(lián)用，有可能為血管相關(guān)性疾病提供有效的治療策略［12］。由于其雙向通路的復(fù)雜性為明確機(jī)制設(shè)置了障礙，通過本項(xiàng)目研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識EphB4/EphrinB2信號通路對血管新生的調(diào)控作用，并為血府逐瘀湯的臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction

XU Xiao-ling1，CAI Fei1，LIN Fang1，WANG Yi-zheng1，GAO Dong1△，SONG Jun2
(1.Department of integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350108，China; 2.Experimental Reserch Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China.)

object To explore the roles of EphB4/ephrinB2 in Angiogenesis induced by Xuefu Zhuyu Decoction (XZD).Methods:Using serum pharmacology technique to study the cell proliferation，migration，adhesion，ephrinB2 and EphB4 gene expression by MTT，Boyden chamber，cell adhesion and reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR)separately on Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVEC-12)after intervened by 1.25%，2.5%and 5% XZD containing serums for 48h.ResultsComparison with the control group of same serum level，5%medicated serum inhibited cell proliferation.1.25%，2.5% and 5% medicated serum had significant effect on promoting endothelial cell migration or adhesion and inhibition the EphB4 expression.1.25% and 2.5% medicated serum inhibited EphrinB2 expression.ConclusionXZD had significant effect on cell migration and adhesion to promote angiogenesis which is closely related to the EphB4/EphrinB2.

Xuefu Zhuyu Decoction;EphB4/ephrinB2;angiogenesis

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0362-03

2015-08-22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(O.81173431)

許曉玲(1987-)，女，漳州人，醫(yī)學(xué)碩士，從事活血化瘀藥物應(yīng)用的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:高 冬，Tel:0591-22861151，E-mail:gd1026@ yahoo.com.cn。