慢性乙型肝炎患者血清脂質(zhì)組學(xué)研究*

楊蕊旭，胡春秀，陳國鳳，孫長(zhǎng)貴，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，許國旺，范建高

·乙型肝炎·

慢性乙型肝炎患者血清脂質(zhì)組學(xué)研究*

楊蕊旭，胡春秀，陳國鳳，孫長(zhǎng)貴，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，許國旺，范建高

目的通過血清脂質(zhì)組學(xué)分析，研究CHB患者脂質(zhì)代謝特征。方法在健康人（n=23）和肝活檢證實(shí)的CHB患者（n=17），采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定血清脂質(zhì)組學(xué)代謝產(chǎn)物；構(gòu)建正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）模型，結(jié)合單因素分析篩選差異脂質(zhì)。結(jié)果CHB組與健康人脂質(zhì)代謝輪廓有顯著性差異［OPLS-DA: R2=0.775，Q2=0.518，P（CV-ANOVA）=2.81× 10-4］，篩選出64種顯著改變的脂質(zhì)（VIP＞1，P＜0.05）。其中包括游離脂肪酸（FFA）、二酰甘油（DAG）、三酰甘油（TAG）、膽固醇酯（CE）、神經(jīng)酰胺（Cer）、鞘磷脂（SM）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰肌醇（PI）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、縮醛磷脂酰乙醇胺（PlsEtn）等；CHB組DAG、CE、LPC、PlsEtn、Cer顯著降低（均值較健康人降低百分比分別為18%、17%、10%、32%和29%，P＜0.05）；TAG中含高碳原子數(shù)目、多不飽和鍵脂肪酸的TAG降低（P＜0.05）；飽和以及單不飽和鍵的PC升高，含多不飽和鍵的PC下降（P＜0.05）；CHB組游離單不飽和脂肪酸（F-MUFA）較健康人升高36%（P＜0.05），且與METAVIR肝組織炎癥活動(dòng)和纖維化評(píng)分呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)性分析：活動(dòng)性r=0.527，P＜0.05，纖維化r=0.540，P＜0.05）。結(jié)論CHB患者脂質(zhì)代謝與正常人有顯著差異，脂質(zhì)組學(xué)分析可能為評(píng)價(jià)肝臟炎癥活動(dòng)和纖維化程度提供無創(chuàng)診斷依據(jù)。

慢性乙型肝炎；脂質(zhì)組學(xué)；超高效液相色譜；串聯(lián)質(zhì)譜

在全球范圍內(nèi)，乙型肝炎病毒感染是慢性肝病的重要病因之一[1]。在我國，慢性乙型肝炎（CHB）是主要的導(dǎo)致肝硬化及肝細(xì)胞癌的疾病[2]。肝活檢作為評(píng)估肝臟炎癥活動(dòng)度和纖維化程度的金標(biāo)準(zhǔn)，但因取樣誤差或可能存在的并發(fā)癥等原因在臨床上應(yīng)用受限，而血清無創(chuàng)診斷研究如血清標(biāo)志物、血清診斷模型、組學(xué)等在慢性肝病的評(píng)估中具有無創(chuàng)性、可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)而逐漸受到重視[3]。脂質(zhì)組學(xué)作為代謝組學(xué)的重要分支，可定性定量地研究生物體脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，可為疾病脂質(zhì)代謝特征的評(píng)估、發(fā)病機(jī)制的研究、血清標(biāo)志物的篩選提供新的研究策略[4]。本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析了CHB患者和健康成人血清脂質(zhì)組學(xué)狀況，旨在探討CHB患者脂質(zhì)代謝的特點(diǎn)，并初步分析其作為判斷CHB患者肝臟炎癥活動(dòng)和纖維化程度診斷的潛在指標(biāo)的可能性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象2012年1月至2013年6月于上海新華醫(yī)院和北京解放軍第302醫(yī)院診治的CHB患者17例，男性9例，女性8例；平均年齡（38.2± 3.3）歲。診斷參照《慢性乙型肝炎防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷，即既往有乙型肝炎病史或者HBsAg陽性超過6個(gè)月，現(xiàn)血清HBsAg和（或）HBV DNA陽性，肝活檢組織病理學(xué)檢查提示慢性肝炎[5]。排除其它嗜肝病毒感染、先天性、自身免疫性、藥物、毒物、酒精性肝病和糖尿病。另選23例健康成人，男性14例，女性9例；平均年齡（39.9±1.2）歲，無酒精濫用（每日飲酒量小于20克乙醇）、慢性肝病病史，肝功能正常，腹部超聲和Fibroscan檢測(cè)正常。本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者給出知情同意書，并遵照《赫爾辛基宣言》的原則實(shí)施研究。

