附子理中湯灌腸調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6、IL-8及ICAM-1的實(shí)驗(yàn)研究*

張艷曉，方銳潔，白少玉，姬培震，張 怡

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

附子理中湯灌腸調(diào)控潰瘍性結(jié)腸炎大鼠IL-6、IL-8及ICAM-1的實(shí)驗(yàn)研究*

張艷曉，方銳潔，白少玉，姬培震，張 怡△

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

目的:探討附子理中湯干預(yù)脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)可能的藥效環(huán)節(jié)。方法:SPF級(jí)大鼠48只按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶組、附子理中湯高、中、低劑量組6組。中西藥聯(lián)合制備符合脾腎陽虛證的免疫化學(xué)性復(fù)合模型，藥物灌腸干預(yù)后用 ELISA法檢測 IL-6、IL-8在血清中的含量，取結(jié)腸組織，免疫組化染色(SP)法檢測ICAM-1的表達(dá)，并觀察其病理組織學(xué)情況。結(jié)果:中藥各劑量組與模型組比較，血清中 IL-6、IL-8水平、結(jié)腸黏膜病理評(píng)分及其ICAM-1表達(dá)均有所下降，各項(xiàng)檢測指標(biāo)表明附子理中湯高劑量組的療效優(yōu)于柳氮磺胺吡啶組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論:附子理中湯對(duì)脾腎陽虛型UC療效確切，作用機(jī)制可能與降低血清促炎癥因子及細(xì)胞間黏附因子的表達(dá)有關(guān)。

附子理中湯;脾腎陽虛;潰瘍性結(jié)腸炎;IL-6;IL-8;ICAM-1

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)大鼠48只，雌雄各半，體質(zhì)量(200±20) g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(川)2008-24)，飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臟腑病證實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房(動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(川)2012-179)。

1.2 主要試劑

2，4-二硝基氯苯(DNCB)由筆者實(shí)驗(yàn)室合成;冰乙酸、分析純AR(批號(hào)20121207)由成都科龍化工試劑廠提供;Rat IL-6、IL-8 ELISA試劑盒(E-30644、E-30581)由北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司提供;兔抗ICAM-1多克隆抗體(批號(hào) bs-0608R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

2015型轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)，德國徠卡(Leica)儀器有限公司;TSJ-Ⅱ型全自動(dòng)封閉式組織脫水機(jī)，常州市中威電子儀器有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，美國Media Cybernetics公司。

1.4 受試藥物及制備

附子理中湯組成:炮附子、黨參、炒白術(shù)、炙甘草各210 g，干姜105 g，番瀉葉600 g購自成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院馬云桐教授鑒定為正品。附子理中湯制備:附子于6000 ml純水中浸泡30 min后，先煎1 h，納諸藥再煎1 h，定容至濃度為1.18 g/mL;15%番瀉葉制備:用15 g番瀉葉加100 ml 90℃熱水浸泡1min，文火煎15 min，定容為100 ml;柳氮磺胺吡啶(SASP，250 mg/片 批號(hào)09130414，由上海信誼天平藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，在研缽中用力磨至成均勻的混懸液，加入適量生理鹽水，使?jié)舛葹?.35 g/mL，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩浠傻乃?20 ml:100 mg，批號(hào)1205281)由天津金耀氨基酸有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

48只大鼠以體質(zhì)量、性別按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、模型組、柳氮磺胺吡啶組(SASP，420 mg· kg－1)、附子理中湯高(14.18 g·kg－1)、中(7.09 g· kg－1)、低(3.54 g·kg－1)劑量組6組各8只，。

