反相離子對色譜法同時測定黃柏八味片中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量

黃湘杰，朱 芹

（1．湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100）

反相離子對色譜法同時測定黃柏八味片中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿含量

黃湘杰1，朱 芹2

（1．湖南省湘鄉(xiāng)市人民醫(yī)院，湖南 湘潭 411400； 2．湖南省湘潭市食品藥品檢驗所，湖南 湘潭 411100）

目的 建立同時測定黃柏八味片中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量的反相離子對色譜法。方法 色譜柱為Agilent C18柱(250 mm× 4．6 mm，5 μm)，流動相為0．5%磷酸溶液（用磷酸調pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0．2 g）－乙腈（65∶35），柱溫25℃，流速1．0 mL／min，檢測波長284 nm。結果 鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿進樣量分別在0．204～1．020 μg和0．506～2．530 μg與峰面積線性關系良好，平均回收率分別為100．18%和99．82%，RSD分別為0．14%和0．51%（n＝6）。結論 該法簡便易行，結果可靠準確，組分分離良好，可用于制劑的質量控制。

高效液相色譜法；黃柏八味片；鹽酸小檗堿；鹽酸黃柏堿

黃柏八味片是由黃柏、梔子、甘草、紅花等8味藥材組方的中藥復方制劑，具有清熱涼血、固精功效，用于治療腎熱、尿路感染、尿中帶血、經下過多等病癥。其執(zhí)行標準為國家食品藥品監(jiān)督管理局標準YBZ07192006，檢驗項目為黃柏的薄層色譜鑒別和鹽酸小檗堿的薄層掃描含量測定，而鹽酸小檗堿在黃連、黃柏、三顆針藥材中均存在，以其作為含量測定指標不具有專屬性。2010年版《中國藥典（一部）》中也將鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量作為控制黃柏質量的指標之一[1]。為更好地控制本制劑的質量，保證臨床用藥的安全、有效，筆者采用反相離子對色譜法同時測定黃柏八味片中鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿的含量，該法操作簡便、快速、準確可靠，現報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；AUW－220D型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）；UV2501型紫外可見分光光度計（日本島津公司）。鹽酸小檗堿對照品(批號為110713－201212，含量為 86．7%)、鹽酸黃柏堿對照品(批號為 111895－201202，含量為93．9%)均購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用；黃柏八味片（湖南興蒙制藥有限公司，批號為131201，140407，140910）；乙腈為色譜純，水為重蒸餾水，其他試劑為分析純。

2 方法與結果

2．1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm)；流動相：0．5%磷酸溶液（用磷酸調pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉 0．2 g）－乙腈（35∶65）[2－3]；流速：1．0 mL／min；檢測波長：284 nm；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

2．2 溶液制備

稱取鹽酸小檗堿對照品、鹽酸黃柏堿對照品，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋制成每1 mL含鹽酸小檗堿0．040 8 mg、鹽酸黃柏堿1．011 mg的混合溶液，即得對照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密稱定，研細，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入流動相50 mL，超聲處理（功率為400 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用流動相補足減失的質量，搖勻，離心，取上清液濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。取缺黃柏黃柏八味片試樣（自制），照供試品溶液制備方法，得陰性對照品溶液。

2．3 方法學考察

專屬性試驗：精密吸取2．2項下3種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，依法測定。供試品溶液色譜中，與對照品溶液色譜相應保留時間位置有相同保留時間的色譜峰，陰性對照品溶液對測定無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液和鹽酸黃柏堿對照品溶液5，8，10，15，20，25 μL，分別注入液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定，以進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積 A為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得回歸方程，鹽酸小檗堿 Y＝2 000 000X＋25 852(r＝0．999 2，n＝6），鹽酸黃柏堿 Y＝101 786X＋1 549．3(r＝0．999 1，n＝6）。結果表明鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿進樣量分別在0．204～1．020 μg和 0．506～2．530 μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：精密量取同一對照品溶液10 μL，連續(xù)重復進樣6次，按擬訂色譜條件測定。結果鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿峰面積的 RSD分別為0．5%和1．2%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為131201）樣品，精密稱取6份，依法制備供試品溶液，在擬訂色譜條件下測定。結果每片樣品中含鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿1．476 mg和 0．351 mg，RSD分別為 1．0%和 1．2%（n＝6），表明方法重復性良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，室溫放置，每隔2 h測定1次，連續(xù)測定7次。結果鹽酸小檗堿和鹽酸黃柏堿含量的 RSD分別為1．1%和1．5%（n＝7），表明供試品溶液在12 h內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：稱取已測定含量樣品（批號為131201，每片含鹽酸小檗堿、鹽酸黃柏堿1．476 mg和0．351 mg），精密稱定，除去糖衣，研細，取約0．5 g，置具塞錐形瓶中。再精密量取鹽酸小檗堿對照品溶液(0．461 9 g／L)、鹽酸黃柏堿對照品溶液(0．101 1 g／L)各3 mL，分別加入上述具塞錐形瓶中，按供試品溶液制備方法制備待測溶液。按擬訂色譜條件測定含量并計算回收率。結果見表1。

