豬瘟病毒功能基因的研究進展

宋淑英　張澤輝　王莊

摘要：豬瘟病毒為豬瘟的病原，該病流行范圍廣、致死率高且難以清除，給生豬養(yǎng)殖業(yè)造成巨大威脅。因此對病毒的基因結構、致病機理以及疫苗防控等方面的研究一直都是熱點。對豬瘟病毒功能基因的研究進展進行了介紹。對其整體基因結構進行了概述，對其功能區(qū)域，特別是對病毒RNA 3UTR與5UTR區(qū)域的結構，及各區(qū)域在病毒復制、表達過程中的功能進行了詳細介紹。同時對病毒RNA ORF所含基因，以及其表達產物在病毒致病性中的作用進行了簡要說明。為進一步探明病毒的致病機理，以及防控疫苗的研制提供理論幫助。

關鍵詞：豬瘟病毒；功能基因；非翻譯區(qū)；病毒復制

中圖分類號：S852.65+1 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2016）01-0010-03

豬瘟是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的一種接觸性、熱性、急性且致死率較高的傳染性疾病[1]。病豬通常因全身血管壁變性，造成廣泛出血、臟器壞死、梗塞而導致死亡[2]。隱性感染和慢性感染的豬會長期排毒，成為潛在感染源，對豬群健康造成嚴重危害。據(jù)統(tǒng)計，我國每年因豬瘟造成的經(jīng)濟損失已超過100億元[3]。豬瘟嚴重阻礙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，并對食品安全造成威脅。因此，對該病進行全面、綜合防控，具有必要的現(xiàn)實意義。本文對CSFV及功能相關基因、蛋白的研究進展進行介紹，為全面了解CSFV、全方位防控豬瘟提供理論支持。

1 CSFV

CSFV屬黃病毒科，瘟病毒屬，病毒粒子為二十面體、對稱、圓形結構。為正鏈、單股RNA病毒[3]。粒子直徑約為40 nm～50 nm，核衣殼直徑約29 nm，衣殼內部包裹基因組RNA，長度約12.3 kb[4]，病毒囊膜表面被6 nm～8 nm的糖蛋白纖維穗樣突起所包裹[5]。

20世紀90年代，根據(jù)遺傳進化分析，CSFV被分為2個基因群，包含5個基因亞群，分別為subgroup1.1、1.2、2.1、2.2及2.3。當時影響我國的主要為基因1群，該群主要包括亞洲、南美洲分離株，及部分古典歐洲、美洲分離株和日本分離株。在九十年代末，學術界多根據(jù)CSFV的E2基因、NS5B基因以及5′-UTR對病毒進行分類[6]。目前已將CSFV分為3個基因群，共10個基因亞群，其中基因2群毒株在世界范圍內廣泛流行。在我國，CSFV主要由基因2群及1群，共4個基因亞群組成，分別為2.1、2.2、2.3及1.1亞群。主導毒株已由基因1群變?yōu)榛?群[7]，說明我國CSFV的傳播途徑更為復雜。

2 CSFV基因

CSFV基因由3′-端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region， 3′UTR）、5′-端非翻譯區(qū)（5′-untranslated region， 5′-UTR）和一個較大的開放閱讀框（ORF）三部分構成。在病毒RNA的3′-端缺少多聚腺苷酸結構（polyA），5′-端缺少甲基化的“帽子”結構[8]。

2.1 5′-UTR

CSFV 5′-UTR長約370 nt，不同基因群長度各異，但同群內高度保守。在5′-UTR中存在核糖體結合位點，該位點能夠與核糖體18S rRNA的3′-端保守序列結合，從而起始病毒翻譯過程[4]。核糖體結合位點結構的完整性對CSFV復制起決定性作用。5′-UTR中的莖-環(huán)序列能夠形成穩(wěn)定的發(fā)夾結構，該結構是構成核糖體結合位點的重要組成部分。最近研究表明，在5′-UTR中存在連續(xù)的21 nt序列或GTATACGAG序列，該序列的突變或缺失，能夠導致病毒復制效率的顯著降低甚至完全無法起始復制過程[9]。在CSFV不同基因群的5′-UTR起始密碼子上游，存在一段長度為27 nt的高度保守序列，該序列可以與核糖體結合并在無“帽子”結構的情況下起始病毒的翻譯過程。研究同時發(fā)現(xiàn)，該序列與Met tRNA與起始密碼子定位過程有關。由于5′-UTR區(qū)域的高度保守性，因此常被用于CSFV分型[3]。

5′-UTR的二級結構可分為四個功能區(qū)，A、B、C和D區(qū)。其中B區(qū)為可變區(qū)，保守性最低；C區(qū)為保守區(qū)，與莖-環(huán)結構、發(fā)夾結構有關；D區(qū)的一級結構為可變區(qū)，但二級結構相對保守[10]。當5′-UTR核糖體結合位點與核糖體40S亞基形成穩(wěn)定二元復合物后，起始密碼子才能夠準確定位核糖體P位點，CSFV翻譯才能夠正常進行。在此過程中，核糖體結合位點的結構與功能至關重要。分析發(fā)現(xiàn)，核糖體結合區(qū)域位于起始密碼子的兩側363 nt～391 nt之間，結合位點的5′-邊界臨近病毒基因組第65位堿基[11]。核糖體結合位點可分為3個區(qū)域，其中II區(qū)及其下游區(qū)域與結合功能密切相關。當缺失部分II區(qū)及其上游序列時，結合位點仍有活性，但活性降低20%左右；當缺失部分II區(qū)及全部下游序列時，結合位點則完全喪失結合活性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，核糖體結合位點的II區(qū)主要與病毒的復制能力有關，對翻譯過程影響不大；而III區(qū)則主要與病毒的翻譯過程有關，對病毒的復制能力幾乎沒有影響[12]。