2.2 造模與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，除正常組給予等量蒸餾水外，其余各組給予備好的15%番瀉葉煎劑 4 ml/只灌胃，氫化可的松10 mg/kg頸部皮下注射，連續(xù)15 d，造脾腎陽虛型模型。第16天開始 UC造模，大鼠禁食不禁水36 h，背部脫毛，2%DNCB丙酮液滴于脫毛處的皮膚(表面涂豬油保護(hù))每天1次，0.3 ml/只，連續(xù)14 d。第30天固定大鼠，距肛門約8 cm處灌腸注入 0.1%DNCB乙醇液(50%)0.3 ml。次日給予同一部位注入 0.2%冰乙酸溶液 2 ml，準(zhǔn)確計(jì)時(shí)15 s，5 ml生理鹽水沖洗，造模完成。3 d后給藥組給予相應(yīng)藥物，正常組和模型組給予等量蒸餾水，連續(xù)灌腸15 d。

2.3 取材

末次給藥24 h后大鼠麻醉，股動(dòng)脈取血，3000 rpm/min離心10 min取上清液;沿腹中線剖開腹部，自肛門2 cm處向上剪取結(jié)腸6～8 cm，沿腸系膜縱軸剪開，生理鹽水沖洗，留取各組結(jié)腸2段，10%中性甲醛溶液固定，行病理切片及光鏡免疫組化檢查。

2.4 指標(biāo)檢測

2.4.1 結(jié)腸組織病理形態(tài)并行光鏡下組織學(xué)損傷評(píng)分 觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)，光鏡下對(duì) HE染色切片潰瘍深度、范圍、炎癥程度進(jìn)行評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):①病變深度:0:無損傷，1:病變侵及黏膜層，2:病變侵及黏膜下層，3:病變侵及肌層，4:病變侵及漿膜層;②病變范圍:0:無病變;1:0% ～25%;2: 26% ～50%;3:51% ～75%;4:＞75%;③炎癥程度: 0:無炎癥;1:輕度;2:中度;3:重度。

2.4.2 雙抗體夾心 ABC-ELISA法測定血清IL-6、IL-8含量 嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。

2.4.3 免疫組化法檢測結(jié)腸組織中 ICAM-1的表達(dá) SP法常規(guī)進(jìn)行:切片脫蠟-滅活-修復(fù)抗原-血清封閉-滴加一抗、二抗、三抗-顯色、復(fù)染、脫片、封閉。蛋白表達(dá)結(jié)果判定及測量方法:ICAM-1蛋白主要表達(dá)于大鼠結(jié)腸黏膜及黏膜下層，以胞漿為主，陽性為胞質(zhì)呈棕黃顆粒染色，顏色越深表達(dá)越強(qiáng)。采用圖像分析系統(tǒng)測定所采集全部圖像的平均光密度，若每張切片采集多張圖像則取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 結(jié)腸黏膜組織損傷情況

表1圖1顯示，模型組黏膜層完全壞死脫落，潰瘍累及肌層，黏膜下層可見血管擴(kuò)張、大片組織水腫及彌散性炎細(xì)胞浸潤，經(jīng)治療后給藥組有不同程度好轉(zhuǎn)。附子理中湯高劑量組和SASP組黏膜各層結(jié)構(gòu)完好，未見變性及炎性滲出，黏膜及黏膜下層彌散狀炎細(xì)胞浸潤及不同程度水腫。附子理中湯高、中劑量組、SASP組與模型組比較評(píng)分明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且附子理中湯高劑量組療效優(yōu)于SASP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3.2 各組大鼠血清IL-6、IL-8含量變化

表1顯示，血清中 IL-6、IL-8含量與正常組比較，模型組濃度顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，符合 UC炎癥的發(fā)生特點(diǎn);與模型組比較，SASP組及附子理中湯高、中劑量組的含量均有所下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。附子理中湯高劑量組療效優(yōu)于 SASP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。低劑量組血清中IL-8的含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

3.3 大鼠結(jié)腸組織ICAM-1免疫組化法結(jié)果

表1圖2顯示，與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織細(xì)胞ICAM-1蛋白顯著增高(P＜0.01);與模型組比較，高劑量組及SASP組ICAM-1蛋白均有所下降，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);且附子理中湯高劑量組療效優(yōu)于SASP組(P＜0.05)，中劑量及低劑量組與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、ICAM-1平均光密度及血清IL-6、IL-8含量的影響(±s)

