硬皮病動(dòng)物模型建模藥物最適濃度探討*

陸曉鳳，羅婧瑩（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西桂林541000）

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硬皮病動(dòng)物模型建模藥物最適濃度探討*

陸曉鳳，羅婧瑩
（桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科，廣西桂林541000）

摘要：目的探討用博來霉素（BLM）制作硬皮病動(dòng)物模型的最適濃度。方法將24只BALB/C小鼠隨機(jī)平均分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，各實(shí)驗(yàn)組小鼠分別皮下注射200、700和1 000μg/ml濃度的BLM，對(duì)照組小鼠皮下注射等量的磷酸鹽緩沖液（PBS），注射4周后處死小鼠，取注射部位皮膚行蘇木精-伊紅染色法（HE）染色、Masson染色、真皮羥脯氨酸含量檢測(cè)及真皮厚度檢測(cè)。結(jié)果700和1 000μg/ml濃度的BLM成功建模，但1 000μg/ml的濃度可導(dǎo)致小鼠皮膚淺表潰瘍。結(jié)論硬皮病動(dòng)物模型成功與否與BLM藥物濃度高低關(guān)系密切，700μg/ml博萊霉素濃度具有較好的建模效果，且不會(huì)出現(xiàn)皮膚潰瘍的副作用。

關(guān)鍵詞：硬皮病；博來霉素；動(dòng)物模型；最適濃度

硬皮?。⊿cleroderma）是以局限性或彌漫性皮膚及內(nèi)臟結(jié)締組織纖維化、硬化及萎縮為特點(diǎn)的結(jié)締組織疾病，疾病發(fā)展到晚期病情常較重，危及患者生命[1]。目前硬皮病發(fā)病機(jī)制仍不清楚，圍繞其展開相關(guān)研究顯得尤為重要。由于直接以硬皮病患者為研究對(duì)象有較多的局限性，所以建立穩(wěn)定的硬皮病動(dòng)物模型是硬皮病基礎(chǔ)研究的前提條件。目前國內(nèi)外常以博來霉素（Bleomycin，BLM）皮下注射的方法建模，但關(guān)于建模的最適濃度尚無統(tǒng)一認(rèn)識(shí)[2-4]。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的博來霉素皮下注射于小鼠背部，4周后切取小鼠注射部位皮膚進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)，探討最適宜硬皮病建模的博來霉素濃度。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只BALB/c小鼠，購于桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF清潔級(jí)，為6周齡雌性小鼠，體重18～22g，飼養(yǎng)于桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2主要試劑、儀器及耗材

博萊霉素購自北京索來寶生物科技有限公司，生產(chǎn)批號(hào)415A027，磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）、Masson染色全套試劑來自于桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，羥脯氨酸試劑盒購自南京建成公司，生產(chǎn)批號(hào)20151205，紫外分光光度計(jì)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組將24只BALB/c小鼠隨機(jī)分為4組，分別標(biāo)記為A、B、C、D組，每組6只。用小動(dòng)物剃毛器剃去小鼠背部皮膚，范圍為≥3 cm×3 cm的圓形區(qū)域。博來霉素用PBS稀釋，分別配制成200、700和1 000μg/ml濃度。A組小鼠為對(duì)照組，皮下注射PBS 100μl/d；B組小鼠皮下注射200μg/ml博來霉素100μl/d；C組小鼠皮下注射700μg/ml博來霉素100μl/d；D組小鼠皮下注射1 000μg/ml博來霉素100μl/d。每只小鼠皮下注射時(shí)，分別以12、3、6和9點(diǎn)鐘方向進(jìn)針，實(shí)行多點(diǎn)注射，注射器針頭與小鼠皮膚表面角呈10度，每點(diǎn)注射25μl，1次/d，連續(xù)注射4周。

1.3.2實(shí)驗(yàn)方法完成4周注射后的次日，頸椎脫臼法處死小鼠，取小鼠注射部位皮膚2塊。其中一塊用福爾馬林溶液浸泡，石蠟包埋，行蘇木精-伊紅染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色、Masson染色，并測(cè)真皮厚度；另一塊置于-80℃冰箱冷凍存于管中，用于測(cè)量皮膚中羥脯氨酸的含量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1肉眼觀察各小鼠注射部位皮膚的變化

