藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

羅蘭艷　范淑芳　簡(jiǎn)大為

摘要：本文對(duì)近幾十年來(lái)的藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行綜述，主要介紹了外植體的準(zhǔn)備、培養(yǎng)基的選擇、增殖及繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和試管苗的移栽馴化等。

關(guān)鍵詞：藍(lán)莓；組織培養(yǎng)；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)：S663.9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1004-3020（2016）01-0031-05

Abstract： We focused on recent advances in tissue culture of blueberry.The tissue culture of preparing explants，selecting of cultivation media， proliferation and subculture， rooting cultivation， transplanting and domestication of testtube plantlets were mainly introduced in this view.

Key words：blueberry；tissue culture；summary

藍(lán)莓又名越橘、藍(lán)漿果。杜鵑花科Ericaeae 越橘屬Vaccinium的多年生小灌木。藍(lán)莓果皮薄，酸甜味美，有獨(dú)特風(fēng)味和豐富的營(yíng)養(yǎng)，被稱為“漿果之王”[1]。藍(lán)莓果實(shí)中含有多種生理活性成分如花色素苷、黃酮等，經(jīng)常食用藍(lán)莓可以有效地防止腦神經(jīng)衰老和糖尿病等多種疾病的發(fā)生[2]，同時(shí)，食用藍(lán)莓還具有增強(qiáng)心臟功能、明目以及抗癌等獨(dú)特功效[3-4]。因此，藍(lán)莓被聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織列為五大健康食品之一[5]，已成為21 世紀(jì)最具發(fā)展前景的經(jīng)濟(jì)作物之一[6]。

在栽培上藍(lán)莓屬小漿果類果樹(shù)，原產(chǎn)地和主產(chǎn)地均在北美洲，但廣泛分布于北半球。藍(lán)莓在我國(guó)約有 91 個(gè)種 28 個(gè)變種，主要分布于東北和西南地區(qū)[7]。目前， 商業(yè)化種植的藍(lán)莓品種主要有四大類：矮叢藍(lán)莓、半高叢藍(lán)莓、高叢藍(lán)莓和兔眼藍(lán)莓。其中高叢藍(lán)莓主產(chǎn)于北美洲溫帶及亞熱帶，具有果實(shí)大、產(chǎn)量高、品質(zhì)好等諸多優(yōu)良品質(zhì)，是全球最重要的商業(yè)化栽培種[8]。近幾年來(lái)，高叢藍(lán)莓又進(jìn)一步被分為“南高叢藍(lán)莓”和“北高叢藍(lán)莓”兩個(gè)亞類群[9]。

早在100多年前，美國(guó)人就開(kāi)始了藍(lán)莓的選育工作，到1937年就已經(jīng)篩選出15個(gè)品種并進(jìn)行了商業(yè)化的栽培[10]；到20世紀(jì)80年代，在全美境內(nèi)就已選育出優(yōu)良品種100多個(gè)，并分別在美國(guó)南部、東部、北部均形成了藍(lán)莓產(chǎn)區(qū)[9-10]；進(jìn)入21世紀(jì)，藍(lán)莓就成為了美國(guó)主栽經(jīng)濟(jì)林之一。繼美國(guó)之后，世界各國(guó)都開(kāi)始引種栽培藍(lán)莓，開(kāi)展適合本國(guó)的藍(lán)莓栽培技術(shù)研究和選育工作，并相繼進(jìn)入商業(yè)化栽培[11]。在亞洲，中國(guó)和日本是引種藍(lán)莓并進(jìn)行商業(yè)化種植發(fā)展較快的國(guó)家。我國(guó)藍(lán)莓的應(yīng)用最早可追溯至20世紀(jì)50年代，我國(guó)東北的‘篤斯藍(lán)莓Vaccinium uliginosum被用來(lái)釀酒，但在當(dāng)時(shí)人們并沒(méi)有認(rèn)識(shí)到藍(lán)莓特殊的保健功效，所以沒(méi)有對(duì)藍(lán)莓的栽培引種工作進(jìn)行系統(tǒng)研究，藍(lán)莓也沒(méi)有被作為水果進(jìn)行推廣和種植。直到20世紀(jì)80年代， 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)郝瑞教授最先率隊(duì)對(duì)長(zhǎng)白山地區(qū)的野生篤斯藍(lán)莓資源進(jìn)行全面系統(tǒng)地調(diào)查研究[12]，并開(kāi)始野生藍(lán)莓的馴化栽培。同時(shí)國(guó)內(nèi)相關(guān)專家也積極開(kāi)展藍(lán)莓的國(guó)外引種栽培工作，1983年郝瑞教授首次從美國(guó)引進(jìn)10余個(gè)藍(lán)莓品種進(jìn)行馴化栽培，此后國(guó)內(nèi)多家科研單位、大專院校以及企業(yè)也陸續(xù)開(kāi)展國(guó)外引種工作，對(duì)藍(lán)莓的引種馴化、土壤改良和栽培管理等做了大量的研究，并逐步推廣應(yīng)用于生產(chǎn)[13]。

