胰腺p-STAT3在急性胰腺炎危重演變中的表達變化*

史迎莉， 劉 芳， 張曉芹， 賈曉云， 李 濤， 許小凡， 張 紅△

(1. 陜西中醫(yī)藥大學 醫(yī)學科研實驗中心， 咸陽 712046； 2. 敦化市醫(yī)院病理科， 吉林 敦化 133700)

胰腺p-STAT3在急性胰腺炎危重演變中的表達變化*

史迎莉1， 劉 芳1， 張曉芹1， 賈曉云2， 李 濤1， 許小凡1， 張 紅1△

(1. 陜西中醫(yī)藥大學 醫(yī)學科研實驗中心， 咸陽 712046； 2. 敦化市醫(yī)院病理科， 吉林 敦化 133700)

目的：檢測信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)在不同程度胰腺炎模型小鼠胰腺組織中表達的變化，探討其在急性胰腺炎危重演變中的作用。方法：48只健康雄性balb/c小鼠隨機分為3組(n=16)：對照組(Con)、輕癥急性胰腺炎(MAP)組、重癥急性胰腺炎(SAP)組。Con組腹腔注射0.9% NaCl；MAP組腹腔注射雨蛙素；SAP組腹腔注射雨蛙素聯(lián)合脂多糖；分別于造模后2 h、6 h檢測血清淀粉酶的活性；分離胰腺、稱重，計算胰腺濕重比；檢測肺組織髓過氧化物酶(MPO)活性，評估炎細胞浸潤肺組織的程度；HE染色切片，光鏡下觀察胰腺、肺組織病理學改變； Western blot法檢測磷酸化STAT3(p-STAT3)的變化。結(jié)果：與Con組比較， MAP組和SAP組在各時間點血清淀粉酶活性和胰腺組織濕重比均升高(P<0.05)；肺組織MPO活性顯著升高(P<0.05)，且SAP組肺MPO含量明顯高于MAP組(P<0.01)。MAP組和SAP組，在造模后2 h，胰腺和肺均可見不同程度的病理學改變； SAP組在造模后2 h胰腺p-STAT3的表達最高，6 h表達有所減弱；MAP組各時間點僅有微量表達；Con組在各時間點為陰性表達。結(jié)論：p-STAT3在輕癥急性胰腺炎和重癥急性胰腺炎模型小鼠胰腺中的表達差異明顯，說明重癥急性胰腺炎的重癥化與STAT3的活化關(guān)系密切；抑制STAT3活化將成為阻止急性胰腺炎重癥化的靶點之一。

急性胰腺炎；信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 ;病理組織學；髓過氧化物酶；小鼠

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis，SAP)是臨床常見的危重疾病之一，起病急、病情兇險、并發(fā)癥多，死亡率可達20%～30%。發(fā)病機制尚不明確。近來的研究顯示：在SAP發(fā)生、發(fā)展的過程中，細胞因子和炎癥介質(zhì)發(fā)揮了重要作用[1]，尤其是白介素-6(interleukin-6, IL-6)。在輕癥急性胰腺炎(mild acute pancreatitis，MAP)和SAP患者血清中IL-6含量明顯不同，血清中IL-6等細胞因子的水平與SAP及其全身并發(fā)癥的嚴重程度關(guān)系密切[2,3]。近期研究提示：IL-6等炎性細胞因子可誘發(fā)其下游轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)活化，從而促進炎癥的進一步發(fā)展[4]。急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)發(fā)生時，STAT3活化是否參與急性胰腺炎重癥化演變過程及急性胰腺炎的炎癥損傷值得深入研究。本實驗通過復制小鼠MAP和SAP模型，觀察其胰腺組織、肺組織的病理學變化及胰腺組織中STAT3活化程度的改變，探討在AP危重演變過程中STAT3的作用，以期為早期診斷和治療SAP提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

雨蛙素(cerulein，批號：108k721)、脂多糖(lipopolysaccharide, LPS，L-2880)購自Sigma 公司； STAT3單克隆抗體(批號：sc-2186-R)購于美國Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(批號：BA1054)購自武漢博士德公司；兔抗小鼠β-actin 單克隆抗體(批號：019982)購自北京博奧森公司；血清淀粉酶及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)檢測試劑盒均購自南京建成生物研究所；酶標儀(Bio-Tek,ELX808)；研究級正置顯微鏡及圖形采集系統(tǒng)(德國蔡司，A1)；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)、凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-rad)。