1.2 檢測(cè)和檢查使用7600-120型自動(dòng)生化分析儀（日本HITACHI公司）檢測(cè)肝功能、血脂、空腹血糖；使用Fibroscan（法國Echos公司）檢測(cè)肝硬度(LSM)和受控衰減參數(shù)（CAP）。對(duì)CHB患者采用18 G一次性活檢穿刺針（美國BARD生物系統(tǒng)公司）在超聲定位下行肝臟穿刺，病理標(biāo)本經(jīng)3名病理學(xué)專家采用METAVIR評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)分期。

1.3 血清脂質(zhì)組學(xué)分析在采樣前，要求研究對(duì)象避免劇烈運(yùn)動(dòng)、飲酒和咖啡等。采集空腹靜脈血。采用甲基叔丁基醚（MTBE）-甲醇提取體系預(yù)處理血清。為評(píng)價(jià)測(cè)定過程的穩(wěn)定性，將質(zhì)量控制（QC）樣本穿插在分析序列中。采用超高效液相色譜（美國Waters）和四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（TripleTOF 5600，美國AB SCIEX）測(cè)定。色譜條件：色譜分離柱UPLC ACQUITY C18（2.1 mm× 100 mm×1.7μm），柱溫55℃，流動(dòng)相A:乙腈/水（比例3/2），流動(dòng)相B:異丙醇/乙腈（比例9/1），流動(dòng)相A、B含10 mM乙酸銨，流速：0.26 ml/min。質(zhì)譜條件：ESI正負(fù)離子掃描模式。質(zhì)譜參數(shù)：離子源電壓分別為4500 V（-）和5500 V（+），去簇電壓為100 V（-）和100 V（+），接口加熱器溫度為600℃（-）和500℃（+）。應(yīng)用Analyst TF、LipidView、PeakView、MultiQuant系列軟件（美國AB SCIEX）采集數(shù)據(jù)、定性、定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SIMCA-P 13.0（瑞典Umetrics）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用UV轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)，構(gòu)建正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）模型，進(jìn)行總結(jié)、分類及判別分析，采用7次交叉驗(yàn)證檢測(cè)模型可靠性。根據(jù)OPLS-DA模型得到變量權(quán)重值（VIP），初步篩選CHB患者血清顯著變化的代謝物。應(yīng)用SPSS 22.0（美國SPSS）對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（正態(tài)分布的數(shù)據(jù)）或Mann-Whitney U檢驗(yàn)（非正態(tài)分布數(shù)據(jù)）進(jìn)行單因素分析，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)，聯(lián)合VIP值＞1和P＜0.05篩選差異脂質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況與健康人比，CHB患者血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶等指標(biāo)和LSM顯著升高（P＜0.05），而BMI、白蛋白、膽固醇、載脂蛋白則較健康人低（P＜0.05），兩組性別、年齡、腰圍、空腹血糖，CAP等指標(biāo)則無顯著性差異（P＞0.05，表1）。

表1 研究對(duì)象基本資料（n,±s）

表1 研究對(duì)象基本資料（n,±s）

與健康人比，①P＜0.05 BMI:體質(zhì)指數(shù)；LSM:肝臟硬度測(cè)定；CAP：受控衰減參數(shù)

2.2 脂質(zhì)組學(xué)多元分析結(jié)果基于UPLC-MS/MS分析40例研究對(duì)象血清，共定性定量檢出239種脂質(zhì)。質(zhì)量控制樣本99%離子峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜30%，表明所測(cè)得的代謝物整體表現(xiàn)穩(wěn)定。數(shù)據(jù)經(jīng)過UV轉(zhuǎn)換后，建立OPLS-DA模型得分圖（圖1），可見CHB組與健康人血清脂質(zhì)分布有明顯差異。7次交叉驗(yàn)證所得模型穩(wěn)定性指標(biāo)R2=0.775，預(yù)測(cè)性指標(biāo)Q2=0.518，說明模型分類預(yù)測(cè)性和可重復(fù)性較高；P（CV-ANOVA）=2.81×10-4，表明組別分離程度顯著。結(jié)合VIP值與單因素分析，篩選出64種差異脂質(zhì)。顯著差異的分子主要包括長(zhǎng)鏈多不飽和鍵的三酰甘油（TAG）下降，飽和以及單不飽和鍵的磷脂酰膽堿（PC）升高，多不飽和鍵的PC下降，部分分子量的二酰甘油（DAG）、膽固醇酯（CE）、神經(jīng)酰胺（Cer）、鞘磷脂（SM）、溶血磷脂酰膽堿（LPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（PlsEtn）下降，部分分子量的磷脂酰肌醇（PI）升高（表2）。