藍(lán)莓作為一種具有保健功能的新興水果逐漸被人們所接受，世界各國(guó)均十分重視藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。組織培養(yǎng)技術(shù)在藍(lán)莓上的應(yīng)用，對(duì)于藍(lán)莓種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用具有極為重要的意義。通過(guò)組織培養(yǎng)和脫毒技術(shù)，可以獲得比常規(guī)育苗更大量、更優(yōu)質(zhì)的種苗，滿足市場(chǎng)上對(duì)藍(lán)莓種苗的需求。對(duì)20世紀(jì)90年代以來(lái)藍(lán)莓組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)行總結(jié)概述，可以為進(jìn)一步研究藍(lán)莓的組織培養(yǎng)提供參考。

1外植體的準(zhǔn)備

藍(lán)莓組織培養(yǎng)中外植體的選擇有很多，但大多數(shù)還是以幼嫩莖段和莖尖為主[14-15]，以葉片誘導(dǎo)不定芽為輔[16]，同時(shí)也有學(xué)者開(kāi)展以子葉或上胚軸作為外植體誘導(dǎo)不定芽，以根作為外植體誘導(dǎo)植株再生的技術(shù)研究[17]。外植體選取后多采用70%～75%的酒精結(jié)合01%～05%的升汞、或1%～10%的次氯酸鈉、或5%～20%的雙氧水進(jìn)行滅菌處理，均可獲得較為理想的滅菌效果[15，18-22]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，以藍(lán)莓的莖段和葉片為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)應(yīng)用最為廣泛且效果最為理想。

2基本培養(yǎng)基的選擇

根據(jù)現(xiàn)在已有的報(bào)道，藍(lán)莓組織培養(yǎng)過(guò)程中所使用過(guò)的基本培養(yǎng)基種類較多，有MS培養(yǎng)基、1/2MS培養(yǎng)基、WPM培養(yǎng)基、改良WPM培養(yǎng)基、Anderson培養(yǎng)基、White培養(yǎng)基、Knops培養(yǎng)基、Z-2培養(yǎng)基和B5培養(yǎng)基等，研究結(jié)果顯示沒(méi)有一定之規(guī)，但均取得了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[15，23-30]。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果，藍(lán)莓不同品種甚至同一品種不同的培養(yǎng)階段利于藍(lán)莓無(wú)菌苗生長(zhǎng)的培養(yǎng)基均不相同，可能原因?yàn)樗{(lán)莓不同品種間及同一品種不同發(fā)育階段的營(yíng)養(yǎng)需求存在差異，在組織培養(yǎng)中應(yīng)適當(dāng)考慮。

3增殖及繼代培養(yǎng)

藍(lán)莓的增殖及繼代培養(yǎng)過(guò)程中的影響因子，研究最多的是不同種類不同濃度的細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素對(duì)增殖及繼代的影響。