連續(xù)注射博來霉素4周后，肉眼可以觀察到，A組小鼠注射部位皮膚呈粉紅色，觸感柔軟，彈性好，無異常隆起、凹陷，無潰瘍，無出血點(diǎn)；B組小鼠注射部位皮膚肉眼觀及觸感與A組小鼠無明顯差異；C組小鼠注射部位皮膚明顯增厚，硬化，彈性差，粗糙，無潰瘍，無出血點(diǎn)；D組小鼠注射部位皮膚不僅有增厚、硬化、變粗糙、彈性差等表現(xiàn)，還出現(xiàn)明顯的淺表潰瘍。見圖1。

圖1　小鼠皮膚肉眼觀

2.2注射部位皮膚組織HE染色

連續(xù)注射博來霉素4周后，取注射部位的皮膚行HE染色，鏡下可見A組小鼠注射部位皮膚表皮層、真皮層、脂肪層、肌肉層與正常小鼠皮膚病理組織結(jié)構(gòu)相同，未發(fā)生變化；B組小鼠真皮層略增厚，膠原纖維稍變粗，脂肪層未見明顯變化；C、D組小鼠注射部位皮膚真皮層明顯增厚，膠原纖維明顯增多、增粗，排列變緊密，且皮下脂肪層明顯變薄，甚至消失。見圖2。

Masson染色是用于顯示組織中纖維的染色方法之一，可使膠原纖維被亮綠染成綠色，使肌纖維被麗春紅染成紅色。取小鼠注射部位皮膚行Masson染色，可見C、D組小鼠皮膚真皮層中，被染成綠色的膠原纖維明顯增多（見圖3）。將該組織切片拍成圖片，用免疫組織化學(xué)法定量分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。每只小鼠切片隨機(jī)取5個(gè)視野采集圖像，以亮綠色為陽性，計(jì)算陽性率，再用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分別算出D各組陽性率的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s），然后將A組分別與B、C、D 3組作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)算t值、P值。結(jié)果顯示，C、D組Masson染色陽性率高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

圖2　小鼠皮膚HE染色（HE×20）

圖3　小鼠皮膚Masson染色（Masson×20）

2.3注射部位皮膚的真皮厚度

連續(xù)注射博來霉素4周后，肉眼可見注射部位皮膚厚度發(fā)生不同變化，采用彩色病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)小鼠真皮的厚度進(jìn)行測(cè)量，所得數(shù)據(jù)并用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件算出各組的均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）。將A組分別與B、C、D組進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，可見C、D組小鼠皮膚增厚，真皮層厚度明顯增加。見表2。

2.4注射部位皮膚的膠原含量

羥脯氨酸在膠原蛋白中占13.4％，在彈性蛋白中含量極少，其他蛋白中不含羥脯氨酸，因此小鼠皮膚中羥脯氨酸的含量可以間接地反映所測(cè)部位膠原蛋白的含量，進(jìn)而推斷該部位纖維化的程度。按羥脯氨酸試劑盒說明書進(jìn)行操作，測(cè)量并計(jì)算出各組小鼠注射部位皮膚羥脯氨酸的含量，并且重復(fù)上述步驟3次，記錄3次所測(cè)數(shù)值，所得數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，并分別將A組與B、C、D 3組進(jìn)行比較，用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，C、D組小鼠注射部位皮膚的羥脯氨酸含量明顯增加。見表3。

博來霉素濃度過低，建模效果不好，而濃度過高，雖然可以使小鼠注射部位皮膚出現(xiàn)典型硬皮病樣改變，但同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致小鼠皮膚出現(xiàn)潰瘍，不利于后續(xù)研究。

表1　各組小鼠注射部位皮膚Masson染色陽性率（％±s）

表1　各組小鼠注射部位皮膚Masson染色陽性率（％±s）

注：1）與A組比較，t=1.295，P=0.224；2）與A組比較t=31.339，P=0.000

組別　　例數(shù)　　陽性率A組　6　29.4±1.3 B組　6　30.3±1.01）C組　6　68.3±2.82）D組　6　81.6±2.42）

表2　各組小鼠注射部位真皮厚度比較（μm，±s）

表2　各組小鼠注射部位真皮厚度比較（μm，±s）

注：1）與A組比較，t=1.963，P=0.780；2）與A組比較，P=0.000 （tC=27.030，tD=17.174）

組別　　例數(shù)　　陽性率A組　6　160.85 B組　6　170.80±11.121）C組　6　326.07±13.932）D組　6　344.33±25.582）