表1 鹽酸小檗堿及鹽酸黃柏堿加樣回收試驗結果（n＝6）

2．4 樣品含量測定

取3批樣品，按擬訂方法制備供試品溶液，依法測定，按外標法計算含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果(mg，n＝3)

3 討論

檢測波長的選擇：采用二極管陣列檢測器于200～400 nm波長進行光譜掃描，發(fā)現鹽酸小檗堿于230 nm，265 nm，345 nm波長處均有較強紫外吸收，而鹽酸黃柏堿最大吸收波長為284 nm。故選擇 284 nm為檢測波長。

提取溶劑的選擇[4－5]：考察以甲醇、50%甲醇、鹽酸－甲醇（1∶100）為提取溶劑，結果鹽酸－甲醇（1∶100）酸性太大，不適合提取黃柏堿；甲醇、50%甲醇的極性偏小，也不適合提取極性較大的黃柏堿。經比較超聲、回流2種提取方法，并設定不同的提取時間和不同的提取溶劑體積，最終確定最佳提取方式為加流動相50 mL，超聲30 min。

流動相的選擇：嘗試了乙腈－0．5%三乙胺－0．2%磷酸、乙腈－0．02 mol／L磷酸二氫鉀(磷酸調pH 3．0)、0．5%磷酸溶液（用磷酸調pH至4．0，每100 mL加十二烷基磺酸鈉0．2 g）－乙腈（35∶65）3種不同的流動相體系。結果發(fā)現乙腈－磷酸緩沖鹽體系洗脫力強，其中反相離子對SDS的加入可以降低鹽酸黃柏堿的極性，延長柱上保留時間并有效地防止拖尾并且峰形對稱，分離度較好。故選擇后者為流動相。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（一部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010:286，附錄29．

[2]陳天朝，瞿來超．HPLC梯度洗脫測定黃柏中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J]．中醫(yī)研究，2011，24(4):23－25．

[3]張 莉，潘 超．高效液相色譜法同時測定二妙丸中鹽酸小檗堿與鹽酸黃柏堿的含量[J]．中藥新藥雜志，2011，20(22): 2 262－2 264．

[4]祝晨 ，林朝展，莫建霞，等．HPLC法測定黃柏藥材中鹽酸小檗堿與黃柏堿的含量[J]．中藥新藥與臨床藥理，2004，15(4): 262－264．

[5]朱 芹，黃湘杰．HPLC法同時測定三黃散中黃芩苷和鹽酸小檗堿的含量[J]．中國藥師，2014，17(8):1 432－1 434．

Simultaneous Determination of Phellodendrine Chloride and Berberine Hydrochloride in Huangbaibawei Tablets by Reversed Phase Ion－Pair Chromatography

Huang Xiangjie1,Zhu Qin2
(1．XiangTan Institute for Food and Drug Control,Xiangtan,Hunan,China 411400; 2．Xiangxiang People′s Hospital,Xiangtan,Hunan,China 411100)

Objective To establish the reversed phase ion－pair chromatography method for the determination of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride in Huangbaibawei Tablets．Methods The Agilent C18column(250 mm×4．6 mm,5 μm)was used．The mobile phase was acetonitrile－0．5% phosphoric acid solution,adjusted to pH 4 with phosphoric acid,each 100 mL added sodium dodecyl sulfate 0．2 g(65∶35)．The flow rate was 1．0 mL／min,the column temperature was 25℃ and the detection wavelength was 284 nm．Results The injection volume of berberine hydrochloride and phellodendrine chloride were in good linear relationship with the peak area in the ranges of 0．204－1．020 μg and 0．506－2．530 μg．The average recovery rates were 100．18% and 99．82%,and the RSD were 0．14% and 0．51%(n＝6)．Conclusion The method is simple,accurate,with good separation of the 2 components,which can be used as the quality control of Huangbaibawei Tablets．

HPLC;Huangbaibawei Tablets;berberine hydrochloride;phellodendrine chloride

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)03－0052－03

黃湘杰，男，大學本科，主管藥師，研究方向為藥物分析，（電子信箱）zhuqin1221＠163．com。

2015－03－18；

2015－09－10)