內(nèi)毒素對人外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響

傅慶榮，陳莉，盧建文，黃水慶，鄧來明，肖正華（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣東廣州510180）

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內(nèi)毒素對人外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響

傅慶榮，陳莉，盧建文，黃水慶，鄧來明，肖正華
（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院，廣東廣州510180）

摘要：目的觀察不同濃度脂多糖（LPS）對外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）體外向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的影響。方法取健康成人PBMCs，以血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）進(jìn)行誘導(dǎo)，加入不同濃度的LPS干預(yù)處理，倒置相差顯微鏡下觀察PBMCs的形態(tài)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表達(dá)CD31和血管假性血友病相關(guān)因子（vWF）。結(jié)果體外培養(yǎng)的PBMCs呈貼壁生長，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)歷小圓形→梭形→扁平細(xì)胞的演變過程。與對照組比較，0.01μg/ml LPS組最后形成的梭形細(xì)胞數(shù)增加，隨著LPS濃度進(jìn)一步增加，細(xì)胞數(shù)呈遞減趨勢。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，0.01μg/ml LPS組，CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；0.10μg/ml LPS組CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)無明顯改變（P>0.05）；隨著LPS濃度進(jìn)一步增加，CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)呈減少趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論0.01μg/ml LPS能最大限度地促進(jìn)PBMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化，隨著LPS濃度增加，PBMCs分化呈抑制作用，這可能與LPS激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的數(shù)量及亞單位不同有關(guān)。

關(guān)鍵詞：內(nèi)毒素；外周血單個(gè)核細(xì)胞；血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞分化

目前，對干細(xì)胞移植治療缺血性疾病的研究已日趨廣泛。一定條件下的干細(xì)胞可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，同時(shí)能夠分泌大量的促血管生成因子。通過干細(xì)胞移植，可促進(jìn)缺血肢體的新生血管形成，最終達(dá)到治療缺血的目的。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）與骨髓、臍血來源的成體干細(xì)胞比較，具有采集無痛苦、容易獲取、患者易接受等優(yōu)點(diǎn)，成為細(xì)胞移植治療的研究熱點(diǎn)。本研究通過脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）干擾外周血單個(gè)核細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化，探討LPS對該過程的影響及其可能的機(jī)制。

1　材料與方法

1.1材料

無菌條件下取健康成人外周血20 ml，F(xiàn)icoll淋巴細(xì)胞分離液（美國康寧公司），達(dá)爾伯克必需基本培養(yǎng)基（dulbecco's minimum essential medium，DMEM）/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）（美國Pepro Tech公司），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（美國Pepro Tech公司），藻紅蛋白（Phycoerythrin，PE）標(biāo)記的CD31（美國BD公司），異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的血管假性血友病相關(guān)因子（von Willeband factor，vWF）（美國Abcam公司），脂多糖（美國Sigma公司）。

1.2方法

1.2.1PBMCs的提取無菌條件下取健康成人外周血20 ml，肝素抗凝后，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）液雙倍稀釋，將稀釋后的細(xì)胞加入等體積Ficoll淋巴細(xì)胞分離液表層，室溫下水平2 000 r/min離心25 min，吸取中間渾濁的云霧狀的灰白色層，即為外周血單個(gè)核細(xì)胞層。DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌2次，室溫下分別2 000和1 500 r/min離心10 min，棄上清液，獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞。

1.2.2PBMCs誘導(dǎo)分化將離心后的細(xì)胞加入至含有10μg/L VEGF、10μg/L bFGF以及體積分?jǐn)?shù)為20％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，吹打計(jì)數(shù)后移至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5％飽和濕度的二氧化碳CO2培養(yǎng)箱中，第3天更換細(xì)胞培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長。

1.2.3PBMCs分組誘導(dǎo)分化72 h后，各實(shí)驗(yàn)組中分別加入不同濃度（0.01、0.10、1.00和10.00μg/ml）的LPS，對照組不加LPS，分別做好標(biāo)記，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4誘導(dǎo)后的細(xì)胞鑒定①細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。在倒置相差顯微鏡下對各組細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，并對比誘導(dǎo)添加生長因子前后以及加入LPS干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)及生長的變化，觀察是否有鋪路石樣改變。②細(xì)胞表型檢測。誘導(dǎo)分化20 d后，取貼壁細(xì)胞，予以0.25％胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，各管中加入PE標(biāo)記的CD31抗體，4℃避光孵育15 min；FITC標(biāo)記的vWF抗體同樣條件下孵育30 min；CD31、vWF雙標(biāo)記為先加入PE標(biāo)記的CD31，避光孵育15 min后加入FITC標(biāo)記的vWF避光孵育30 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

倒置相差顯微鏡下，新分離的PBMCs細(xì)胞呈小圓形，培養(yǎng)24 h后部分細(xì)胞開始貼壁，細(xì)胞胞體開始變大，透亮度也增加。隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，細(xì)胞可見偽足樣突起伸出，細(xì)胞拉長呈梭形的內(nèi)皮樣細(xì)胞并保持貼壁生長，開始出現(xiàn)細(xì)胞集落。誘導(dǎo)分化20 d后，貼壁細(xì)胞開始出現(xiàn)融合（見圖1A～D）。在培養(yǎng)過程中，部分細(xì)胞一直保持小圓形，且不貼壁生長，換液后棄除。