表3　各組小鼠注射部位羥脯氨酸含量比較（μg/mg，±s）

表3　各組小鼠注射部位羥脯氨酸含量比較（μg/mg，±s）

注：1）與A組比較，t =0.941，P=0.385；2）與A組比較，P=0.000 （tC=10.544，tD=18.157）

組別　　例數(shù)　　羥脯氨酸含量A組　6　4.17±0.47 B組　6　4.36±0.131）C組　6　7.90±0.732）D組　6　7.95±0.192）

3　討論

硬皮病是皮膚科相關(guān)疾病中，臨床處理較為棘手的一種常見病，由于其病因和發(fā)病機(jī)制不明確，所以尚無有效的治療措施，針對(duì)其展開研究顯得尤為重要。良好的動(dòng)物模型是研究硬皮病的基礎(chǔ)，關(guān)于硬皮病動(dòng)物模型的建造，前人做過很多研究，包括用UCD雞[5]或者緊皮鼠等[6]，但由于建模成本較高、動(dòng)物來源困難等多方面原因，未被推廣運(yùn)用。后來，Toshiyuki等[7]發(fā)現(xiàn)，博來霉素誘導(dǎo)的硬皮病小鼠模型與臨床硬皮病患者的組織病理改變極為相似。但關(guān)于建模濃度的問題，文獻(xiàn)報(bào)道尚未達(dá)成共識(shí)，這給后來研究硬皮病，且以該方法建立動(dòng)物模型的研究人員造成很大的困惑。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，200μg/ml博來霉素建立的動(dòng)物模型無典型硬皮病樣改變；700μg/ml博來霉素建立的硬皮病動(dòng)物模型，肉眼見小鼠皮膚明顯變硬，HE染色可見真皮層膠原纖維明顯增多，真皮層明顯增厚，皮膚羥脯氨酸含量明顯增加，脂肪層變薄，甚至消失，與Juniantito[8]、Avouac 等[9]提到的硬皮病動(dòng)物模型的組織病理變化相符。雖然1 000μg/ml博來霉素也能造出該模型，但小鼠淺表皮膚出現(xiàn)潰瘍，且潰瘍逐日加重，顯然不利于以硬皮病小鼠為載體的后續(xù)研究。查閱國內(nèi)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，第四軍醫(yī)大學(xué)楊蓉婭教授、北京協(xié)和醫(yī)院王千秋教授、上海交通大學(xué)鄭捷教授等分別給予BALB/c小鼠300、500和600μg/ml BLM皮下注射，連續(xù)注射28d，成功建立硬皮病動(dòng)物模型[10-12]。本研究分析發(fā)現(xiàn)3者的建模濃度為200～1 000μg/ml，與本研究結(jié)果不謀而合。同時(shí)提示，硬皮病動(dòng)物模型的最適造模濃度并非單一濃度，而是一個(gè)適宜的濃度范圍，通過上述實(shí)驗(yàn)，筆者可初步確定該范圍在200～1 000μg/ml，后續(xù)筆者將補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)，繼續(xù)精確、縮小該范圍。

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（申海菊編輯）

Optimal drug concentration for scleroderma mouse model*

Xiao-feng Lu, Jing-ying Luo
(Department of Dermatology, the Affiliated Hospital of Guilin Medical University, Guilin, Guangxi 541000, China)

Abstract:Objective To analyze the optimal concentration of Bleomycin for scleroderma mouse model.Methods Twenty-four BALB/c mice were divided into 4 groups including 3 experimental groups and 1 control group.The mice of the experimental groups were injected with 200, 700 and 1,000 μg/ml Bleomycin respectively and those in the control group were injected with PBS.The staining for HE and Masson, and detection for dermis hydroxyproline content and dermis thickness were executed after the extraction of injective-site skin about 4 weeks later.Results Scleroderma mouse model was successfully established at the 700 and 1,000 μg/ml concentration of Bleomycin, but the skin ulcer of injective site occured in the experimental group of 1,000 μg/ml concentration.Conclusions There is a close relationship between establishment of scleroderma mouse model and drug concentration.The 700 μg/ml concentration of Bleomeycin has a good molding effect, which does not have the side effect like skin ulcer.

Keywords:scleroderma; Bleomycin; animal model; optimal concentration

通信作者]羅婧瑩，E-mail：luojingying2005@aliyun.com；Tel：0773-2823796

*基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（No：81460473）；廣西自然科學(xué)基金（No：2012NSFAA053133）[

收稿日期：2015-08-12

文章編號(hào)：1005-8982（2016）01-0001-04

中圖分類號(hào)：R593.25

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A