TNFRSF4基因 rs17568多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性*

喬　彥，謝席勝，劉　瑞，何明海

1.南充市中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科(南充　637000)；2.南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科(南充　637000)；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院 人類疾病相關(guān)多肽研究室 (成都　610041)

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TNFRSF4基因 rs17568多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性*

喬彥1，謝席勝2△，劉瑞3，何明海1

1.南充市中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科(南充637000)；2.南充市中心醫(yī)院 腎內(nèi)科(南充637000)；3.四川大學(xué)華西醫(yī)院 人類疾病相關(guān)多肽研究室 (成都610041)

【摘要】目的探討四川南充地區(qū)漢族人TNFRSF4基因 rs17568多態(tài)性與2型糖尿病(T2DM)的相關(guān)性。方法應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)檢測186例健康體檢者和220例T2DM患者rs17568多態(tài)性。酶法測定血糖(Glu)、血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。結(jié)果 TNFRSF4基因 rs17568位點(diǎn)等位基因頻率和基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡定律。rs17568多態(tài)位點(diǎn)G等位基因頻率為28.2%。兩組rs17568位點(diǎn)G等位基因的頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。rs17568 多態(tài)位點(diǎn)在T2DM組和對(duì)照組中，GG、AG基因型攜帶者血清HDL-C水平較AA基因型攜帶者明顯升高(P<0.05)。結(jié)論TNFRSF4基因 rs17568多態(tài)性與T2DM無關(guān)聯(lián)，但其G等位基因與血清HDL-C水平密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】TNFRSF4；2型糖尿病；遺傳多態(tài)性

糖尿病是威脅人類健康最重要的慢性疾病之一，是由遺傳和環(huán)境因素共同作用而成的多基因遺傳性復(fù)雜病。心腦血管疾病是2型糖尿病(T2DM)患者致死致殘的主要原因，T2DM是心肌梗死、腦梗死等動(dòng)脈粥樣硬化疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

目前，研究[1-3]認(rèn)為，動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥反應(yīng)參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂、血栓形成的全過程。T細(xì)胞激活是動(dòng)脈粥樣硬化重要的炎性致病因素之一[4]。TNFRSF4(OX40,CD134)及其配體TNFSF4(OX40L,CD134L)作為免疫應(yīng)答過程中重要的協(xié)同刺激分子，可促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的抗原呈遞功能，影響動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程[5]。最新研究[6]顯示，TNFRSF4基因所在區(qū)域，與小鼠的1個(gè)動(dòng)脈粥樣硬化數(shù)量性位點(diǎn)鄰近，與心肌梗死及動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。糖尿病是一種細(xì)胞免疫性疾病[7-8]，目前尚未見TNFRSF4/TNFSF4這一參與免疫反應(yīng)的信號(hào)通路與T2DM的相關(guān)性研究。本研究旨在探討四川南充地區(qū)漢族人TNFRSF4基因rs17568位點(diǎn)的基因頻率分布及其與T2DM的相關(guān)性，為探討中國漢族人T2DM發(fā)病的分子遺傳基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2014年7月至2015年6月于南充市中心醫(yī)院就診的220例新診斷的T2DM患者，符合1999年世界衛(wèi)生組織診斷標(biāo)準(zhǔn)：典型糖尿病癥狀(多飲、多尿、多食、體質(zhì)量下降)加上隨機(jī)血糖(Glu)≥11.1 mmol/L， 或加上空腹血糖(FBG)≥7.0 mmol/L， 或加上葡萄糖負(fù)荷后2 h血糖(PBG)≥11.1 mmol/L。糖尿病病程少于1年，經(jīng)藥物治療后糖化血紅蛋白(HbA1c)<6.5%。其中，男136例， 女84例，年齡(51.3±12.5)歲。排除1型糖尿病、其他特殊類型糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病急性并發(fā)癥、感染、應(yīng)激、高血壓病、嚴(yán)重高脂血癥及心、肺、肝、腎等主要臟器嚴(yán)重疾患者，入選者均為漢族。同時(shí)，隨機(jī)選取無血緣關(guān)系的健康體檢者186例， 均為漢族。其中，男119例，女67例，年齡(52.1±14.2)歲。經(jīng)詢問病史和體檢，排除心、肺、肝、腎及內(nèi)分泌疾病等。所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血液基因組DNA的分離及聚合酶鏈反應(yīng) 抽取空腹12～14 h 靜脈血1 mL，EDTA 抗凝。按Erlich[9]微量DNA 全血提取法提取基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。PCR擴(kuò)增引物由北京百泰克公司合成。引物1為 5′-CCA GCC ACG CAG CCC CAG AA -3′，引物2為 5′-CTG GGT GGG GTC CAC AGG AGG G-3′。