1.2 實驗動物

健康雄性Balb/c小鼠48只：體重(20±2)g，6～8周齡，購于第四軍醫(yī)大學實驗動物中心(動物合格證號：0001442),分籠室溫(20℃～25℃)飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

1.3 方法

1.3.1 分組與造模 48只雄性小鼠，隨機分為3組：對照組(Con)(0.9% NaCl)；輕癥急性胰腺炎(MAP)組(cerulein)；重癥急性胰腺炎(SAP)組(cerulein + LPS)；各組又再按照時間點分為2 h、6 h組(n=8)。

小鼠造模前禁食12 h，MAP組，每小時腹腔注射Cerulein(50 μg/kg)，分別注射2次和6次；SAP組[5]腹腔注射 Cerulein聯(lián)合LPS (Cerulein，50 μg/kg；LPS在Cerulein 第1次注射后立即注射，10 mg/kg)；對照組在相同的時間點腹腔注射等體積的0.9% NaCl。

1.3.2 檢測血清淀粉酶活性 在造模后2 h、6 h，水合氯醛麻醉，下腔靜脈采血，分離血清，按照試劑盒要求，檢測血清淀粉酶活性的變化。

1.3.3 記算胰腺濕重比 摘取胰腺，去除血污等，稱量胰腺濕重，計算胰腺濕重比。

1.3.4 鏡下觀察胰腺和肺的病理學改變 制備常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察胰腺及肺組織病理學變化并采集圖像。

1.3.5 肺髓過氧化物酶檢測 將右肺組織勻漿，高速冷凍離心機離心10 min(4℃，10 000 r/min)，吸取上清，按試劑盒要求檢測MPO，評估肺組織中炎細胞浸潤的程度。

1.3.6 Western blot法檢測胰腺p-STAT3的表達 取50 mg胰腺組織勻漿，靜置冰上30 min，高速冷凍離心機離心10 min(4℃，10 000 r/min)，吸取上清，用BCA檢測試劑盒檢測蛋白濃度，稀釋樣品濃度至4 μg/μl；配濃度為10%的SDS-PAGE膠，上樣進行蛋白電泳，待樣品跑至膠底部后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉膜，室溫，搖床上輕搖1 h。封閉結(jié)束用TBST洗脫，置于搖床上輕搖，5 min×3次；之后孵育Ⅰ抗，按比例稀釋β-actin (1∶2 000)，p-STAT3(1∶500)，分別滴加稀釋后的一抗至PVDF膜，4℃層析柜，搖床輕搖孵育過夜。TBST漂洗5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG Ⅱ 抗(稀釋濃度為1∶1 000)，室溫1 h。TBST漂洗，10 min×3次。將PVDF膜置于暗盒中，在膜上滴加ECL發(fā)光劑，在暗室中用X光片曝光，顯影、定影后，用圖像分析軟件分析結(jié)果。

1.3.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組血清淀粉酶活性變化

造模后, 與Con組相比較,MAP組和SAP組各時間點血清淀粉酶活性均明顯升高,差異具有顯著性(P<0.05)；在造模后6 h，SAP組血清淀粉酶活性高于MAP組，但無統(tǒng)計學差異(表1)，表明血清淀粉酶水平隨著胰腺炎的進展而升高。

2.2 胰腺濕重比

造模后, 與Con組相比較, 在各時間點MAP和SAP組胰腺濕重均明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.05，P<0.01)；MAP組和SAP組相比，無統(tǒng)計學意義(表1)；表明急性胰腺炎炎癥早期水腫明顯，胰腺濕重比升高。

Tab. 1 Levels of serum amylase and pancreatic wet weight ratio in each group at different time point(±s,n=8)

GroupSerumamylase(U/L)PancreaticwetweightratioCon2h3548．386±366．9700．010±0．0036h3396．773±360．2310．012±0．006MAP2h5287．086±659．681??0．016±0．001??6h6381．679±890．648??0．018±0．001??SAP2h5171．840±986．597?0．017±0．001?6h7029．923±507．957??0．018±0．002?

