高效液相色譜法測定咳停合劑中嗎啡含量

馮 靜，余孟君，歐陽冰，盧來春

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，重慶 400042）

高效液相色譜法測定咳停合劑中嗎啡含量

馮 靜，余孟君，歐陽冰，盧來春

（中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所，重慶 400042）

目的 建立測定咳停合劑中嗎啡含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法 色譜柱為Xtimate C8柱（Welch Xtimate，250 mm×4．6 mm，5 m），流動相為乙腈－0．025 mol／L磷酸二氫鉀－0．002 5 mol／L庚烷磺酸鈉（30∶85∶85，V／V／V），檢測波長為 220 nm，流速為1．0 mL／min，進樣量為20 L。結(jié)果 嗎啡質(zhì)量濃度在1．008～20．16 g／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r＝0．999 7（n＝7），平均回收率為99．16%，RSD＝1．28%（n＝9）。結(jié)論 該方法檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，靈敏度高，可作為咳停合劑中嗎啡的含量測定方法。

高效液相色譜法；咳停合劑；嗎啡；含量測定

咳停合劑由復(fù)方樟腦酊、遠志酊、橙皮酊、氯化銨等組方，具有鎮(zhèn)咳、祛痰的功效，適用于支氣管炎、上呼吸道感染、支氣管擴張及肺炎引起的咳嗽、咯痰?？韧：蟿獒t(yī)院制劑，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中僅有氯化銨的含量測定和復(fù)方樟腦酊[1]的薄層色譜鑒別，不能完全控制咳停合劑的質(zhì)量。復(fù)方樟腦酊為咳停合劑發(fā)揮鎮(zhèn)咳作用的主要有效成分，且含精神類物質(zhì)嗎啡，會產(chǎn)生依賴性，應(yīng)對其含量進行控制。為提高咳停合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法對本品復(fù)方樟腦酊中的嗎啡含量進行了研究[2－6]，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；BAS124S型電子天平（德國Sartorius公司）。

1．2 試藥

嗎啡對照品（批號為 171201－201324，含量為99．1%）由中國食品藥品檢定所提供；甲醇、乙腈為色譜純，試驗用水為超純水，其余試劑均為分析純；咳停合劑為本院自制（批號分別為 150506－S1，150506－S2，150506－S3）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗[1]

色譜柱：Welch Xtimate C8柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 －0．025 mol／L磷酸二氫鉀－0．002 5 mol／L庚烷磺酸鈉（30∶85∶85，V／V／V）；檢測波長：220 nm；流速：1．0 mL／min；進樣量：20 μL。

精密量取質(zhì)量濃度為0．25 mg／mL的嗎啡對照品5%醋酸溶液0．5 mL，置處理后的固相萃取柱上，按擬訂條件洗脫，用5 mL容量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。分別精密量取供試品溶液與對照品溶液各20 μL，依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按下列公式計算，系統(tǒng)適用性測定結(jié)果（fs）應(yīng)在0．97～1．03之間。

式中，AX為供試品溶液中嗎啡峰面積，AR為對照品溶液中嗎啡峰面積，CX為供試品溶液質(zhì)量濃度，CR為對照品溶液質(zhì)量濃度。

2．2 溶液制備

取固相萃取柱1支，依次用甲醇－水（3∶1）15 mL與水5 mL沖洗，取水適量，滴加氨試液調(diào)pH至9，待用。取本品1瓶，超聲處理10 min，取出，搖勻；精密量取2 mL，置上述固相柱上，滴加氨試液適量，至柱內(nèi)溶液的pH約為9（上樣前應(yīng)取同體積上樣液預(yù)先調(diào)試，以確定滴加氨試液的量），搖勻，待溶劑滴盡后，用水20 mL沖洗，用5%醋酸溶液洗脫，用5 mL容量瓶收集洗脫液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。取對照品25 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加5%醋酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取1 mL置25 mL容量瓶中，加5%醋酸溶液稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。稱取氯化銨適量，量取遠志酊、橙皮酊適量，按處方制成缺復(fù)方樟腦酊的咳停合劑，按供試品溶液制備方法制得陰性對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗：精密量取供試品溶液、對照品溶液、陰性對照品溶液各20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果，供試品溶液色譜圖中，嗎啡峰與其他成分峰分離度良好，分離度大于1．5，供試品溶液嗎啡峰保留時間與對照品溶液一致，約6．5 min，理論板數(shù)大于3 000。色譜圖見圖1。

圖1 咳停合劑高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取嗎啡對照品配制系列質(zhì)量濃度溶液，依法進樣測定，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進行線性回歸，得回歸方程 A＝58．708 C＋6．014 8，r＝0．999 7（n＝7）。結(jié)果表明，嗎啡質(zhì)量濃度在1．008～20．16 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定。結(jié)果的 RSD為0．027%（n＝6），表明儀器精密度良好。

定量限考察：精密量取線性關(guān)系考察項下對照品溶液，加5%醋酸溶液稀釋至0．050 4 μg／mL，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果定量限溶液信噪比為12．5，定量限為1．008 ng。