PCR反應(yīng)總體積25 μL，含0.5 μmol/L 引物，200 μmol/ L dNTP，25 mmol/L MgCl2，0.2 μg DNA 模板，2.0 U Taq DNA 聚合酶。反應(yīng)在DNA熱循環(huán)儀上進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)35次；72 ℃延伸5 min，結(jié)束反應(yīng)。用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定取10 μLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物，加入10 U 限制性內(nèi)切酶Mbo II，37 ℃保溫4 h。酶切產(chǎn)物加入10% 聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)樣品槽中，在TBE緩沖液中，100 V電壓電泳90 min，EB染色后于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照并記錄結(jié)果。

1.2.3突變序列測定隨機(jī)挑選部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA 序列測定。

1.2.4血脂及載脂蛋白的測定Glu、血清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)按酶法測定。低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C) 按公式 (TG<4.52 mmol/L) 計(jì)算：LDL-C=TC-(TG/2.1+HDL-C)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1T2DM組和對(duì)照組臨床及生化資料

T2DM組和對(duì)照組年齡、性別構(gòu)成基本一致。與對(duì)照組比較，T2DM組的Glu、TG、LDL-C水平升高，而HDL-C水平則降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；血清TC和體質(zhì)量指數(shù)(BMI)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

2.2TNFRSF4基因 rs17568 SNP 位點(diǎn)多態(tài)性分析

PCR擴(kuò)增片段大小為213 bp，用限制性內(nèi)切酶Mbo II消化后，在PAGE電泳譜上顯示3種基因型：GG純合子存在Mbo II酶切位點(diǎn)，顯示183、30 bp；AA純合子Mbo II酶切位點(diǎn)消失，顯示213 bp；AG雜合子顯示213、183、30 bp。因30 bp 的片段太短，電泳后不能在凝膠上顯示，但不影響基因型的判讀。對(duì)3種基因型進(jìn)行DNA 序列測定，測序圖譜如圖2，箭頭所指處為堿基突變位點(diǎn)，測序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果一致(圖1)。

圖1rs17568多態(tài)位點(diǎn)酶切電泳圖

注：M：DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，2，4： 基因型AA；3：基因型GG；5，6：基因型AG

2.3T2DM組與對(duì)照組rs17568基因型及等位基因頻率的比較

T2DM組和對(duì)照組的 TNFRSF4基因rs17568多態(tài)性基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。rs17568等位基因分布在兩組均以A等位基因?yàn)槌Ｒ姷任换颍珿等位基因?yàn)樯僖姷任换?。rs17568多態(tài)位點(diǎn)G等位基因頻率為28.2%，等位基因A、G的頻率在T2DM 組和對(duì)照組分別為71.4%、28.6%和72.3%、27.7%。兩組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表2)。

2.4TNFRSF4基因 rs17568 多態(tài)性不同基因型亞組Glu及血脂水平的比較

T2DM組和對(duì)照組TNFRSF4基因rs17568 多態(tài)位點(diǎn)血清HDL-C水平在G等位基因攜帶者GG、AG基因型較AA等位基因攜帶者增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。rs17568 多態(tài)位點(diǎn)不同基因亞組Glu、TG、TC、LDL-C差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。

注：與基因型AA亞組比較，*P<0.05

3討論

TNFRSF4(OX40)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)受體超家族成員之一，基因位于染色體1p36，為Ⅰ型跨膜糖蛋白，定位于活化的CD4+ 和CD8+ T淋巴細(xì)胞表面，主要表達(dá)于CD4+T細(xì)胞表面，與配體TNFSF4(OX40L)參與T 細(xì)胞的活化、增殖和遷移[10]，影響動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展，在免疫應(yīng)答中發(fā)揮極其重要的作用。研究[11]表明，TNFRSF4主要表達(dá)在炎性浸潤部位的T細(xì)胞上，而非炎性浸潤部位幾乎沒有表達(dá)。Foks等[12]在LDL受體缺陷的小鼠實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，阻斷OX40/OX40L信號(hào)通路，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的復(fù)發(fā)。研究[13]發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，1型糖尿病患兒CD4+免疫細(xì)胞表達(dá)更高水平的OX40。有研究[14]表明，OX40/OX40L信號(hào)通路可能為糖尿病患者器官移植保護(hù)提供新治療靶點(diǎn)。但TNFRSF4基因SNP與中國漢族T2DM的相關(guān)性研究目前尚無研究。

