多肽固相合成的研究進展

劉立偉

摘 要：多肽是一類非常重要的生物活性物質(zhì)，在治療某些疾病方面具有獨特的療效，因此其化學合成有著非常重要的意義。文章介紹了多肽固相合成的原理、方法、固相載體的選擇、連接分子的種類及肽鍵的形成等，揭示了固相合成多肽存在的問題并展望了其研究前景。

關(guān)鍵詞：多肽 固相合成

1 多肽的概述

多肽是普遍存在于生物體內(nèi)由氨基酸組成的生物活性物質(zhì)，它是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結(jié)合而成。在生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多肽已達數(shù)萬種，由于其具有廣泛的生物活性及良好的安全性，因此已日益受到藥物研發(fā)工作者的重視。尤其在20 世紀90 年代以后，隨著多肽合成技術(shù)的日臻成熟，越來越多的活性多肽已被開發(fā)并廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)及畜牧業(yè)等領(lǐng)域。

合成多肽的方法主要是指化學合成法，其中液相合成和固相合成是最主要的合成方法，無論是液相法還是固相法都已經(jīng)很成熟。液相合成多肽主要有逐步合成和分段合成兩種途徑，它在多肽的工業(yè)化生產(chǎn)方面有非常重要的應用。與經(jīng)典的液相合成多肽方法相比，固相法合成多肽更以其省時、省力、省料、便于計算機控制、便于普及推廣的突出優(yōu)勢而成為肽合成的常規(guī)方法并擴展到核苷酸合成等其它有機物領(lǐng)域。

2 多肽的固相合成

1963 年Merrifield 提出固相多肽合成方法（ SPPS，Solid Phase Peptide Synthesis） ，為多肽研究開辟了廣闊的天地，并極大地推動了分子生物學等領(lǐng)域的發(fā)展，為此1984年Merrifield 被授予了諾貝爾化學獎。

2.1 固相合成的基本原理

多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C 端（ 羧基端） 向N 端（ 氨基端） 合成。首先將目的肽第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固相載體相連，再以這一氨基酸的氨基為合成起點，經(jīng)過脫去氨基保護基并同過量的活化的第二個氨基酸反應，接長肽鏈。重復（ 縮合→洗滌→去保護→中和及洗滌→下一輪縮合） 操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得所要的多肽。其中α- 氨基用Boc（叔丁氧羰基）保護的稱為Boc 固相合成法，α- 氨基用Fmoc（9- 甲氧羥基合成）保護的稱為Fmoc 固相合成法。

2.2 合成方法

2.2.1 Boc 合成法

采用三氟乙酸（ TFA） 可脫除的Boc 為α-氨基保護基，側(cè)鏈保護采用芐醇類。合成時將一個Boc保護的α-氨基酸共價交聯(lián)到樹脂上，用TFA 脫除Boc，三乙胺中和游離的氨基末端，然后通過DCC 活化、偶聯(lián)下一個氨基酸，最終采用強酸HF 法或三氟甲磺酸（TFMSA） 將合成的目標多肽從樹脂上解離。在Boc 合成法中，由于要反復地用酸來脫保護以便進行下一步的偶聯(lián)，這就引入了一些副反應，如多肽容易從樹脂上切除下來，氨基酸側(cè)鏈在酸性條件不穩(wěn)定并發(fā)生副反應。

2.2.2 Fmoc 合成法

1978 年，Meienlofer 和Atherton 等人發(fā)展了以Fmoc（9-芴甲氧羰基） 基團作為α-氨基保護基的多肽合成方法—Fmoc 法。在Fmoc 法中，采用了可被堿脫除的Fmoc 作為α-氨基酸的保護基，側(cè)鏈采用酸脫除的Boc 保護方法。Fmoc 作為氨基保護基的優(yōu)點在于它對酸穩(wěn)定，用TFA 等試劑處理不受影響，僅需用溫和的堿處理，側(cè)鏈用對堿穩(wěn)的Boc 進行保護等。肽段最后用TFA/二氧甲烷（ DCM） 定量地從樹脂上切除，避免了采用強酸。Fmoc 法與Boc 法相比，由于Fmoc 法反應條件溫和，副反應少，產(chǎn)率高，而被廣泛應用于多肽合成中。

2.3 固相合成的聚合物載體的選擇

將固相合成與其他多肽合成技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體，而能被用作多肽固相載體的聚合物必須滿足以下條件： ①必須包含合適的連接分子（ 或反應基團） ，使肽鏈能連接在載體上面，并在以后除去。②必須在合成過程中保持穩(wěn)定并且不與氨基酸分子反應。③必須提供足夠的連接點，以滿足肽鏈不斷增長的需要。 目前用于固相合成的聚合物載體主要有三類： 聚苯乙烯-苯二乙烯交聯(lián)樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯—乙二醇類樹脂及衍生物。這些聚合物載體只有引入相應的連接分子，才能與氨基酸進行連接。根據(jù)連接分子的不同，樹脂又被分為幾種類型： 氯甲基樹脂、羧基樹脂、氨基樹脂或酰肼型樹脂。

2.4 連接分子

一個理想的連接分子必須在整個合成過程中十分穩(wěn)定，并在合成后可以定量的切割下來而又不破壞合成的目標分子，同時連接分子還需要根據(jù)與樹脂相連的肽的C 端的結(jié)構(gòu)類型，裂解后生成的羧酸、酰胺或氨基醇等衍生物來選擇。固相多肽合成使用過的連接分子為含有氯甲基、巰甲基、酰氯基、對苯甲?；?、芳磺酰氯基、烯丙醇基、丁二?；?、鄰硝基芐醇基及二苯氯硅烷等的雙官能團化合物。

2.5 肽鍵的形成

固相中肽鍵的形成原理與液相中的基本一致，應用的方法主要有縮合劑法、混合酸酐法、酰氯法、活化酯法和原位法等，其中選用DCC、HOBT 或HOBT /DCC 的對稱酸酐法、活化酯法由于在肽鍵的形成過程中可以減少副反應并抑制消旋的發(fā)生，最終得到的多肽收率高等優(yōu)點而應用最廣。

2.6 多肽的切割，沉淀與純化

按既定的順序合成完多肽后，就要把目標多肽從樹脂上切割下來，并進行進一步的純化。由于多肽的合成有Boc 法和Fmoc 法兩種，因此，它們的切割方法也不完全一樣。在Boc 法中，主要用TFA +HF 裂解和脫側(cè)鏈保護。在Fmoc 法中直接用TFA進行切割。合成肽鏈進一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。目前應用最多的是高效液相色譜法，

3 展望

固相多肽合成已經(jīng)有50 年的歷史了，但是，目前人們還只能合成一些相對較短的肽鏈，而對于相對分子質(zhì)量較大、肽鏈較長的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，固相合成技術(shù)還有很大的局限性。同時在合成中要用到大量的有毒試劑，合成費用昂貴，并伴隨副反應、消旋化等問題，這些都是不可忽視的問題。而在生物體內(nèi)，核糖體上合成肽鏈的速度和產(chǎn)率都是驚人的，那么，是否能從生物體合成蛋白質(zhì)的原理上得到一些啟發(fā)，應用在固相多肽合成（樹脂）上，這是一個令人感興趣的問題。同時，尋找更加綠色、環(huán)保的多肽合成技術(shù)，對科學家來說也是一個重大的挑戰(zhàn)。

參考文獻：

[1] 韓香，顧軍.多肽的固相合成。天津藥學，2002，14（7）：9.

[2] 李正超，韓香.多肽合成方法研究進展。武警后勤學院學報.2012，22（2）：153-158.