3.1細(xì)胞分裂素的選擇

董朝莉認(rèn)為，在藍(lán)莓莖段的離體增殖培養(yǎng)中，對(duì)其增殖培養(yǎng)影響較大的是細(xì)胞分裂素的種類和濃度，她的研究結(jié)果表明以加入1～2 mg·L-1 ZT或10～20 mg·L-1 2ip效果較好[18]；邵振中等認(rèn)為，在兔眼藍(lán)莓的增殖培養(yǎng)中，在WPM培養(yǎng)基中加入20 mg·L-1 ZT+05 mg·L-1 IBA，增殖系數(shù)可以達(dá)到80[31]；王淑珍等認(rèn)為，在南高叢藍(lán)莓的增殖培養(yǎng)中以加入1 mg·L-1 ZT為宜，在繼代培養(yǎng)中以交替使用1 mg·L-1 ZT和2 mg·L-1 ZT為宜[32]；Alena 等在Anderson培養(yǎng)基中加入05 mg·L-1ZT進(jìn)行五種高叢藍(lán)莓的組織培養(yǎng)，最高的增殖系數(shù)達(dá)到了391[29] ；Lisa等比較了ZT、2ip和不添加激素對(duì)高叢藍(lán)莓葉片增殖的影響，結(jié)果表明ZT的作效果更明顯[35]。國(guó)內(nèi)其他的相關(guān)研究也表明，藍(lán)莓的增殖和繼代培養(yǎng)中，ZT的作用效果最理想，甚至最高增殖系數(shù)可以達(dá)到50[19]。Barbara和Ana在改良WPM培養(yǎng)基中加入4 mg·L-1 ZT或10～15 mg·L-1 2ip均取得了成功，甚至有部分品種誘導(dǎo)成功率達(dá)100%[33]； Laura等和Line等分別在改良MS培養(yǎng)基和Z-2培養(yǎng)基上添加不同濃度的2ip進(jìn)行藍(lán)莓增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明隨著2ip濃度的增加增殖芽數(shù)增加[30，34]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，細(xì)胞分裂素中05～20 mg·L-1的 ZT可能較有利于藍(lán)莓的組培增殖，較高濃度的 2ip也可促進(jìn)藍(lán)莓增殖，而且隨著細(xì)胞分裂素濃度的增加增殖芽數(shù)也隨之增加，與組培理論相符。但考慮到有效苗率，細(xì)胞分裂素的濃度仍需適當(dāng)控制。

3.2生長(zhǎng)素的選擇

單獨(dú)研究生長(zhǎng)素對(duì)增殖及繼代培養(yǎng)的影響的文獻(xiàn)較少， Han等比較IBA和NAA 對(duì)藍(lán)莓的增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明IBA的效果要強(qiáng)于NAA[36]；Wojciech 和Magdalena比較了IBA和IAA對(duì)藍(lán)莓的增殖培養(yǎng)，結(jié)果表明IBA的效果要強(qiáng)于IAA [37]。在增殖培養(yǎng)過(guò)程中生長(zhǎng)素的應(yīng)用較為廣泛，邵振中等、朱宏芬等使用IBA[31，38]配合不同的細(xì)胞分裂素，增殖系數(shù)可達(dá)到5.8～8.0；陳平芬等、寧志怨等、Cao等使用NAA[39-41] 配合不同的細(xì)胞分裂素，增殖系數(shù)可達(dá)到3～4，Line等使用IAA[30] 配合2ip也取得了較好地效果?，F(xiàn)有研究結(jié)果說(shuō)明，生長(zhǎng)素可能不為影響藍(lán)莓增殖的主導(dǎo)因子，IBA、NAA、IAA在藍(lán)莓增殖中均可取得較好的效果，但相對(duì)而言IBA效果可能更好。

3.3pH值的選擇

在pH值對(duì)增殖培養(yǎng)的影響上，普遍認(rèn)為藍(lán)莓為酸性植物，所以組織培養(yǎng)的各階段，pH值的應(yīng)用大多在4.8～5.6范圍內(nèi)，而pH值對(duì)增殖培養(yǎng)的影響研究較少，廉家盛認(rèn)為最適合‘美登增殖的培養(yǎng)基pH值為5.4[28]。Maria 等分別試驗(yàn)了不同pH值 （40，45，50，55，60） 對(duì)藍(lán)莓增殖培養(yǎng)的影響，結(jié)果表明對(duì)于不同的藍(lán)莓品種最適宜的pH值不同，對(duì)‘Koralle最適宜 pH值為55，而對(duì)‘Red Pearl最適宜pH值為40[42]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，藍(lán)莓組培中應(yīng)根據(jù)不同品種的需求來(lái)選擇適宜的PH值，但總體而言以偏酸性為主。

