香菇、靈芝多糖硒配合工藝的研究*

孫浩然孟慶彬郭　興

（1.伊春林業(yè)管理局，黑龍江　伊春　153000；2.伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江　伊春　153000）

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香菇、靈芝多糖硒配合工藝的研究*

孫浩然1孟慶彬2郭興2

（1.伊春林業(yè)管理局，黑龍江伊春153000；2.伊春林業(yè)科學(xué)院，黑龍江伊春153000）

摘要：通過單因素和正交試驗(yàn)，以硒螯合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析了多糖濃度、pH值、亞硒酸鈉濃度、溫度4個(gè)因素對(duì)香菇和靈芝粗多糖硒螯合效率的影響，確定多糖硒配合物制備的最佳工藝條件。結(jié)果表明，優(yōu)化的香菇多糖硒配合物合成工藝為：多糖濃度2 mg/mL，pH值5.0，亞硒酸鈉濃度6 mg/mL，溫度80℃；靈芝多糖硒配合物的最優(yōu)合成工藝為：多糖濃度2 mg/mL，pH值5.0，亞硒酸鈉濃度4 mg/mL，溫度為60℃。

關(guān)鍵詞：香菇；靈芝；多糖；Se；螯合

*黑龍江省森林工業(yè)總局應(yīng)用研究項(xiàng)目（sgzjY2011020）

香菇和靈芝是兩種較為常見的食用菌，其中含有大量生物活性成分——多糖；而多糖具有多種藥理功能，可抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移，調(diào)節(jié)人體免疫功能，抗衰老[1 - 3 ]。硒多糖的研究在國內(nèi)外少見報(bào)道，但由于其獨(dú)特的生理活性，已經(jīng)成為近年來研究的熱點(diǎn)。

本研究通過單因素試驗(yàn)，以硒螯合率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分析了多糖濃度、pH值、亞硒酸鈉濃度和溫度4因素對(duì)香菇、靈芝粗多糖硒螯合效率的影響；根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行3水平正交試驗(yàn)。以多糖硒螯合率為指標(biāo)，確定多糖硒配合物制備的最佳工藝條件，為香菇多糖和靈芝多糖補(bǔ)硒劑的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1　試驗(yàn)材料與方法

1.1材料與儀器

試驗(yàn)用香菇和靈芝菌株為9608和G9；葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、亞硒酸鈉、冰乙酸、氯仿、正丁醇、鹽酸等，均為分析純，北京化工廠制品；硒標(biāo)準(zhǔn)液（1 000 mg/L），中國計(jì)量科學(xué)研究院提供。

HZ- 2111KB立式震蕩培養(yǎng)箱，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司出品；BAO- 35A精密鼓風(fēng)干燥箱，施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司出品；TU- 1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司出品；AA- 6800型原子吸收分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司出品。

1.2香菇多糖和靈芝多糖的制備

將菌株接種于CYM培養(yǎng)基中，于28℃、150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)，將獲得的菌絲體過濾、烘干；再置于85℃水浴鍋中浸提5 h，調(diào)節(jié)pH值至7.0，離心得上清液。利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮上清液后，以3倍體積的75%乙醇醇沉濃縮液中的多糖，4℃靜置過夜后，傾去醇沉多糖的上清液，3 000 r/min離心10min后分級(jí)沉淀法純化粗多糖，真空干燥[4- 5]。將干燥的多糖溶于水，扎袋流水透析除鹽后，透析液經(jīng)減壓濃縮、醇析、離心、真空干燥，得精制多糖。蒽酮比色法測(cè)定多糖含量[6]。

式中，C為提取溶液中粗多糖濃度(mg/mL)；V為提取溶液總體積(mL)；M為提取菌絲體干重(mg)。

1.3單因素對(duì)硒螯合率的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)

多糖濃度稱取亞硒酸鈉，溶于30 mL蒸餾水中，配成濃度為6 mg/mL的溶液；另準(zhǔn)確稱取適量的多糖放入其中，分別配制成多糖濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值為6；70℃水浴2 h后，加無水乙醇醇沉，再離心、扎袋流水透析除鹽，經(jīng)反復(fù)醇沉、真空干燥，最終制得多糖硒配合物，進(jìn)行硒(Se)含量的測(cè)定。

pH值稱取亞硒酸鈉溶于30 mL蒸餾水中，配成濃度為6 mg/mL的溶液；另準(zhǔn)確稱取適量的多糖放入其中，配制成多糖濃度為4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值為分別為3、4、5、6、7。后續(xù)其它操作同上。

亞硒酸鈉濃度稱取亞硒酸鈉溶于30 mL蒸餾水中，配成濃度為2、4、6、8、10 mg/mL的溶液；另準(zhǔn)確稱取適量的多糖放入其中，配制成多糖濃度為4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值為6。后續(xù)其它操作同上。