Con: Control; MAP: Mild acute pancreatitis; SAP: Severe acute pancreatitis

*P<0.05,**P<0.01vsCon group

2.3 各組肺組織MPO活性變化

Cerulein誘發(fā)AP后, 與Con組相比較，在各時間點MAP和SAP組肺MPO含量明顯增加, 具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)； SAP組在各時間點MPO均明顯升高，尤其是2 h，與同時間點MAP組相比較，差異顯著 (P<0.01，表2)。表明急性胰腺炎發(fā)生時，同時伴有肺組織炎性細胞浸潤，且SAP組重于MAP組。

Tab. 2 The expressions of p-STAT3 protein and MPO in each group at 2 h and 6 h(±s,n=8)

GroupProteinlevel(/β?actin)MPOCon2h0．106±0．0020．004±0．0036h0．105±0．0050．006±0．002MAP2h0．316±0．0030．159±0．049??6h0．257±0．0010．236±0．098??SAP2h1．034±0．0261．193±0．255??##6h0．601±0．0050．664±0．086??##

Con: Control; MAP: Mild acute pancreatitis; SAP: Severe acute pancreatitis; MPO: Myeloperoxidase

**P<0.01vsCon group;?##P<0.01vsMAP group

2.4 胰腺與肺的病理學改變

光鏡下Con組小鼠胰腺無明顯病理學改變；造模后2 h ，MAP組和SAP組模型小鼠，均可見胰腺組織小葉間腫脹, 有少量中性粒細胞浸潤；造模后6 h，MAP組胰腺腺泡腫脹，間質(zhì)小血管擴張、充血,有中性粒細胞浸潤；而SAP組胰腺腺泡腫脹明顯，間隙變小，有大量中性粒細胞浸潤，出現(xiàn)點片狀壞死灶(圖1，見彩圖頁Ⅳ)。

Con組小鼠肺組織無明顯病理改變；造模后2 h， MAP和SAP組肺組織均可見肺泡間隔輕度水腫、間隙增寬，有少量中性粒細胞浸潤；造模后6 h，MAP組和SAP組均可見肺泡間隔增寬，炎細胞浸潤，部分肺泡腔內(nèi)有滲出(圖2，見彩圖頁Ⅳ)。

2.5 各組小鼠胰腺組織p-STAT3蛋白表達的變化

Con組小鼠胰腺中未檢測到p-STAT3蛋白的表達； MAP組在各時間點僅見p-STAT3蛋白有微弱表達，而SAP組在造模后2 h，可見p-STAT3表達明顯增強，在6 h，p-STAT3表達有所降低，但與MAP組相應時間點比較，差異無顯著性；提示胰腺STAT3活化可能參與了急性胰腺炎的重癥化進程(圖3，表2)。

Fig. 3 Expression of p-STAT3 at 2 h and 6 h

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)[7]， Cerulein聯(lián)合LPS腹腔注射，可以導致胰腺在水腫的基礎上伴發(fā)壞死灶，表現(xiàn)為：胰腺間質(zhì)水腫、炎細胞浸潤及胰腺實質(zhì)出血、壞死。而單純使用Cerulein腹腔注射所致模型以胰腺間質(zhì)水腫為主。我們采用這兩種造模方法分別成功復制了MAP和SAP模型。SAP模型的血清淀粉酶、胰腺濕重以及肺組織MPO均顯著高于MAP組。另外在造模后2 h、6 h分別取胰腺組織，檢測p-STAT3蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)p-STAT3在MAP小鼠胰腺中僅有微量表達，在SAP組表達明顯增強，造模后2 h表達最高，至6 h有所降低，提示STAT3在SAP的早期就發(fā)生了活化，且與急性胰腺炎的危重演變密切相關(guān)。

