丹參注射液對小牛血去蛋白提取物穩(wěn)定性的影響

陳艷春，單愛云，李春紅，顏 晗

（1．廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518034； 2．廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所，廣東 深圳 518057）

丹參注射液對小牛血去蛋白提取物穩(wěn)定性的影響

陳艷春1，單愛云1，李春紅1，顏 晗2

（1．廣東省深圳市福田區(qū)中醫(yī)院，廣東 深圳 518034； 2．廣東省深圳市藥品檢驗(yàn)所，廣東 深圳 518057）

目的 考察丹參注射液對小牛血去蛋白提取物（DCBE）在0．9%氯化鈉注射液中穩(wěn)定性的影響。方法 采用高效液相色譜法測定丹參注射液與小牛血去蛋白提取物注射液配伍液中氨基酸的含量變化，F(xiàn)olin－酚法測定多肽的含量，同時(shí)觀察配伍液的外觀、pH、微粒數(shù)變化。結(jié)果 配伍液在6 h內(nèi)的外觀、pH、含量均無明顯變化；不溶性微粒在2 h內(nèi)符合藥典規(guī)定，2 h后不符合藥典規(guī)定。結(jié)論 在臨床使用中，為了安全起見，丹參注射液和小牛血去蛋白提取物應(yīng)分開在不同輸液瓶中使用，且需使用間隔液。

丹參注射液；小牛血去蛋白提取物；穩(wěn)定性；高效液相色譜法

小牛血去蛋白提取物（DCBE）與丹參注射液聯(lián)合先后輸注時(shí)，在輸液管中是否存在配伍禁忌和是否需要使用間隔液的問題，藥品說明書中未作明確說明，且相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也較少。本研究模擬臨床用藥濃度考察丹參注射液對小牛血去蛋白提取物穩(wěn)定性的影響，旨在為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1．1 儀器

HP－1100型高效液相色譜儀；VWD型紫外檢測器；HP－1100型化學(xué)工作站；Delta320型pH計(jì)（Mettler公司）。

1．2 試藥

牛血清白蛋白對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)為 140619－201120，規(guī)格為每瓶24．9 mg）；氨基酸對照品（安捷倫科技公司，批號(hào)為BCBP5487V，規(guī)格為1 nmol／mL）；丹參注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號(hào)為1403061，規(guī)格為每支10 mL）；小牛血去蛋白提取物注射液（武漢人福制藥有限公司，批號(hào)為201614074－1，規(guī)格為每支400 mg）；0．9%氯化鈉注射液（廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號(hào)為L14050305，規(guī)格為每瓶500 mL）。

2 方法與結(jié)果

2．1 氨基酸含量測定

2．1．1 色譜條件

色譜柱：HP ODS Hypersil C18柱（200 mm×4．6 mm，5 μm）；流速：0．4 mL／min；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：10 μL；內(nèi)標(biāo)法；流動(dòng)相：A為0．1 mol／L醋酸鈉溶液（pH＝6．7）－乙腈（93∶7），B為乙腈－水（4∶1），線性梯度洗脫，0 min時(shí)0 B，12 min時(shí)15%B，30 min時(shí)34%B，31 min時(shí)100%B，40 min時(shí)100%B，41 min時(shí)0 B，50 min時(shí)0 B。

短鏈直鏈淀粉通過三個(gè)步驟形成球晶：（1）淀粉鏈結(jié)合成雙螺旋并形成簇；（2）結(jié)晶單元重排成納米顆粒；（3）顆粒生長成為聚集體[16,23]。

2．1．2 溶液制備

分別精密量取一定量的18種氨基酸對照品，溶于200 mL 0．1 mol／L的鹽酸中，使每種氨基酸的濃度約為 2．5 μmol／mL，并按一定配比制成 100，250，500，1 000 nmol／mL 4種濃度的氨基酸對照品溶液；精密稱取注射用小牛血去蛋白提取物400 mg，加入滅菌注射用水溶解至10 mL，即得供試品溶液；取供試品溶液1 mL，加入丹參注射液1 mL，混合均勻后真空干燥，再加水至 1 mL，即得混合供試品溶液；稱取正亮氨酸(Nle)適量，用0．1 mol／L的鹽酸溶解稀釋成0．5 g／L的溶液作為內(nèi)標(biāo)液。

精密量取氨基酸對照品溶液及供試品溶液各200 μL置1 mL離心管中，加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)液20 μL，加入1 mol／L的三乙胺－乙腈（139∶861）和0．1 mol／L的異硫氰酸苯酯（PITC）－乙腈（12∶988）各100 μL，搖勻，室溫放置1 h，加入正己烷400 μL，搖勻，靜置10 min，吸取下層溶液，用0．45 μm的濾膜濾過，即得衍生化的氨基酸對照品溶液和供試品溶液。