4 試管苗的生根培養(yǎng)

4.1瓶?jī)?nèi)生根培養(yǎng)

從目前的研究可以看出，對(duì)于培養(yǎng)大多數(shù)采用1/2 WPM培養(yǎng)基添加不同濃度的IBA[43-45] ；也有人用其它培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)生根取得了成功，Takuya等認(rèn)為WPM是最合適的生根培養(yǎng)基[26]；Maria等用Anderson培養(yǎng)基也成功誘導(dǎo)生根[42]。

在IBA的使用濃度上，絕大多數(shù)認(rèn)為是添加05 mg·L-1 IBA最有利于生根培養(yǎng)[31，43，46-48] 。但也有研究表明低濃度的IBA更有利于生根，孫書(shū)偉認(rèn)為，“藍(lán)豐”在添加01 mg·L-1 IBA的培養(yǎng)基中，28 d后生根率可達(dá)100%；“伯克利”在添加005 mg·L-1 IBA的培養(yǎng)中，32 d后生根率也可以達(dá)到100%[49]。同時(shí)，也有研究表明高濃度的IBA更有利于生根培養(yǎng)，張彩玲認(rèn)為，在添加10 mg·L-1IBA的培養(yǎng)基中，“美登”的生根率可以達(dá)951%[44]；約旦等、Maria等認(rèn)為，誘導(dǎo)藍(lán)莓生根的最宜IBA濃度是20 mg·L-1[42，50]。還有研究表明，配合使用多種生長(zhǎng)素更有利于生根培養(yǎng)。楊艷敏等認(rèn)為，在相同條件下，使用單一的IBA，生根率最多可以達(dá)到6133%，但如果在添加05 mg·L-1 IBA的同時(shí)加入010～015 mg·L-1 NAA，生根效果更好，生根率可以達(dá)到6733%～7267%，且生根速度也快[43]。在pH值對(duì)藍(lán)莓生根的影響上，梁曉晶認(rèn)為pH值對(duì)生根率影響顯著，且篤斯越橘的最佳生根培養(yǎng)基pH值為48～60[51]。綜合上述研究結(jié)果，說(shuō)明影響藍(lán)莓生根的主導(dǎo)因子為生長(zhǎng)素，而且不同品種間的需求不同，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為IBA更有利于藍(lán)莓的生根培養(yǎng)，且少量學(xué)者認(rèn)為IBA搭配少量的NAA可能更為利于藍(lán)莓生根。

4.2瓶外生根培養(yǎng)

目前大多數(shù)研究結(jié)果表明，藍(lán)莓瓶外生根培養(yǎng)技術(shù)較為成熟，在工廠化生產(chǎn)中大多使用瓶外生根培養(yǎng)。選用增殖培養(yǎng)的健壯幼枝，將培養(yǎng)基清洗干凈，用適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后，扦插于適宜的生長(zhǎng)基質(zhì)中，給予其合適的外部生長(zhǎng)條件，可以促進(jìn)其快速生根。劉慶忠、姚平等認(rèn)為，將試管苗幼枝用IBA快速處理后，扦插于腐苔蘚基質(zhì)上，然后扣上小拱棚置于溫室中，小棚內(nèi)濕度控制在85%～95%，20～28 ℃，培養(yǎng)20 d后就可以生根，并且長(zhǎng)勢(shì)較好[52-53]。大多數(shù)的研究則表明，在外部環(huán)境控制較好的情況下，培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)瓶外生根的影響較大。張賢萍認(rèn)為，在椰糠和水苔按體積比6∶4的混合基質(zhì)中，誘導(dǎo)瓶外生根效果最好，其生根率高達(dá)96%以上[54]；王會(huì)認(rèn)為，在苔蘚和河沙按體積比2：1的混合基質(zhì)中，誘導(dǎo)瓶外生根效果最好，其生根移栽成活率可達(dá)到904%[55]；程淑云、黃國(guó)輝等認(rèn)為，不同生根基質(zhì)對(duì)瓶外生根率有較大影響，在苔蘚上生根率最高[56-57]。綜上所述，在藍(lán)莓進(jìn)行瓶外生根培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)著重考慮培養(yǎng)基質(zhì)與溫濕環(huán)境的影響，同時(shí)對(duì)試管苗幼枝配以適宜的生長(zhǎng)素處理，可以達(dá)到較好的生根效果。利用瓶外生根技術(shù)可以減少瓶?jī)?nèi)生根的無(wú)菌操作過(guò)程，明顯節(jié)約人力和物力、降低生產(chǎn)成本，在組培生產(chǎn)中可以優(yōu)先考慮。