2.2誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表面標(biāo)志鑒定CD31、vWF陽性細(xì)胞和CD31/vWF雙陽性細(xì)胞

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果（右上象限）顯示，對照組、0.01、0.10、1.00和10.00μg/ml LPS組表達(dá)CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比分別為58.30％、69.10％、55.33％、29.80％和16.80％（見圖2）。不同濃度LPS 對BPMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用比較見附表。與對照組比較，0.01μg/ml LPS組CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.025），而0.10μg/ml LPS組CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.277），1.00和10.00μg/ml LPS組CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P =0.011和0.000）（見圖3）。

圖1　細(xì)胞形態(tài)變化

圖2　流式細(xì)胞術(shù)檢測CD31/vWF雙陽性細(xì)胞

圖3　流式細(xì)胞術(shù)檢測CD31/vWF雙陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)分布圖

附表　不同濃度LPS對BPMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用比較（％，±s）

附表　不同濃度LPS對BPMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用比較（％，±s）

組別　CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)　P值對照組　59.68±2.3 0.01μg/ml LPS組　68.77±1.4　0.025 0.10μg/ml LPS組　55.33±2.4　0.277 1.00μg/ml LPS組　28.17±1.2　0.011 10.0μg/ml LPS組　15.25±3.4　0.000

3　討論

外周血單個(gè)核細(xì)胞是指外周血中細(xì)胞核為單個(gè)的一群混合性，其內(nèi)存在能分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞——內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）。PBMCs治療缺血性疾病的機(jī)制主要包括2方面：①EPCs能夠參加缺血組織的血管形成；②PBMCs能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和生長因子誘導(dǎo)血管的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)的外周血來自于健康成人，通過密度梯度離心法分離提取PBMCs，再添加細(xì)胞因子VEGF和bFGF在DMEM/F12培養(yǎng)基內(nèi)誘導(dǎo)分化。從未添加LPS干預(yù)的對照組中，筆者觀察到新分離的PBMCs呈小圓形，24 h后可見細(xì)胞呈貼壁生長，繼而細(xì)胞體積變大，可見偽足樣突起，細(xì)胞呈現(xiàn)梭形并形成細(xì)胞集落，最后細(xì)胞呈鋪路石樣生長，部分細(xì)胞融合，與國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的內(nèi)皮細(xì)胞演化過程相同。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化后細(xì)胞表達(dá)CD31/vWF雙陽性細(xì)胞數(shù)受LPS的影響，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CD31即血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1，主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)在血小板、巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中弱表達(dá)，存在于早期內(nèi)皮細(xì)胞的邊緣，體現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞間接觸并誘導(dǎo)胞內(nèi)信號的傳遞，是目前公認(rèn)的特異性內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[1-2]。vWF即為血管假性血友病相關(guān)因子，主要在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)合成并釋放一種多聚體糖蛋白，可儲存在內(nèi)皮細(xì)胞的Weibel-palade小體中，僅在內(nèi)皮細(xì)胞和少量血小板中表達(dá)，vWF是凝血因子Ⅷ的載體蛋白，與凝血因子Ⅷ結(jié)合后，以復(fù)合體的形式存在于外周循環(huán)血液中，在血小板黏附于內(nèi)皮下組織的過程中發(fā)揮重要的作用，被認(rèn)為是鑒定內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[3]。本實(shí)驗(yàn)對誘導(dǎo)分化后的PBMCs從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面特異性標(biāo)志兩方面進(jìn)行鑒定，證實(shí)最后所分化的細(xì)胞為內(nèi)皮細(xì)胞。

研究顯示，大部分缺血性疾病如糖尿病患者體內(nèi)的EPCs數(shù)量較正常人明顯減少[4-5]，其黏附能力、細(xì)胞形成集落以及增殖能力降低[6]。臨床發(fā)現(xiàn)，患者的血糖和胰島素水平、氧化應(yīng)激、感染等微環(huán)境因素會干擾細(xì)胞的生長，使PBMCs移植治療糖尿病足的臨床療效受影響。雖然鮮有文獻(xiàn)報(bào)道感染與干細(xì)胞移植的相關(guān)性，但筆者從臨床部分病例發(fā)現(xiàn)，糖尿病足合并感染尤其是革蘭陰性菌感染時(shí)，干細(xì)胞移植的臨床療效無法令人滿意。目前，關(guān)于內(nèi)毒素對PBMCs分化、增殖及凋亡等生物特性的影響及其機(jī)制還不十分清楚。