除結合位點自身結構外，結合位點下游序列的結構對翻譯起始及翻譯效率也有很大影響。研究發(fā)現(xiàn)，當結合位點下游起始密碼子AUG后緊接17或更多病毒自身密碼子時，結合位點的翻譯起始能力最強；當病毒自身密碼子減少至12個時，位點起始能力降低至66%；當僅保留3個自身密碼子時，位點起始能力則僅有15%。同時RNA結構分析表明，起始密碼子后的序列保持單鏈狀態(tài)時，起始位點起始翻譯的效率最高[12-15]。

2.2 3′-UTR

CSFV的3′-UTR位于病毒基因組較大的ORF終止密碼子（UGA）之后，有223 nt～239 nt組成，無ploy（A）尾結構，但含有一段富含AT的區(qū)域。在3′-UTR中包含兩個較為穩(wěn)定的莖-環(huán)結構序列（stem-loop motif，SL），分別為SL I和SL II。序列分析發(fā)現(xiàn)，在SL I與SL II 之間存在一段長的單鏈間插序列（single stranded intervening sequence， SS）[16]。研究發(fā)現(xiàn)，SL I和SS序列在病毒RNA復制過程中發(fā)揮重要作用，當分別或同時在SL I及SS序列中發(fā)生突變或缺失時，病毒RNA的復制能力都會減弱，甚至無法進行復制[17]。已有研究表明，CSFV的3′-UTR端SL序列以順式作用原件的形式參與RNA復制過程。同時，3′-UTR與成熟病毒粒子的包裝過程有關，但具體機制尚不明確[18]。

3′-UTR的結構完整性與病毒基因組RNA合成的起始以及合成的效率有關。研究發(fā)現(xiàn)，在CSFV的3′-UTR中有一段21 nt的核苷酸序列是病毒復制所必須的。缺少該段序列，病毒將無法進行復制[19]。但即使3′-UTR僅含有該段序列，而其他部分全部缺失時，病毒RNA仍能起始合成，但合成效率顯著降低[20]。在21 nt核苷酸序列中，位于216位的T堿基是病毒RNA起始合成的關鍵位點，該位點的突變將導致病毒無法起始RNA合成；219位和228位的堿基發(fā)生突變會導致起始能力顯著降低；212位堿基對起始能力無明顯影響，但對RNA的合成效率影響較大。研究表明，CSFV的3′-UTR與病毒的RNA復制酶結合，起始病毒基因組RNA的復制過程。在其3′-末端存在CCCGG序列與復制酶結合有關，該序列的缺失或突變，會導致結合能力大幅降低[21-23]。

2.3 ORF

CSFV的ORF首先翻譯出一個多聚蛋白（polyprotein，PPro）。PPro由3 898個氨基酸構成，并在病毒自身合成的蛋白酶及宿主細胞的信號肽酶作用下，被分解、加工為12種蛋白質。依據(jù)其編碼基因的順序，蛋白分別為Npro、C、Erns（E0）、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A及NS5B。其中4種為結構蛋白，分別為C、Erns、E1及E2，其余為非結構蛋白[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，在ORF中與CSFV毒力相關基因為Npro、Erns、E1及E2。CSFV強毒株基因組中任一毒力相關基因發(fā)生突變，或被弱毒株的相應基因替換后，強毒株的致病力將明顯下降。Erns表達的蛋白具有淋巴細胞毒性[16]，其他3個基因表達的蛋白單獨并不表現(xiàn)出任何毒性，推測其在維系病毒的整體致病性方面發(fā)揮作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，Npro基因表達的蛋白能夠與病毒基因組復制過程中形成的雙鏈RNA中間體（dsRNA）結合，抑制其功能，并對IFN-α/β啟動子具有抑制作用[25]。這種抑制作用，能夠使感染細胞抵抗由dsRNA分子引起的細胞凋亡，從而導致非強毒株的持續(xù)性感染。

3 展望

CSFV給生豬養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大威脅，免疫接種仍是最有效的防控措施之一。目前，OIE推薦的豬瘟標記疫苗中，大部分是根據(jù)其結構蛋白E2糖蛋白而研制的。但隨著對CSFV基因組研究的推進，使研發(fā)針對其他蛋白或基因的新型疫苗成為可能。如針對E2囊膜糖蛋白亞單位的標記疫苗，以及通過基因重組技術獲得能夠表達Npro、Erns、E1及E2蛋白的重組痘苗病毒等[23，25]，都為豬瘟的防控提供了新的思路。而隨著對CSFV基因功能、作用研究的不斷深入，對其致病機理也將有更加準確的闡述，也將為豬瘟的全方位防控提供幫助。

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