5其它培養(yǎng)條件或添加物的選擇

在試管培養(yǎng)的增殖和生根階段，有研究學(xué)者也對(duì)培養(yǎng)過(guò)程中可能影響到增殖或生根的其他因素進(jìn)行了探討。宋剛認(rèn)為，藍(lán)莓在誘導(dǎo)生根的過(guò)程中，先進(jìn)行7 d的暗培養(yǎng)再進(jìn)行光照培養(yǎng)或增加繼代代數(shù)達(dá)到5代后，生根率均會(huì)明顯提高[58]。邵振中等認(rèn)為光照強(qiáng)度對(duì)兔眼藍(lán)莓的增殖系數(shù)影響不大，但在小于2 000 Lx的光照強(qiáng)度下，玻璃化現(xiàn)象會(huì)隨光照加強(qiáng)而減弱，所以建議增殖培養(yǎng)光照強(qiáng)度為2 000～3 000 Lx[31]。邵振中、王平紅等均對(duì)活性炭對(duì)藍(lán)莓的生根進(jìn)行了研究，邵振中等認(rèn)為，活性炭對(duì)兔眼藍(lán)莓生根有抑制作用[31]；王平紅認(rèn)為，在培養(yǎng)基中添加1%～2% 活性炭，有利于誘導(dǎo)藍(lán)莓生根，但當(dāng)培養(yǎng)基中添加活性炭的用量超過(guò)2%時(shí)，并不利于其生根，生根率反而會(huì)下降[59]。現(xiàn)有研究結(jié)果說(shuō)明，光照、活性炭等對(duì)不同品種藍(lán)莓的組培可能也有影響，在組培研究中應(yīng)酌情考慮。

6試管苗的馴化移栽

藍(lán)莓試管苗的馴化移栽技術(shù)較為成熟。李京等認(rèn)為，溫度對(duì)試管苗的移栽成活有較大影響，當(dāng)溫度升高（<25 ℃）時(shí)，有利于移栽成活；研究結(jié)果表明，9～10月是移栽的最佳季節(jié)，控制馴化室溫度25 ℃、溫度75%、遮光30%的條件下，將試管苗用500 mg·L-1的ABT處理30 s后栽于1∶1的沙子和草炭土的混合基質(zhì)中，移栽成活率可達(dá)到970%[60]。董朝莉?qū)λ{(lán)莓移栽馴化進(jìn)行了對(duì)比試驗(yàn)后認(rèn)為，季節(jié)和空氣濕度對(duì)移栽成活率影響較大，她認(rèn)為春秋季節(jié)是適合移栽的季節(jié)、當(dāng)空氣濕度達(dá)94%～98%時(shí)也明顯有利于成活率，在生產(chǎn)中可在苗床上再搭一小拱棚并覆蓋一層透明薄膜[18]。此外，國(guó)內(nèi)對(duì)移栽基質(zhì)的試驗(yàn)研究較多，得出適合藍(lán)莓移栽的基質(zhì)也較多，有園土、腐殖土、廢苔蘚按1∶3∶1比例的混合基質(zhì)[44]；有腐殖菌根土、珍珠巖按3∶2比例的混合基質(zhì)[61]；有純腐苔蘚[14，32]等。綜上所述，藍(lán)莓試管苗的馴化移栽技術(shù)與其瓶外生根技術(shù)相類似，應(yīng)著重考慮培養(yǎng)基質(zhì)及光照、溫度、濕度等環(huán)境條件的影響，同時(shí)配以適宜的生根劑處理，可以達(dá)到更好的效果。

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（責(zé)任編輯：鄭京津）