佐劑在肺炎鏈球菌疫苗免疫中的作用*

張　靜 綜述，崔亞利，江詠梅 審校

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 610041)

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·綜述·

佐劑在肺炎鏈球菌疫苗免疫中的作用*

張靜 綜述，崔亞利，江詠梅△審校

(四川大學(xué)華西第二醫(yī)院檢驗(yàn)科,成都 610041)

霍亂毒素；肺炎鏈球菌疫苗；佐劑

肺炎鏈球菌是引起各年齡組高發(fā)病率和病死率的主要病原菌，其疫苗的研制和使用對(duì)肺炎鏈球菌感染的防治具有重要意義。但目前臨床能投入使用的疫苗卻較少，主要有23價(jià)多糖疫苗和7、10、13價(jià)多糖蛋白結(jié)合疫苗，原因之一是缺乏能用于人體的高效的免疫佐劑。肺炎鏈球菌疫苗常用的佐劑主要有：霍亂毒素(cholera entero toxin,CT)、大腸桿菌不耐熱腸毒素(heat-labile enterotoxin LT)、乳酸乳球菌(lactococcus lactis)、DNA疫苗佐劑、鋁劑等。本文對(duì)肺炎鏈球菌疫苗中常用的幾種佐劑的免疫效應(yīng)進(jìn)行了綜述，為肺炎鏈球菌疫苗及免疫佐劑的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研制提供參考資料。

1　常用肺炎鏈球菌疫苗佐劑及作用機(jī)制

1.1CTCT是霍亂弧菌分泌的一種不耐熱腸毒素，由1個(gè)A 亞單位和5個(gè)B 亞單位構(gòu)成[1]。A亞單位為毒性單位，可引起機(jī)體腹瀉，包含A1和A2兩種肽鏈，A1 肽鏈具有腺苷二磷酸(ADP)核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，能催化腸道上皮細(xì)胞表面環(huán)磷酸腺苷復(fù)合物中三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)結(jié)合蛋白腺苷二磷酸核糖化反應(yīng)。A2肽鏈則通過(guò)與B 亞單位結(jié)合參與受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用中的轉(zhuǎn)位作用。B 亞單位能特異性地同時(shí)與真核生物腸上皮細(xì)胞的5個(gè)神經(jīng)節(jié)苷脂神經(jīng)節(jié)苷脂1(GM1)結(jié)合[2]，它們之間的這種交互作用可增強(qiáng)機(jī)體對(duì)疾病的感應(yīng)。已有學(xué)者提出CTB可有效增強(qiáng)自身免疫病及過(guò)敏性疾病的治療效果[3]。CTB與抗原共同經(jīng)鼻或口服免疫，不僅誘導(dǎo)局部黏膜發(fā)生免疫反應(yīng)，同時(shí)遠(yuǎn)隔部位其他黏膜也可產(chǎn)生。其免疫反應(yīng)的機(jī)制可能如下：(1)誘導(dǎo)腸黏膜離子通道和載體的表達(dá)，增加分泌黏蛋白的表達(dá)[4]，也可通過(guò)改變抗原的物理性狀和增加腸黏膜通透性來(lái)增加抗原的攝入量。(2)增強(qiáng)抗原遞呈細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞)呈遞抗原的能力[5]。(3)增強(qiáng)細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、IL-10，而非IL-2、IL-12、干擾素γ(IFN-γ)的產(chǎn)生及誘導(dǎo)以Th17為主的免疫反應(yīng)[6]，也可通過(guò)激活腸黏膜淋巴細(xì)胞核因子κB(NF-κB)通路增強(qiáng)免疫效應(yīng)[7]。(4)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗炎反應(yīng)，促進(jìn)Th2型反應(yīng)，抑制Th1型反應(yīng)，增強(qiáng)IgA的產(chǎn)生。(5)調(diào)節(jié)黏膜相關(guān)淋巴組織T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)生長(zhǎng)環(huán)境。

CT作為免疫佐劑主要有兩種使用方式：一種是與抗原形成嵌合或融合蛋白進(jìn)行免疫，另一種是與抗原簡(jiǎn)單的混合共同免疫，這兩種方法對(duì)免疫效應(yīng)的影響是不同的。目前肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如肺炎鏈球菌表面蛋白A(PsaA)與CTB融合，形成融合蛋白，融合的PsaA-CTB免疫原性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單獨(dú)的PsaA或CTB，經(jīng)鼻或經(jīng)口免疫可誘導(dǎo)系統(tǒng)的及局部的免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生大量IgG和IgA，其中由Th2型免疫反應(yīng)介導(dǎo)的抗體亞型IgG1、IgG2a滴度最高。雖然CT已廣泛用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但因其具有強(qiáng)毒性，在人體的使用仍受到限制，目前，已有研究通過(guò)對(duì)CTA區(qū)域進(jìn)行肽鏈融合及對(duì)CT的活性中心進(jìn)行定點(diǎn)誘變來(lái)減弱CT的毒性[3]。