溫度稱取亞硒酸鈉溶于30 mL蒸餾水中，配成濃度為6 mg/mL的溶液，另準(zhǔn)確稱取適量的多糖放入其中，配制成多糖濃度為4 mg/mL的溶液，加冰乙酸形成透明溶液，使其pH值為6。分別在溫度為40、50、60、70、80℃水浴2 h后，進(jìn)行后續(xù)操作（同上）。

1.4正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別選取4因素的3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（表1），以多糖硒螯合率為指標(biāo)，確定最佳工藝條件。

1.5多糖硒配合物中硒含量測(cè)定方法

制作硒標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確量取硒標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，用純水定容至1 000 mL，得濃度為1 μg/mL的母液；分別量取母液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，并定容至10 mL，得Se濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20 μg/mL。用石墨爐原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度值，并計(jì)算出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

表1　正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

硒多糖溶液的配制：精確稱取硒多糖0.1 g，加純凈水定容至100 mL于容量瓶中；然后分別取0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL于10 mL容量瓶中，用純凈水定容至刻度。用石墨爐原子吸收檢測(cè)Se2+的濃度[ 7 ]。螯合率的計(jì)算

式中，A為硒螯合率(%)；C0為螯合前溶液中硒離子濃度（mg/mL）；C為螯合后溶液中硒離子濃度（mg/mL）。

2　結(jié)果與分析

2.1香菇多糖和靈芝多糖含量的測(cè)定

由300 mL CYM培養(yǎng)基中產(chǎn)出香菇9608和靈芝G9菌絲體，干重分別為2.04 g和3.55 g；經(jīng)熱水煮沸法提取多糖，再通過分級(jí)沉淀法純化透析后分別得精多糖0.36g和0.49g，多糖得率分別為7.2% 和4.7%。620 nm波長下由蒽酮硫酸法測(cè)定可溶性多糖的含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.753 4X+ 0.0432（R2=0.9933）。

2.2香菇多糖和靈芝多糖硒配合物單因素分析2. 2. 1多糖濃度對(duì)硒螯合率的影響

香菇多糖硒螯合率在多糖濃度為4 mg/mL時(shí)硒螯合率最大為14.57%，當(dāng)反應(yīng)液多糖濃度由6 mg/mL增加至10 mg/mL時(shí)硒螯合率略有降低；靈芝多糖硒螯合率在多糖濃度為4 mg/mL時(shí)硒螯合率最大為12.22%，當(dāng)反應(yīng)液多糖濃度從6 mg/mL增加至10 mg/mL時(shí)硒螯合率略有降低（圖1）。當(dāng)多糖濃度增加到一定量時(shí)，反應(yīng)液中達(dá)到飽和，繼續(xù)增加多糖可能會(huì)阻礙多糖與金屬離子的螯合，為正向飽和后出現(xiàn)的解離現(xiàn)象。

圖1　多糖濃度對(duì)硒螯合率的影響

從螯合率和成本上考慮，香菇多糖硒最佳多糖濃度取4 mg/mL；靈芝多糖硒最佳多糖濃度為4 mg/mL。

2.2.2 pH值對(duì)硒螯合率的影響

香菇多糖硒螯合率隨著pH值的升高而增大，反應(yīng)液pH值為3時(shí)硒螯合率為7.20%，當(dāng)pH值增大到6時(shí)硒螯合率為8.16%，但當(dāng)pH值為7時(shí)硒螯合率降低了0.63%；靈芝多糖硒螯合率隨著pH值的升高而增大，反應(yīng)液pH值為3時(shí)硒螯合率為5.13%，pH值增大到5時(shí)硒螯合率為6.60%，當(dāng)pH值為7時(shí)硒螯合率降低了0.75%（圖2）。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，反應(yīng)液的pH值對(duì)Se2+離子強(qiáng)度有一定影響。pH值過大，會(huì)使陰離子與多糖分子的活性基團(tuán)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用，進(jìn)而阻礙配合物的形成；pH值過小，反應(yīng)液中生成的氫離子增多，導(dǎo)致硒離子螯合不完全。從圖2可以看出，香菇多糖硒螯合最佳pH值為6；靈芝多糖硒螯合最佳pH值為5。

圖2　 pH值對(duì)硒螯合率的影響

2. 2. 3亞硒酸鈉濃度對(duì)硒螯合率的影響

香菇多糖硒螯合率在亞硒酸鈉濃度為2、4、6 mg/mL時(shí)，隨著亞硒酸鈉濃度的增加而增大，濃度為6 mg/mL時(shí)硒螯合率最大為8.10%，當(dāng)濃度增加至10 mg/mL時(shí)，硒螯合率逐漸降低（圖3）；靈芝多糖硒螯合率在亞硒酸鈉濃度為4 mg/mL時(shí)，硒螯合率最大為5.61%，當(dāng)濃度從4 mg/mL增至10 mg/mL時(shí)硒螯合率逐漸降低。