圖1 慢性乙型肝炎和健康人OPLS-DA得分圖

表2 慢性乙型肝炎與健康人差異脂質(zhì)代謝產(chǎn)物比較

表2 續(xù)表

2.3 CHB患者血清脂質(zhì)組學(xué)改變CHB患者血清總脂質(zhì)與健康人比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；CHB患者游離單不飽和脂肪酸（F-MUFA）較健康人顯著升高（P＜0.05）；CHB患者DAG（P＜0.05）和CE（P＜0.005）較健康人顯著下降。在鞘脂中，乙型肝炎患者Cer和部分SM較健康人顯著降低（P＜0.005,圖2A、B，表2）。在磷脂中，CHB患者LPC（P＜0.05）和縮醛磷脂，如PlsEtn（P＜0.005）較健康人顯著下降，總PC、PE、PI與健康人比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；PC/PE比值較健康人顯著下降（P＜0.05）。慢性乙型肝炎患者高碳原子數(shù)目和大于三個(gè)不飽和鍵數(shù)目的TAG較健康人顯著下降（P＜0.05,圖2C、D，表2）。

圖2 慢性乙型肝炎患者血清脂質(zhì)代謝的變化

2.4 不同肝組織病理學(xué)評(píng)分患者血清脂質(zhì)分析根據(jù)METAVIR評(píng)分系統(tǒng)評(píng)價(jià)CHB患者肝組織炎癥活動(dòng)度，將慢性乙型肝炎患者分為低炎癥活動(dòng)組（METAVIR活動(dòng)性0～1分）10例和高炎癥活動(dòng)組（METAVIR活動(dòng)性2～3分）7例，發(fā)現(xiàn)高炎癥活動(dòng)組F-MUFA較低炎癥活動(dòng)組顯著升高（P＜0.05，圖3A）；以F-MUFA（＞1.215）區(qū)別不同炎癥程度的AUC為0.883（95%CI:0.717～1.000），相關(guān)性分析提示F-MUFA與活動(dòng)性評(píng)分呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)性分析：r=0.527，P=0.036）；11例慢性乙型肝炎顯著纖維化（METAVIR纖維化2～4分）患者F-MUFA水平較6例非顯著纖維化（METAVIR纖維化0～1分）患者顯著升高（P＜0.05，圖3B）；以F-MUFA（＞1.346）區(qū)別不同纖維化程度的AUC為0.800（95%CI: 0.570～1.000），且F-MUFA與纖維化評(píng)分呈正相關(guān)（Spearman相關(guān)性分析：r=0.540，P=0.032）。

圖3 不同肝組織炎癥活動(dòng)度和纖維化程度CHB患者血清游離單不飽和脂肪酸水平比較

3 討論

有研究報(bào)道CHB患者肝脂肪變與代謝因素相關(guān)而與病毒因素不相關(guān)[6]。亦有研究報(bào)道，慢性HBV感染與代謝綜合征的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)[7]，CHB患者血清TAG水平、HDL水平較非感染者降低，而血清脂聯(lián)素、內(nèi)脂素升高，且與病毒載量相關(guān)[8，9]。另一方面，有研究報(bào)道CHB患者合并代謝綜合征可促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展[10]。

CHB患者血清含高碳原子數(shù)目和多不飽和鍵的TAG顯著下降，意味著長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸減少，可能與慢性炎癥使細(xì)胞抗氧化能力、細(xì)胞增殖和存活能力改變有關(guān)。慢性HBV和HCV感染者多不飽和脂肪酸的補(bǔ)充可減少肝細(xì)胞癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[11]。CHB組F-MUFA較健康人顯著升高，意味著硬脂酰輔酶A去飽和酶1（SCD1）活性升高。SCD1作為飽和脂肪酸向單不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化的重要限速酶，其活性與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，可能成為一個(gè)治療靶點(diǎn)[12]。

鞘脂是細(xì)胞膜和脂蛋白的組成部分，同時(shí)也參與細(xì)胞增殖分化、細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等過程的調(diào)控。CHB和肝硬化患者SM水平下降[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，CHB組多數(shù)Cer和SM較健康人顯著降低，可能與SM水解增多，合成受抑制有關(guān)。CHB組超長(zhǎng)鏈Cer顯著降低，而長(zhǎng)鏈Cer與超長(zhǎng)鏈Cer有相反的生理特性，長(zhǎng)鏈Cer升高與超長(zhǎng)鏈Cer下降可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。血清特定分子量Cer和SM與HBV感染導(dǎo)致的慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）MELD評(píng)分、肝活檢炎癥分級(jí)以及預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[15,16]。本研究發(fā)現(xiàn)Cer和SM在CHB患者下降，但與肝臟組織炎癥和纖維化程度以及HBV DNA水平并無顯著性相關(guān)。