1.2LTLT由產(chǎn)毒性大腸桿菌產(chǎn)生，其三維結(jié)構(gòu)與CT極為相似，由1個(gè)A亞單位和5個(gè)B亞單位組成，A亞單位具有ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性，B亞單位則可與細(xì)胞結(jié)合[8]。根據(jù)基因、生化、免疫學(xué)方面的差異，可將LT分為L(zhǎng)TⅠ和LTⅡ，通常所說(shuō)的LT 一般是指Ⅰ型大腸桿菌不耐熱腸毒素，而LT Ⅱ與人類(lèi)疾病無(wú)關(guān)，在自然界很少見(jiàn)。LT通過(guò)腸道黏液的分泌來(lái)激活A(yù)亞單位，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。LTA 是LTⅠ的毒性亞基，可引起機(jī)體發(fā)生水性腹瀉。目前，有些研究者通過(guò)突變LT中的某些氨基酸位點(diǎn)，去除毒性而保留其作為佐劑的免疫原性。LTB 無(wú)毒性且具有良好的黏膜佐劑活性，可作為黏膜免疫的佐劑。LTB通過(guò)與免疫細(xì)胞表面的受體結(jié)合而發(fā)揮作用。目前，LT作為佐劑已可通過(guò)黏膜(滴鼻、舌下、口服、直腸)、局部外用(經(jīng)皮)、腸外(皮下、皮內(nèi))等免疫途徑與免疫原共同用于機(jī)體免疫。LT可能通過(guò)調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子的水平，如 IFN-γ、IL-4、IL-10等來(lái)增強(qiáng)免疫效應(yīng)。

1.3乳酸乳球菌乳酸乳球菌是一種革蘭陽(yáng)性菌，在發(fā)酵及食品保存中廣泛應(yīng)用，被美國(guó)食品與藥品管理局(food and drug administration,FDA)認(rèn)證為安全級(jí)微生物(generally regarded as safe,GRAS)。乳酸乳球菌基本不在胃腸道內(nèi)定植，不會(huì)危害腸道內(nèi)正常益生菌群和造成基因污染，并可避免長(zhǎng)期定植帶來(lái)的耐受[9]?；畹幕驕缁畹娜樗崛榍蚓际禽^好的疫苗載體[10]，能誘導(dǎo)特定人群如嬰幼兒、老年人、免疫抑制人群產(chǎn)生有效的免疫反應(yīng)。乳酸乳球菌本身分泌蛋白較少，可減少載體微生物自身蛋白對(duì)外源分泌蛋白的干擾，不產(chǎn)生任何胞外蛋白酶，不會(huì)引起抗原蛋白降解，表達(dá)的重組蛋白不需純化[11]。乳酸乳球菌可激活Toll樣受體，能刺激、活化免疫細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)[12]。重組乳酸乳球菌已成功用于表達(dá)多種異種抗原，可作為多種病原菌及病毒的佐劑[13]。目前，對(duì)乳酸乳球菌在各種疫苗中的應(yīng)用研究已取得了一定成果，但僅限于臨床前期研究階段，對(duì)乳酸乳球菌特性、增強(qiáng)抗原免疫原性、產(chǎn)生免疫應(yīng)答的機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白，如PspA[14]、肺炎鏈球菌保護(hù)蛋白(PppA)與活的或滅活的乳酸菌經(jīng)黏膜或經(jīng)口免疫小鼠[13]，都可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生系統(tǒng)的、局部的免疫反應(yīng)，其免疫效應(yīng)高于用鋁劑作為佐劑的效應(yīng)。但由于重組乳酸菌表達(dá)的抗原不同，誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體類(lèi)型也有所不同。

1.4DNA疫苗佐劑鳥(niǎo)嘌呤核苷酸(CpG) DNA序列由胞嘧啶核苷酸和CpG為基序組成，在DNA疫苗載體骨架中導(dǎo)入該基序，能夠快速活化T、B細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子及多價(jià)IgM，增強(qiáng)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅱ類(lèi)分子、CD40、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)的表達(dá)，并能促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞的增殖與成熟。用肺炎鏈球菌候選疫苗蛋白PspA與Flt3配體(pFL)和CpG寡脫氧核苷酸(ODN)聯(lián)合免疫2歲齡的小鼠，可誘導(dǎo)產(chǎn)生與幼鼠相似的免疫反應(yīng)，主要是Th1、Th2型反應(yīng)，并可誘導(dǎo)小鼠上呼吸道的成熟DCs[15]。并且在鼻黏膜相關(guān)淋巴組織(NALT)、頸部淋巴結(jié)(CLNs)表面可檢測(cè)到表達(dá)MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86等黏附分子的CD11b+、CD8+、 B220+DCs。pFL誘導(dǎo)的CD8+DC對(duì)Th2型細(xì)胞因子介導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)具有重要作用。CpG ODN通過(guò)激活類(lèi)漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞表面的Toll樣受體9(TLR9)，進(jìn)一步介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的激活[16]，TLR9介導(dǎo)的免疫反應(yīng)在免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要作用，CpG DNA疫苗佐劑可有效地誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)，是一種高效的黏膜免疫佐劑[17]。