表1 各組大鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分、ICAM-1平均光密度及血清IL-6、IL-8含量的影響(±s)

注:與正常組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與模型組比較:△P＜0.05，△△P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 劑量/g·kg－1 結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分/分 平均光密度(MOD) IL-6/ng·mL－1 IL-8/ng·mL－1正 常 組 8 — 0.19±0.37 0.2593±0.0126 68.58±2.33 237.82± 268.91±28.41 57.82模 型 組 8 — 2.30±1.06＊＊ 0.3037±0.0253＊＊ 70.81±3.49 275.84±40.22＊＊SASP 組 8 0.42 1.13±1.55 0.2650±0.0081△ 70.19±2.57 262.37±21.81△附子理中湯 8 14.18 1.00±1.31△△ 0.2646±0.0160△ 69.75±2.87△ 258.42±30.50△△附子理中湯 8 7.09 1.13±0.99△ 0.2856±0.0123 70.66±3.02 263.43±54.12附子理中湯 8 3.54 1.63±1.06 0.2951±0.0174 69.26±2.11△

圖1 各組大鼠結(jié)腸黏膜組織病理切片(HE染色 ×100)

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織ICAM-1目的蛋白表達(dá)(免疫組化SP法 ×200)

4 討論

UC易遷延反復(fù)，被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為難治性疾病之一。其病因尚不明確，炎癥因子失衡、促炎因子大量增加可能是 UC的重要發(fā)病機(jī)制［5］。IL-6、lL-8是由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，二者在血清中的含量與UC模型大鼠嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［6-7］，也可使Th細(xì)胞分裂、增殖，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞白細(xì)胞黏附因子(CAM)的表達(dá)。ICAM-1是黏附分子免疫球蛋白成員之一，可介導(dǎo)白細(xì)胞不同亞群間的接觸和黏附，調(diào)節(jié)其功能活性和免疫反應(yīng)。UC發(fā)生時(shí)，ICAM-1對(duì)白細(xì)胞的聚集起關(guān)鍵作用。研究表明，降低該分子在腸道的表達(dá)，可以促進(jìn)損傷結(jié)腸黏膜的修復(fù)而達(dá)到治療UC的作用［8］。

脾腎陽虛為UC纏綿難愈的核心病機(jī)之一。故課題組選用溫腎健脾名方附子理中湯進(jìn)行治療。方中以附、姜辛熱回陽為君，臣以參、術(shù)培中益氣，佐以炙草和藥恢復(fù)脾腎之陽。選用灌腸法，一方面可直達(dá)病所，提高藥物的生物利用度，直接發(fā)揮其治療作用［9］，亦可形成藥膜對(duì)損傷腸壁的保護(hù);另一方面減少胃內(nèi)吸收，減輕不良反應(yīng)。

實(shí)驗(yàn)采用15%番瀉葉煎液灌胃聯(lián)合氫化可的松皮下注射復(fù)制脾腎陽虛模型，在此基礎(chǔ)上用2% DNCB丙酮液0.2%乙酸復(fù)合法制備 UC模型［10］。番瀉葉苦寒瀉下易傷脾陽，而氫化可的松皮下注射是誘導(dǎo)腎陽虛的經(jīng)典模型［11］。研究表明，氫化可的松10 mg/kg的劑量對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)和物質(zhì)能量系統(tǒng)指標(biāo)變化最為明顯［12］，兩者聯(lián)合造模效果肯定［13-14］。實(shí)驗(yàn)中，造模大鼠出現(xiàn)倦怠、嗜臥扎堆、肛溫降低、稀便、陰囊冰冷下垂等癥狀，符合中醫(yī)脾腎陽虛的診斷，后期病理切片表明造模成功。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SASP作為治療 UC的經(jīng)典藥物，可有效降低血清促炎因子IL-6、IL-8的含量，下調(diào)結(jié)腸組織中ICAM-1蛋白的表達(dá)。而附子理中湯高中低劑量均可抑制大鼠結(jié)腸組織 ICAM-1表達(dá)，減少腸道炎癥因子IL-6、IL-8，間接促進(jìn)大鼠腸道黏膜的修復(fù)，且隨濃度的遞增療效呈上升趨勢(shì)。