本研究對(duì)四川南充地區(qū)406名漢族人OX40基因rs17568 多態(tài)位點(diǎn)基因型分析顯示，rs17568多態(tài)位點(diǎn)G等位基因的頻率為28.2%，與日本人的25%[15]及瑞典人的23%[16]接近，未顯示rs17568基因頻率存在明顯的種族差異性。T2DM組和對(duì)照組rs17568多態(tài)位點(diǎn)A、G等位基因頻率分別71.4%、28.6%和72.3%、27.7%，兩位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率在T2DM組和對(duì)照組之間的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示rs17568 多態(tài)位點(diǎn)與T2DM間沒有直接關(guān)聯(lián)。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TNFRSF4基因rs17568 多態(tài)位點(diǎn)G等位基因攜帶者的血清HDL-C水平高于非G等位基因攜帶者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，這一相關(guān)性在正常人群和T2DM患者中同時(shí)存在。對(duì)瑞典健康人群的研究[16]發(fā)現(xiàn)，rs17568常見G等位基因攜帶者反而出現(xiàn)低水平的HDL-C，但沒有發(fā)現(xiàn)其與其他血脂及脂蛋白有相關(guān)性，提示不同種族間基因多態(tài)性可能對(duì)血脂存在不同作用。Ria等[16]對(duì)OX40進(jìn)行基因測序分析發(fā)現(xiàn)，其序列高度保守，只有rs17568位于編碼區(qū)，但這一變異并沒有引起相應(yīng)氨基酸改變，而G等位基因分布頻率在心梗的病人組要低于對(duì)照組。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，rs17568與一相鄰基因的多態(tài)性有強(qiáng)的連鎖不平衡性。rs17568與HDL-C的相關(guān)性，是由與其連鎖不平衡的多態(tài)位點(diǎn)決定還是其他原因，有待更深的研究，但目前不能推論這一相關(guān)性與T2DM有關(guān)。

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Analysis of TNFRSF4 gene rs17568 Polymorphisms in Patients with Type 2 Diabetes Mellitus

QiaoYan1,XieXisheng2△,LiuRui3,HeMinghai1.

1.DepartmentofEndocrinology,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,China;2.DepartmentofNephrology,NanchongCentralHospital,Nanchong637000,China; 3.DivisionofPeptidesRelatedwithHumanDiseases,WestChinaHospitalofSichuanUniversity,Chengdu610041,China

【Key words】TNFRSF4; Type 2 diabetes mellitus; Gene polymorphism

【Abstract】ObjectiveTo investigate the rs17568 polymorphisms of TNFRSF4 gene and their correlation with type 2 diabetes mellitus among people of Han race in the Nanchong area of Sichuan Province. MethodsThe genotypes and allele frequencies of rs17568 polymorphisms were assayed by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) among 186 healthy subjects and 220 type 2 diabetes mellitus (T2DM) patients. Then the enzymatic kits were used to assay their serum glucose (Glu), serum triglycerides (TG), total cholesterol (TC) and high density lipoprotein cholesterol (HDL-C). ResultsThe allele and genotype frequencies at rs17568 site were in accordance with Hardy-Weinberg equilibrium principle. The frequencies of G allele at rs17568 site were 0.286 and 0.276 in the T2DM group and the control group respectively and there was no significant difference in allele and genotypes frequencies between the two groups (P>0.05). Subjects with genotype GG and AG at rs17568 sites had a higher serum concentration of HDL-C than those with genotype AA in both groups (P<0.05). ConclusionThe rs17568 polymorphisms in the TNFRSF4 gene are not correlated with type 2 diabetes mellitus, but the G allele at rs17568 site is correlated with serum high density lipoprotein cholesterol among people of Han race.

doi:10.3969/j.issn.1674-2257.2016.03.008

*基金項(xiàng)目：四川省衛(wèi)生廳資助項(xiàng)目(No:120283)

通信作者：△謝席勝，E-mail:xishengx@163.com

【中圖分類號(hào)】R587.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1053.016.html

·論著·