1.5鋁鹽佐劑鋁鹽佐劑從19世紀(jì)30年代開(kāi)始已廣泛用于疫苗中，且是美國(guó)惟一批準(zhǔn)的可用于臨床的疫苗佐劑。鋁鹽佐劑能輔助疫苗快速地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，增強(qiáng)細(xì)胞因子如IL-1β的分泌。但是一些研究者認(rèn)為炎癥因子并不參與鋁鹽佐劑誘導(dǎo)的機(jī)體免疫反應(yīng)[18]。鋁劑與抗原共同免疫能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)的、高濃度的IgG抗體[19]。由于鋁劑對(duì)機(jī)體的生物反應(yīng)性，它也可作為有效的過(guò)敏性免疫治療的佐劑。盡管鋁劑已用于臨床多年，但其誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的機(jī)制仍然不清楚。

2　其他肺炎鏈球菌疫苗佐劑

肺炎鏈球菌疫苗候選蛋白除與上述幾種常用佐劑可共同作用發(fā)揮免疫保護(hù)作用外，還可與如細(xì)菌鞭毛蛋白(vibrio vulnificus flagellin,FlaB)、納米凝膠(nanogel，consisting of a cationic cholesteryl group-bearing pullulan,cCHP)、IL-12等共同免疫而增強(qiáng)機(jī)體的免疫效應(yīng)。

2.1FlaBFlaB在細(xì)菌體內(nèi)高度表達(dá)且生物學(xué)功能穩(wěn)定，作為疫苗及免疫治療的佐劑對(duì)黏膜具有很強(qiáng)的免疫刺激作用。FlaB是TLR5 的配體，是種類(lèi)有限的受體激動(dòng)劑之一，可直接結(jié)合表達(dá)TLR5的免疫細(xì)胞，激活NF-κB途徑，促進(jìn)細(xì)胞因子的分泌。將FlaB與PspA融合組成重組蛋白：FlaB-PspA 和 PspA-FlaB，分別免疫小鼠，結(jié)果顯示FlaB-PspA組小鼠存活率較高，并有大量的IL-4產(chǎn)生，但兩組小鼠的IFN-γ水平無(wú)差別，并且IgG1滴度高，IgG2a滴度低，這都表明FlaB刺激機(jī)體主要產(chǎn)生Th2型反應(yīng)[20]。

2.2cCHPcCHP是一種納米凝膠制劑，用重組的cCHP-PspA免疫小鼠可抵抗肺炎鏈球菌致死性感染，減少肺炎鏈球菌在宿主上下呼吸道黏膜的定植及侵襲，增強(qiáng)細(xì)菌在支氣管黏膜及肺部的清除，誘導(dǎo)機(jī)體系統(tǒng)的及局部的黏膜免疫反應(yīng)[21]。研究表明cCHP-PspA經(jīng)鼻黏膜免疫，是一種有效、安全的免疫方式，不會(huì)引起嗅球及中樞神經(jīng)系統(tǒng)受損[22]。主要誘導(dǎo)黏膜產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th2 和Th17型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的IL-4 和 IL-13等細(xì)胞因子。

2.3IL-12IL-12是一種調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)CD4+T、CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生免疫反應(yīng)，刺激Th1和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等細(xì)胞因子，也可增強(qiáng)固有免疫反應(yīng)，促進(jìn)感染部位中性粒細(xì)胞的聚集[23]。肺炎鏈球菌的清除主要通過(guò)調(diào)理吞噬作用，用IL-12作佐劑經(jīng)鼻黏膜免疫小鼠可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生系統(tǒng)的、局部的免疫反應(yīng)，其中IgM、IgG2a的滴度較高，而IgG1的滴度與不加佐劑組相比無(wú)差異，IgG3在無(wú)佐劑組則不能檢測(cè)到。IL-12作佐劑可減少肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，曾有文獻(xiàn)報(bào)道，IL-12作為PPS疫苗佐劑經(jīng)皮下免疫具有顯著的毒性作用，但是也有其他研究表明IL-12經(jīng)鼻黏膜免疫與經(jīng)注射途徑給藥相比所產(chǎn)生的毒性作用較小。

3　展　　望

同種類(lèi)的疫苗選擇不同的免疫佐劑對(duì)免疫效應(yīng)的影響不同。開(kāi)發(fā)研制新型的免疫佐劑以增強(qiáng)疫苗的免疫效力并減少疫苗的毒副作用將是未來(lái)的發(fā)展趨勢(shì)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，對(duì)相關(guān)載體和佐劑的研究將極大地推動(dòng)其在免疫中的應(yīng)用。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2016.25.037

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81301399)。

張靜(1989-)，在讀碩士，主要從事肺炎鏈球菌致病機(jī)制及蛋白疫苗研發(fā)的分子生物學(xué)研究。

,E-mail:jiangyongmei-1@163.com。

R446

A

1671-8348(2016)25-3565-03

2016-03-18

2016-05-15)