綜上所述，附子理中湯可以有效修復(fù)UC模型大鼠結(jié)腸黏膜，促進(jìn)潰瘍面愈合。其作用機(jī)制可能是通過抑制大鼠結(jié)腸組織中ICAM-1的表達(dá)，降低血清中IL-6、IL-8的含量，從而達(dá)到治療UC的作用。

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Experimental Study of Fuzi Lizhong Decoction on Regulating IL-6，IL-8 and ICAM-1 in Ulcerative Colitis Rats

ZHANG Yan-Xiao，F(xiàn)ANG Rui-Jie，BAI Shao-Yu，JI Pei-Zhen，ZHANG Yi△
(Chengdu university of traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China)

Objective:To explore the possible mechanism of the Fuzi Lizhong decoctions therapeutic effect on spleenkidney-yang-deficiency type in rats with ulcerative colitis.Methods:Forty-eight rats were randomly divided into control group，model group，sulfasalazine group，high-dose，medium-dose and low-dose group of Dandelion extract.Immune chemical compound model，which conforms to the spleen kidney yang deficiency syndrome are made by combing western and traditional Chinese medicine.After giving medicine，ELISA was performed to detect the levels of interleukin-6(IL-6)，interleukin-8(IL-8)and Immunohistochemical and SP method was performed to detect the expressive levels of ICAM-1.The histological changes of mucous membrane were observed.Results:Compared with model group，the Fuzilizhong decoctions at high—dose，medium—dose and low-dose could reduce histological changes，the level of IL-6 and IL-8.The expressive levels of ICAM-1 in colonic mucosa was reduced at the same time.The detection of indicators show that the effect of high dose group was better than that of SASP group，the difference has statistical significance.Conclusion:These results indicated that Fuzi Lizhong decoctions has effects on ulcerative colitis.Its mechanism is associated with decreased the content of Interleukin-6，interleukin-8 and the expressive levels of ICAM-1.

Fuzi Lizhong decoctions;Spleen-kidney-yang-deficiency;Ulcerative colitis;IL-6;IL-8;ICAM-1

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0351-04

四川省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015JY0240)-芪附理中灌腸方調(diào)控PPAR-γ/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)慢性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠抗炎作用的免疫機(jī)制研究;成都中醫(yī)藥大學(xué)校 2013年度科技計(jì)劃項(xiàng)目(ZRMS201301)-附子理中湯灌腸對(duì)UC大鼠(脾腎陽虛型)結(jié)腸組織中ICAM-1及相關(guān)炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響研究素之一［2］。臨床廣泛運(yùn)用附子理中湯進(jìn)行治療［3］，該方保留灌腸治療本病療效確切［4］。本研究擬從抑制炎癥因子的角度探討附子理中湯治療UC的作用機(jī)制。

2015-07-23

張艷曉(1990-)，女，河南洛陽人，在讀碩士，從事中醫(yī)藥防治脾胃疾病的實(shí)驗(yàn)研究。

△

:張 怡，女，教授，從事中醫(yī)藥防治脾胃疾病的臨床和實(shí)驗(yàn)研究，Tel:028-87783829。

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病變累及大腸黏膜及黏膜下層的慢性非特異性炎癥［1］，臨床常以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要表現(xiàn)。本病反復(fù)發(fā)作，遷延難愈，目前尚無特效藥物治療，西藥或因其副作用影響，患者依從性較差。中醫(yī)認(rèn)為，對(duì)于反復(fù)發(fā)作的慢性潰瘍性結(jié)腸炎應(yīng)屬于“休息痢”范疇，而脾腎陽虛是其遷延不愈的重要因