內(nèi)毒素是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的重要組成成分，化學(xué)成分為脂多糖，包括脂質(zhì)A、核心多糖和O抗原3個(gè)組成部分。在細(xì)菌生長繁殖的各個(gè)階段及菌體自溶或被裂解時(shí)，LPS會從細(xì)菌外膜上脫落下來并釋放到周圍介質(zhì)中，導(dǎo)致機(jī)體代謝、激素水平和神經(jīng)內(nèi)分泌的改變，最終可引起發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及播散性血管內(nèi)凝血等一系列病理反應(yīng)[7]。研究顯示，LPS主要通過細(xì)胞表面Toll樣受體4（toll-like receptors 4，TLR4）結(jié)合，激活TLR4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路，再通過MyD88依賴性通路最終激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB），最后通過NF-κB表現(xiàn)出不同的生物學(xué)活性。有研究報(bào)道，LPS可通過TLR4激活癌細(xì)胞內(nèi)Wnt信號通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖及腫瘤的發(fā)生[8]。但也有研究發(fā)現(xiàn)，LPS可通過分泌具有細(xì)胞毒作用的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白介素-1（Interleukin-1，IL-1）等抑制腫瘤細(xì)胞的生長，并誘導(dǎo)一氧化氮NO產(chǎn)生，后者能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。還有研究報(bào)道，適量LPS可與間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）表面TLR4結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)MSCs增殖并提高M(jìn)SCs移植效率以及抑制氧化應(yīng)激引起的MSCs凋亡[9-10]。

NF-κB屬于Rel家族的轉(zhuǎn)錄因子，激活的NF-κB可參與許多基因的轉(zhuǎn)錄與調(diào)控，在感染、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞免疫、氧化應(yīng)激、細(xì)胞增殖及凋亡的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用。具體機(jī)制為NF-κB活化后，通過調(diào)控多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生和釋放TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子，該炎癥因子除可直接作用于細(xì)胞，引起細(xì)胞凋亡與壞死外，還能激活其他細(xì)胞因子，從而激活整個(gè)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征；活化后的NF-κB也能參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，具有抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的雙重作用[11]；此外研究還發(fā)現(xiàn)，NF-κB能夠引起VEGF、類胰島素一號增長因子、bFGF、TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-8等血管形成因子的表達(dá)增加[12-14]，進(jìn)而參與細(xì)胞的增殖與分化過程。本研究中，在低濃度LPS（0.01μg/ml）作用下可有效地促進(jìn)BPMCs分化為VECs，隨著LPS濃度進(jìn)一步增加，對PBMCs的分化呈現(xiàn)抑制作用。筆者推斷，該雙相效應(yīng)的原因可能為不同濃度LPS（0.01μg/ml）微環(huán)境下激活NF-κB的亞單位和數(shù)量不同，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，高濃度LPS是影響PBMCs分化的因素之一，與臨床革蘭陰性菌感染的糖尿病足患者干細(xì)胞移植療效欠佳結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，LPS對PBMCs向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用呈一定的劑量依賴性，低濃度時(shí)可表現(xiàn)出促進(jìn)作用。因此，控制微環(huán)境中LPS濃度可提高PBMCs的移植效率，為PBMCs移植時(shí)機(jī)的掌握提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。另外，本研究提示，通過體外低濃度LPS預(yù)處理干細(xì)胞，可作為提高干細(xì)胞移植效率的一種新手段。

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（童穎丹編輯）

Effect of endotoxin on activity of vascular endothelial cells differentiated from peripheral blood mononuclear cells

Qing-rong Fu, Li Chen, Jian-wen Lu, Shui-qing Huang, Lai-ming Deng, Zheng-hua Xiao
(The First Guangzhou People's Hospital Affiliated to Guangzhou Medical College, Guangzhou, Guangdong 510180, China)

Abstract:Objective To investigate the effects of lipopolysaccharide (LPS) on the in vitro differentiation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) to vascular endothelial cells (VECs).Methods PBMCs from healthy volunteers were induced by VEGF and bFGF, and exposed to different concentrations of LPS.The inverted phase contrast microscope was used to observe the morphological changes of the cells.The immunofluorescence staining of CD31 and vWF was examined with flow cytometer.Results The morphological characteristics of the cells were observed at different passages under inverted phase contrast microscope.Compared with the control group, the number of positive cells in 0.01 μg/ml LPS -intervented group significantly increased (P < 0.05), while that in the 0.10 μg/ml LPS-intervented group had no significant difference (P > 0.05).The number of positive cells in 1.00-10.00 μg/ml LPS-intervented groups remarkably reduced compared to that in the control group (P< 0.05).Conclusions LPS at a concentration of 0.01 μg/ml can enhance differentiation of PBMCs.However, with the concentration of LPS increasing, the differentiation of PBMCs is inhibited, which may be related to activation of different number and subunits of NF-κB by different concentrations of LPS.

Keywords:endotoxin; peripheral blood mononuclear cell; vascular endothelial cell; cellular differentiation

[通信作者]肖正華，E-mail：742754223@qq.com；Tel：13544436627

收稿日期：2015-10-15

文章編號：1005-8982（2016）01-0041-05

中圖分類號：R329.2；R543

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A