STAT3屬于信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活家族，具有信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能，是IL-6介導的炎癥反應通路中的重要成員，在許多類型的細胞和組織中均表達，研究發(fā)現(xiàn)STAT3可以被 JAKs激酶激活成為p-STAT3，STAT3活化的重要指征就是p-STAT3的表達水平[8]。有研究發(fā)現(xiàn)[9]，在結(jié)腸炎的信號通路中，過度生成的IL-6與IL-6受體結(jié)合,活化JAK激酶，進而引發(fā)下游的信號轉(zhuǎn)錄因子STAT3 發(fā)生磷酸化并形成二聚體進入細胞核，啟動下游相關(guān)靶基因如炎性細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達。有實驗[10]采用Cerulein聯(lián)合LPS復制小鼠SAP模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT3在SAP小鼠胰腺中高表達，使用IL-6中和抗體后，STAT3的活化程度可有效降低，胰腺損傷程度亦有所減輕。研究發(fā)現(xiàn)[11]，SAP大鼠肺組織內(nèi)p-STAT3 的表達升高同肺組織內(nèi)IL-1β、IL-6升高水平一致，提示SAP發(fā)生時， STAT信號通路被激活，可以增加促炎細胞因子的釋放，進一步引發(fā)肺損傷。Zhang等采用STAT3基因敲除小鼠復制急性胰腺炎模型[12]，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，STAT3基因敲除小鼠的胰腺及肺損傷明顯減輕，而SOCS3基因敲除的動物由于缺乏對STAT3活化的抑制作用，使得胰腺STAT3過度活化，胰腺和肺的損傷也進一步加重。在大鼠SAP模型早期[13]， JAK2、STAT3表達量明顯升高，其表達量和炎癥因子IL-1β、TNF-α的高表達及胰腺損傷程度呈正相關(guān)。本研究結(jié)果也證實了MAP組和SAP組小鼠胰腺p-STAT3的活性表達存在明顯差異。以上多個實驗結(jié)果提示胰腺組織中STAT3的活化可能與胰腺炎的病變程度密切相關(guān),但是STAT3在急性胰腺炎危重演變中發(fā)揮的具體作用機制需在今后的研究中深入探討。

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The roles and mechanisms of p-STAT3 signaling pathway in acute pancreatitis

SHI Ying-li1, LIU Fang1, ZHANG Xiao-qin1, JIA Xiao-yun2, LI Tao1, XU Xiao-fan1, ZHANG Hong1△

(1. Medical Research Center, Shanxi University of Chinese Medicine, Xianyang 712046； 2. Department of Pathology, Municipal Hospital of Dunhua City, Dunhua 133700, China)

Objective: To detect the expression of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) in pancreatic tissue of the mouse model of pancreatitis, and to explore its role in the evolution of acute pancreatitis. Methods: Forty-eight healthy male balb/c mice were randomly divided into 3 groups (n=16): control group (Con) 0.09% NaCl, intraperitoneal injection; mild acute pancreatitis group (MAP) caerulein, intraperitoneal injection; severe acute pancreatitis group (SAP) caerulein plus lipopolysaccharide(LPS), intraperitoneal injection. The mice were sacrificed after 2 h and 6 h after intraperitoneall injection. Serum was isolated for amylase activity. Pancreatic was isolated and weighed to calculate the pancreatic wet weight ratio. Myeloperoxidase (MPO) activity was measured to assess the degree of inflammatory cell infiltration in lung tissue. Using HE staining, the pathological changes of pancreatic and lung were observed under the light microscope. The expression of phosphorylated STAT3 (p-STAT3) was detected by Western blot. Results: Compared with control group, serum amylase activity, pancreatic wet weight ratio and lung MPO activity were significantly increased (P<0.05) in MAP and SAP group at each time point, especially SAP group showed higher levels of MPO activity than that in MAP group (P<0.01). The pathological changes of pancreas and lung were observed after modeling in 2 h. Western blot showed the expression of p-STAT3 could be detected in SAP group, the level increased most significantly after modeling 2 h, and decreased slightly after 6 h. The level of p-STAT3 was low in MAP group and negative in Con group at each time point. Conclusion: The expression of p-STAT3 in MAP and SAP groups are significantly different from that in control group, which indicates that STAT3 is closely related in acute pancreatitis. Inhibition of STAT3 activity is a potential target to alleviate acute pancreatitis progression.

acute pancreatitis； STAT3； histopathology； myeloperoxidase； mouse

陜西省科技廳自然科學基礎研究項目(2010JM4023)；咸陽市科技局自然科學基金資助項目(2011K13-06(1))

2016-03-01

2016-05-20

R363

A

1000-6834(2016)05-450-04

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.017

△【通訊作者】Tel： 029-38183455； E-mail： zhangh1227@163.com