2．1．3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別取衍生化后的氨基酸對照品溶液和供試品溶液的濾液進(jìn)樣測定，以Nle為內(nèi)標(biāo)物，按內(nèi)標(biāo)法分別計(jì)算供試品中18種氨基酸的含量。以濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 18種氨基酸的線性方程、線性范圍及檢測限

精密度試驗(yàn)：精密量取氨基酸對照品混合溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，計(jì)算峰面積。結(jié)果的 RSD為0．58%（n＝5），表明儀器精密度良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的氨基酸對照品溶液加入原樣中，分別測量原樣和加入樣的氨基酸含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表2。

取供試品溶液，按2．1．1項(xiàng)下色譜條件，分別于0，1，2，4，6 h時(shí)自動(dòng)進(jìn)樣20 μL，測定峰面積，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)的相對百分含量，見表3。結(jié)果在6 h內(nèi)各氨基酸的峰形、含量和保留時(shí)間均無明顯變化，隨著混合時(shí)間的延長，混合液中各種氨基酸的含量變化不大，見圖1。

表2 18種氨基酸的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝18）

圖1 氨基酸含量測定高效液相色譜圖

2．2 多肽含量測定(Folin－酚法)

2．2．1 溶液制備

取氫氧化鈉10 g，碳酸鈉50 g，加水400 mL溶解，作為甲液。取酒石酸鉀0．5 g加水50 mL，使之溶解；另取硫酸銅0．25 g，加水30 mL使溶解，將2種溶液混合即得乙液。臨用前混合甲、乙2種溶液，加水至500 mL，制成堿性銅供試品溶液。取牛血清白蛋白對照品15 mg，加水50mL，制成每100mL含0．3mg牛血清白蛋白對照品溶液。

表3 DCBE中氨基酸含量與丹參、DCBE混合液中氨基酸的含量變化（ g／mL）

2．2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密量取對照品溶液0，0．1，0．3，0．5，0．7，0．9 mL，分別置試管中，各加水至1．0 mL，搖勻，分別加入堿性銅試劑1．0 mL，搖勻；各加入福林酚試劑4．0 mL，立即混勻；置55℃水浴中反應(yīng)5 min，再置冷水浴中10 min，按照藥典中分光光度法要求，在650 nm波長處測量吸光度。以0號(hào)試管作為空白，以對照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)(X)、相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行回歸，得回歸方程 Y＝19．24 X＋0．038 3。

2．2．3 含量測定

精密量取供試品溶液適量，分別于0，1，2，4，6 h時(shí)進(jìn)樣測定，通過回歸方程求得供試品溶液的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即得多肽含量。結(jié)果見表4。可見，小牛血去蛋白提取物的多肽含量與加入了丹參注射液的小牛血去蛋白提取物中的多肽含量無明顯差異。多肽是小牛血去蛋白提取物中的有效成分之一，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力。

2．3 配伍穩(wěn)定性試驗(yàn)

模擬臨床用量，將0．4 g小牛血去蛋白提取物加入0．9%氯化鈉注射液250 mL中，作為空白溶液；將0．4 g小牛血去蛋白提取物、20 mL丹參注射液加入250 mL 0．9%氯化鈉注射液中作為配伍溶液，在室溫（20±1）℃下，分別于0，1，2，4，6 h時(shí)進(jìn)行下述項(xiàng)目的考察。

外觀考察：在室溫（20±1）℃下6 h內(nèi)，配伍溶液外觀均為棕紅色液體，未見明顯顏色變化，無沉淀和氣體產(chǎn)生。

表4 多肽含量測定結(jié)果(n＝5)

pH考察：各樣品溶液在室溫下放置6 h的pH變化見表5。

表5 各樣品溶液pH變化測定結(jié)果

微粒數(shù)考察：對于標(biāo)示裝量為100 mL以上的靜脈用注射液，藥典規(guī)定每1 mL中含粒徑不小于10 μm的微粒不得超過25粒，不小于25 μm的微粒不得超過3粒[1]。各樣品溶液在6 h內(nèi)不溶性微粒的考察結(jié)果見表6。

試驗(yàn)結(jié)果表明，在室溫（20±1）℃下，丹參注射液與小牛血去蛋白提取物在0．9%氯化鈉注射液中配伍后，其外觀、pH均無明顯變化，但隨著時(shí)間的延長，不溶性微粒數(shù)逐漸增加。

3 討論

小牛血去蛋白提取物是從發(fā)育旺盛的健康小牛血中提取的一種生物活性物質(zhì)，含天然氨基酸、小分子肽、糖脂、核苷、碳水化合物及其他生物活性物質(zhì)，主要用于缺血性腦血管病的神經(jīng)保護(hù)治療[2]，在臨床主要用于神經(jīng)科，常與活血化瘀類中藥注射劑聯(lián)合使用，療效優(yōu)于單用。