本研究CHB組多數(shù)LPC較健康人下降。LPC作為與細(xì)胞增殖、炎癥相關(guān)的重要信號(hào)分子，在慢性肝病和肝細(xì)胞癌患者下降[17]，而PlsEtn作為縮醛磷脂，是內(nèi)源性抗氧化劑，與細(xì)胞抗氧化能力相關(guān)[18]。CHB組PLsEtn下降可能意味著抗氧化能力下降。含飽和以及單不飽和鍵的PC升高，說明脂質(zhì)從頭合成過程增多，而作為細(xì)胞膜的組成部分，多不飽和PC下降可導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)流動(dòng)性下降和抗氧化能力下降。PC/PE比值下降意味著PE生成增多、PC生成減少或者磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（PEMT）活性降低，導(dǎo)致PE向PC轉(zhuǎn)換減少。該酶表達(dá)的減少往往與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、肝細(xì)胞增生以及肝細(xì)胞癌的發(fā)生相關(guān)[19，20]。

通過UPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)CHB患者血清脂質(zhì)組學(xué)的分析發(fā)現(xiàn)CHB患者脂類代謝如三酰甘油、鞘脂、磷脂分布、縮醛磷脂以及脂肪酸等的代謝有顯著改變，這些脂質(zhì)代謝的差異可能與CHB患者細(xì)胞凋亡、增生、抗氧化能力改變相關(guān)。結(jié)合CHB患者肝臟組織炎癥、纖維化程度與脂質(zhì)相關(guān)性的分析，可為尋找潛在的無創(chuàng)診斷血清標(biāo)志物提供依據(jù)。

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（收稿：2016-05-17）

（本文編輯：陳從新）

Serum lipidom icanalysis of patients with chronic hepatitis B

Yang Ruixu，Hu Chunxiu，Chen Guofeng，et al.Center for Fatty Liver Study，

Department of Gastroenterology，XinHua Hospital，Jiao Tong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Fan Jiangao.E-mail:fattyliver2004@126.com

Objective The aim of this study was to investigate serum lipid profiling of patients with chronic hepatitis B（CHB）.M ethods A ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/ MS）platform was applied for serum lipid profiling in 17 patients with CHB and 23 healthy volunteers.Orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）model and univariate analysis were established to analyze the characteristic metabolites and the association with histological severities.Resu lts There were significant lipids changes in the CHB patients［OPLS-DA:R2=0.775，Q2=0.518，P（CV-ANOVA）=2.81×10-4］，and 64 lipids with significant differences（VIP＞1，P＜0.05）between the two groups were found；These lipids belonged to categories of free fatty acid（FFA），triglyceride（TAG），diglyceride（DAG），cholesterol ester（CE），ceramide（Cer），sphingomyelin（SM），phosphatidylcholine（PC），phosphatidylinositol（PI），lysophosphatidylcholine（LPC），ethanolamine plasmalogen（PlsEtn）；There were lower levels of CE，DAG，Cer，LPC，PlsEtn in CHB（decreased by 18%，17%，10%，32%and 29%，P＜0.05）；TAG with higher carbon numbers and double bonds significantly decreased（P＜0.05）；PC with lower double bonds significantly increased and PC with higher double bonds decreased（P＜0.05）；The free monounsaturated fatty acids increased in CHB（increased by 36%，P＜0.05）and were positively correlated with the METAVIR inflammation and fibrosis scores（Spearman correlation r=0.527，P＜0.05 in activity，r=0.540，P＜0.05 in fibrosis）. Conclusion The patients with CHB have numerous changes in lipid metabolism，and the lipidomic profiling may provide possible non-invasive method for the evaluation of hepatic injuries in patients with CHB.

Hepatitis B；Lipidom ics；Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.06.006

國家973課題（編號(hào)：2012CB517501）；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（編號(hào)：81270491/81470840）；上海市科委重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào)：10411956300）；上海市衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀學(xué)科帶頭人計(jì)劃（編號(hào)：XBR2011007）

200092上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化內(nèi)科暨脂肪肝診治中心（楊蕊旭，孫婉璐，陳光榆，潘勤，沈峰，范建高）；中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所/中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（胡春秀，許國旺）；解放軍第302醫(yī)院肝纖維化診療中心（陳國鳳）；江蘇省昆山市錦溪人民醫(yī)院（孫長(zhǎng)貴）

楊蕊旭，女，25歲，博士研究生。主要從事非酒精性脂肪性肝病相關(guān)研究。E-mail:ruixu.yang@hotmail.com

范建高，E-mail:fattyliver2004@126.com