圖3　亞硒酸鈉濃度對(duì)硒螯合率的影響

當(dāng)亞硒酸鈉濃度增加到一定量時(shí)，反應(yīng)液中達(dá)到飽和，繼續(xù)增加亞硒酸鈉可能會(huì)阻礙多糖與金屬離子的螯合，為正向飽和后出現(xiàn)的解離現(xiàn)象。從圖3中可以看出，香菇多糖硒最佳亞硒酸鈉濃度為6 mg/mL；靈芝多糖硒最佳亞硒酸鈉濃度為4 mg/mL。

2.2.4溫度對(duì)硒螯合率的影響

香菇多糖硒和靈芝多糖硒螯合率均隨著溫度的升高而增大，溫度為70℃時(shí)硒螯合率最大，分別為7.88%和5.03%；當(dāng)反應(yīng)液溫度升高至80℃時(shí)硒螯合率逐漸降低（圖4）。

一定范圍內(nèi)的溫度升高，有利于溶液中的分子運(yùn)動(dòng)，使螯合率升高，但反應(yīng)液溫度過高時(shí)，分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，離子振動(dòng)劇烈，不利于多糖配體與聚合硒核間接觸發(fā)生配合。從圖4中可以看出，香菇多糖硒和靈芝多糖硒的最佳螯合溫度均為70℃。

圖4　溫度對(duì)硒螯合率的影響

2. 3正交試驗(yàn)結(jié)果分析

根據(jù)表2得知，各因素影響香菇多糖硒螯合率的主次順序是A＞C＞D＞B，說明在此正交試驗(yàn)中，多糖濃度對(duì)香菇多糖硒螯合率的影響最大，pH值的影響最小。

表2　香菇多糖硒螯合正交試驗(yàn)結(jié)果

最優(yōu)水平為A1B1C2D3，即多糖濃度為2 mg/mL，pH值為5.0，亞硒酸鈉濃度為6 mg/mL，溫度為80℃；在最佳條件下香菇多糖硒螯合率可達(dá)到23.16%。

表3　靈芝多糖硒螯合正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各因素影響靈芝多糖硒螯合率的主次順序是A＞D＞C＞B，即多糖濃度對(duì)靈芝多糖硒螯合率影響最大，其次是溫度，再次是亞硒酸鈉濃度，最后是pH值。

最優(yōu)水平為A1B1C1D1，即多糖濃度為2 mg/mL，pH值為5.0，亞硒酸鈉濃度為4 mg/mL，溫度為60℃。在最佳條件下靈芝多糖硒的螯合率可達(dá)到12.90%。

3　結(jié)　論

3.1通過對(duì)香菇和靈芝菌絲體多糖的提取試驗(yàn)，結(jié)果多糖得率分別為7.2%和4.7%。

3.2單因素試驗(yàn)分析結(jié)果顯示，各因素影響香菇多糖硒螯合率的主次順序是：多糖濃度＞亞硒酸鈉濃度＞溫度＞pH值；影響靈芝多糖硒螯合率的主次順序是：多糖濃度＞溫度＞亞硒酸鈉濃度＞pH值。

3.3正交試驗(yàn)優(yōu)化出的香菇多糖硒配合物合成工藝為：多糖濃度2 mg/mL，pH值5.0，亞硒酸鈉濃度6 mg/mL，溫度80℃；靈芝多糖硒配合物合成工藝為：多糖濃度2 mg/mL，pH值5.0，亞硒酸鈉濃度4 mg/mL，溫度60℃。

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（責(zé)任編輯：潘啟英）

Study on the Selenium and Selenium Complex Process of Mushroom and Ganoderma lucidum

SUNHaoran
（Forestry Administration Bureau, Heilongjiang YiChun 153000）

Abstract Through single factor and orthogonal experiments, using selenium chelate rate as the evaluation index, analysis of the polysaccharide concentration, pH value, effect of sodium selenite concentration and temperature of Lentinus edodes and Ganoderma lucidum crude organoselenium sugar chelating efficiency to determine selenium polysaccharide with the optimum conditions of the preparation. With the optimization results of lentinan selenium polysaccharide concentration was 2 mg / mL, pH value of 5.0 for the synthesis process, sodium selenite concentration 6 mg / mL, temperature of 80 DEG C; Ganoderma lucidum polysaccharide selenium with the synthesis process for polysaccharide concentration was 2 mg / mL, the pH value was 5.0, sodium selenite concentration of 4 mg / mL temperature 60 degrees.

Key words Mushrooms；Ganoderma lucidum；Polysaccharide；Se；Chelate

收稿日期：2015 - 09 - 23

作者簡介：第1孫浩然（1963-），男，碩士，高級(jí)工程師，伊春林業(yè)管理局副局長。

文章編號(hào)：1001 - 9499（2016）01 - 0035 - 04

中圖分類號(hào)：S646. 1+2, S567. 3+1, Q946

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A