重復(fù)性試驗：取批號為150506－S1的咳停合劑，依法制備供試品溶液6份，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果嗎啡的平均含量為 47．40 μg／mL，RSD為 0．18%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取重復(fù)性試驗項下同一供試品溶液，分別于室溫下放置0，4，8，14，24 h后，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果的 RSD為0．24%（n＝5），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密量取批號為 150506－S1的咳停合劑，加嗎啡對照品溶液適量，按擬訂方法制備低、中、高3個濃度供試品溶液（80%，100%，120%）各3份，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 嗎啡加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）

中間精密度試驗：取重復(fù)性試驗項下供試品溶液，放置數(shù)天，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果2次測得嗎啡的平均含量為47．58 μg／mL，RSD為0．78%(n＝2)，表明該方法的中間精密度良好。

方法耐用性試驗：對擬訂色譜條件分別進行柱溫（±2℃）、流速（±0．2 mL／min）、流動相比例（±2%）的微小改變，精密量取供試品溶液、對照品溶液各20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果咳停合劑色譜條件（流速、柱溫和流動相比例）發(fā)生微小改變時，嗎啡平均含量無明顯變化，表明該方法耐用性良好。

2．4 樣品含量測定

取3批咳停合劑，依法制備供試品溶液各3份，按擬訂色譜條件進樣測定，以外標(biāo)法計算其含量。結(jié)果3批供試品溶液中嗎啡的含量分別為 47．51，47．68，48．24 μg／mL，RSD分別為 0．04%，0．53%，1．39%（n＝3）。

3 討論

3．1 檢測波長選擇

取嗎啡對照品適量，以甲醇稀釋至10 μg／mL，在200～400 nm波長范圍內(nèi)測定最大吸收波長。結(jié)果嗎啡在214 nm波長處有最大吸收。試驗中供試品溶液以5%醋酸溶液作為溶劑，因醋酸在紫外光低波長處有吸收，對色譜圖基線有影響，故參考2010年版《中國藥典（二部）》[1]中色譜條件，以220 nm作為嗎啡的檢測波長。

3．2 流動相選擇

試驗考察了不同流動相對嗎啡色譜圖的影響。流動相A：乙腈－水；流動相B：乙腈－0．05 mol／L磷酸二氫鉀；流動相C：乙腈－0．05 mol／L磷酸二氫鉀－0．1%醋酸；流動相D：乙腈－0．025 mol／L磷酸二氫鉀－0．002 5 mol／L庚烷磺酸鈉。結(jié)果流動相為乙腈－0．025 mol／L磷酸二氫鉀－0．002 5 mol／L庚烷磺酸鈉時，嗎啡色譜峰對稱因子、峰寬、板數(shù)均較理想，因此選擇流動相D作為本試驗流動相。

3．3 色譜柱選擇

試驗考察了不同色譜柱對嗎啡色譜峰的影響。色譜柱A：DiamonsilC18柱（250mm×4．6mm，5μm）；色譜柱B：Welch Xtimate C8柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）。結(jié)果，當(dāng)使用色譜柱A時，嗎啡色譜峰對稱因子為0．75，當(dāng)使用色譜柱B時，嗎啡色譜峰對稱因子為0．95，符合要求，故選擇Welch Xtimate C8柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）作為本試驗的色譜柱。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典（二部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：592．

[2]鐘桂香，嚴 佳，黃愛文，等．高效液相色譜法測定氯化銨甘草口服溶液中嗎啡、愈創(chuàng)甘油醚和甘草酸的含量[J]．東南國防醫(yī)藥，2014，16（3）：229－232．

[3]董海榮，李 君，李俊芳，等．RP－HPLC法測定咳欣康片中嗎啡的含量[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2009，11（11）：187－188．

[4]希爾艾力·吐爾遜，羅玉琴，曼爾丹，等．HPLC法測定維藥祖卡木膠囊中嗎啡的含量[J]．中國藥房，2009，20（27）：2 116－2 118．

[5]王二兵，趙正保，曲婷麗．HPLC測定消炎止咳片中嗎啡的含量[J]．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（15）：127－129．

[6]王衛(wèi)鋒，衛(wèi)偉光．HPLC測定固腸止瀉丸中嗎啡及鹽酸小檗堿的含量[J]．中成藥，2010，32（6）：967－970．

Content Determination of Morphine in Anticough Mixture by HPLC

Feng Jing，Yu Mengjun，Ouyang Bing，Lu Laichun
（Daping Hospital，Institute of Surgery Research，Third Military Medical University，Chongqing，China 400042）

Objective To establish an HPLC method of determining the content of morphine in Anticough Mixture．Methods The HPLC was used with a Welch Xtimate C8column（250 mm ×4．6mm，5 μm），the mobile phase consisted of acetonitril－0．025 mol／L potassium dihydrogen phosphate solution－0．002 5 mol／L sodium heptane－1－sulphonate（30∶85∶85，V／V／V）with a flow rate of 1．0 mL／min，the detective wavelength was 220 nm and the injection volume was 20 μL．Results The morphine showed good linear relationship with the peak area in the range of 1．008－20．16 μg／mL，r＝0．999 7（n＝7），and the average recovery rate was 99．16%，RSD＝1．28%(n＝9)．Conclusion The method is accurate and high sensitivity，it is suitable for the determination of morphine in Anticough Mixture．

HPLC；Anticough Mixture；morphine；content determination

R284．1；R286．0

A

1006－4931(2016)08－0064－03

2015－08－13)

中國人民解放軍軍隊醫(yī)療機構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項課題，項目編號：13ZJZ01－6。