中藥注射劑成分復(fù)雜，若與其他藥物配伍不當(dāng)，則會(huì)產(chǎn)生一系列變化，包括溶液的pH、顏色、澄明度改變及藥效的協(xié)同和拮抗作用，進(jìn)而影響藥效，甚至產(chǎn)生不良反應(yīng)。本研究中嘗試選出代表藥物丹參注射液，將其與小牛血去蛋白提取物模擬臨床用藥濃度混合，判定其在輸液管中接觸時(shí)是否發(fā)生配伍反應(yīng)和是否需要使用間隔液，以期為小牛血去蛋白提取物的臨床安全、合理、有效使用，減少藥源性疾病，完善說明書提供參考依據(jù)。

多肽含量測定中，F(xiàn)olin－酚試劑由甲、乙兩部分試劑組成，甲試劑使肽鍵在堿性條件下與堿性銅試劑中的Cu2＋作用生成紫紅色絡(luò)合物；在堿性條件下，乙試劑中的磷鉬酸－磷鎢酸被絡(luò)合物還原生成藍(lán)色物質(zhì)，通過藍(lán)色的比色測定多肽的含量。

本研究中用Lowry法對小牛血去蛋白提取物與丹參注射液配伍液進(jìn)行多肽含量測定[3]，試驗(yàn)結(jié)果顯示，多肽含量無明顯變化。采用高效液相色譜（HPLC）法測定配伍液中游離氨基酸的含量變化[4－6]，結(jié)果顯示氨基酸含量無明顯變化。配伍液在0．9%氯化鈉注射液中6 h內(nèi)，外觀、pH也無明顯變化，但不溶性微粒數(shù)卻隨著時(shí)間的延長明顯增加，混合液在2 h后，不溶性微粒數(shù)已超過藥典規(guī)定。不溶性微粒是考察配伍液臨床使用的重要指標(biāo)，其進(jìn)入人體有可能造成嚴(yán)重危害，如血栓、靜脈炎、肉芽腫、熱原樣反應(yīng)等。因此，小牛血去蛋白提取物與丹參注射液混合液雖在2 h內(nèi)不溶性微粒數(shù)符合藥典規(guī)定，但在臨床使用中為了安全起見，這2種藥物還是應(yīng)分開在不同的輸液瓶中使用，且需使用間隔液。

[1]國家藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典（二部）[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄71－附錄73．

[2]楊瑞芬，彭家鋼，張 荻，等．高效液相色譜法測定丹參注射液丹參素與原兒茶醛含量[J]．醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2008，27（2）：230－231．

[3]任淑萍．小牛血清去蛋白注射液與小牛血去蛋白注射液有效成分含量和生物活性的比較[J]．中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2006，5（8）：767－769．

[4]趙宗閣，王尊文，徐康森．國內(nèi)小牛血、小牛血清去蛋白提取物注射液質(zhì)量分析及其抗缺氧作用研究[J]．藥物分析雜志，2008，28（10）：1 637－1 640．

[5]李愛菊，鄭宏強(qiáng)，熊愛琴．小牛血去蛋白提取物注射液中游離氨基酸的含量測定[J]．中國藥業(yè)，2006，15（7）：40．

[6]杜秀芳，劉偉娜，吳海燕，等．高效液相色譜法考察丹紅注射液與10%氯化鉀注射液配伍的穩(wěn)定性[J]．時(shí)珍國醫(yī)國藥，2008，19（6）：1 342－1 343．

Influence of Danshen Injection on the Compatibility of Deproteinized Calf Blood Extract

Chen Yanchun1，Shan Aiyun1，Li Chunhong1，Yan Han2
（1．The Traditional Chinese Medicine Hospital of Futian District，Shenzhen，Guangdong，China 518034； 2．Shenzhen Institute for Drug Control，Shenzhen，Guangdong，China 518057）

Objective To study the influence of Danshen Injection on the compatibility of deproteinized calf blood extract in 0．9% sodium chloride．M ethods HPLC method was used to determine the content change of amino acids in the mixture of deproteinized calf blood extract injection and Danshen Injection．Folin－phenol method was used to determine the content of polypeptide，and the changes of the physical appearance，pH and particle count in the mixture were also examined．Results No significant changes in content，pH，or physical appearance were found within 6 h in the mixture；the amount of insoluble paticles accorded with the Chinese Pharmacopoeia within 2 h，and exceeded beyond which was permitted after 2 h．Conclusion For clinical safety concerns，deproteinized calf blood extract injection cannot be mixed with Danshen Injection，and the two should be separated by an infusion solution．

Danshen Injection；deproteinized calf blood；compatibility；HPLC

R969．2；R977．6

A

1006－4931(2016)08－0029－05

2015－11－14)