不同時(shí)間頭針對MCAO大鼠腦皮質(zhì)JAK2/STAT5信號(hào)通路的影響*

梁 超，陳邦國，王靜芝，姜 濤

(1.海口市中醫(yī)醫(yī)院，海南?？?570216;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430000)

不同時(shí)間頭針對MCAO大鼠腦皮質(zhì)JAK2/STAT5信號(hào)通路的影響*

梁 超1，陳邦國2，王靜芝2，姜 濤1

(1.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南?？?570216;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430000)

目的:觀察不同時(shí)間頭針對MCAO大鼠腦皮質(zhì)JAK2/STAT5信號(hào)通路的影響。方法:將100只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組和假手術(shù)組各10只，模型組和頭針組各40只，采用大腦中動(dòng)脈線栓法(MCAO)制備模型，電針頭穴“頂顳前斜線”、“頂顳后斜線”進(jìn)行治療。HE染色觀察腦皮質(zhì)病理形態(tài)，ELISA檢測IL-6含量，Western Blotting法檢測腦皮質(zhì)P-JAK2、PSTAT5蛋白含量。結(jié)果:HE染色后見神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞腫脹、縮小、變形，胞漿嗜伊紅濃染，胞質(zhì)疏松，微血管損傷，頭針后損傷明顯減輕;除IR 24 h外，頭針組IL-6含量均多于模型組，特別是IR 48 h差異最明顯;IR 12 h和IR 72 h，頭針組P-JAK2蛋白含量較模型組明顯增多;頭針后MCAO大鼠P-STAT5蛋白表達(dá)較模型組增加明顯。結(jié)論:頭針能有效減輕腦缺血再灌注大鼠缺血局部腦皮質(zhì)的早期炎癥反應(yīng)，這可能與其促進(jìn)JAK2/STAT5信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。

MACO大鼠;頭針;IL-6;P-JAK2;P-STAT5

JAK-STAT信號(hào)途徑是一條多種細(xì)胞因子共用作用的傳導(dǎo)通路，大腦缺血缺氧后參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程［1-2］。通過調(diào)控JAK2/STAT5信號(hào)通路可以影響神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等凋亡、增殖和分化，由此保護(hù)神經(jīng)元，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)功能重塑，以修復(fù)缺血腦組織的損傷［3］。本實(shí)驗(yàn)以此理論為基礎(chǔ)，觀察頭針治療后缺血腦皮質(zhì)中 IL-6含量變化和JAK2/STAT5信號(hào)通路的激活情況，探討頭針療法減輕腦缺血再灌注損傷可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

健康成年清潔級(jí)SD大鼠100只(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK (鄂)2014-0009)，雌雄不拘，體質(zhì)量(200±20)g。于實(shí)驗(yàn)前1周一次性購進(jìn)，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強(qiáng)光的環(huán)境中，室溫(20±2)℃，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑 P-JAK2兔抗大鼠多克隆抗體、P-STAT5兔抗大鼠多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體(以上抗體均購自KPL公司)，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白抽提試劑盒、Bradford蛋白濃度測定試劑盒、PMSF(苯甲基磺酸氟100 mM)、磷酸化蛋白酶抑制劑、麗春紅染液、考馬斯亮藍(lán)G250染液、抗體洗脫液、顯影定影液(均購自谷歌生物)，超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒BeyoECL Plus(碧云天生物技術(shù)研究所)，牛血清白蛋白(Roche，北京索萊寶科技有限公司)，蛋白Marker(10-170 kDa，F(xiàn)ermentas)，白細(xì)胞介素-6(IL-6)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒(美國Sigma公司)。

1.2.2 主要儀器 電泳儀(北京市六一儀器廠，型號(hào)DYY-6C)、轉(zhuǎn)移電泳儀槽(北京市六一儀器廠，型號(hào)DYCZ-400D)、垂直電泳槽(北京市六一儀器廠，型號(hào)DYCZ-24DN)、臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)TGL-16c)、磁力攪拌棒(常州澳華儀器有限公司，型號(hào)79-1)、脫色搖床(北京六一儀器廠，型號(hào)WD-9405A)、水浴鍋(姜堰市天力醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)TL-420D)、暗匣(廣東粵華醫(yī)療器械廠有限公司，型號(hào)AX-Ⅱ)。

1.3 分組

100只SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組(按缺血再灌注12 h、24 h、48 h、72 h分4個(gè)亞組)、頭針組(按以上缺血再灌注時(shí)間分別加頭針刺激，分4個(gè)亞組)，每個(gè)亞組10只，假手術(shù)組和正常對照組各10只。

1.4 模型制備方法

參照Longa［4］線栓法加以改進(jìn)，制備MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，稱重，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉;仰臥固定于手術(shù)臺(tái)，常規(guī)備皮消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉，暴露并分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(Common carotid arternal，CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal carotid artery，ICA)、頸外動(dòng)脈(External carotid artery，ECA)。電凝ECA的分支，結(jié)扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動(dòng)脈(Pterygo palatine artery，PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一動(dòng)脈夾。將ECA殘端輕拉向下剪0.2 mm小口，輕推尼龍線尾端經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱至大腦中動(dòng)脈(Middle cerebral artery，MCA)，在線栓經(jīng) MCA和PPA分叉處時(shí)用玻璃分針調(diào)整方向，以便線栓順利進(jìn)入MCA。尼龍線插入深度由CCA分叉部計(jì)約18 mm。栓塞60 min拉出尼龍線，使血流再灌?？p合切口，切口處涂灑青霉素粉并用碘酒消毒。手術(shù)后大鼠室溫下禁食給水喂養(yǎng)，蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評分以判斷是否造模成功。只有神經(jīng)功能障礙在1級(jí)以上的大鼠保留。

1.5 治療方法

根據(jù)中國針灸學(xué)會(huì)制定的《頭皮針穴名國際標(biāo)準(zhǔn)化方案》，選取雙側(cè)頂顳前斜線、頂顳后斜線，并結(jié)合《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》大鼠穴位圖譜模擬人體經(jīng)穴定位。頂顳后斜線:“百會(huì)”(頂骨正中點(diǎn))至“曲鬢”(為耳緣直上與耳尖水平線的交點(diǎn));頂顳前斜線:頂顳后斜線向前平移0.1寸。針刺方法:選用30號(hào)1寸一次性無菌針灸針，分別從頂骨中點(diǎn)向耳根前與頭皮呈15°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后，同側(cè)頭穴為一對，接LH202H型韓氏穴位神經(jīng)刺激儀，采用疏密波，頻率2 Hz/100 Hz，強(qiáng)度1 mA，每次持續(xù)刺激30 min。頭針I(yè)R12組的治療在大鼠手術(shù)蘇醒后12 h進(jìn)行，以后的治療每隔24 h進(jìn)行1次，并于取材前2 h行最后1次治療。正常對照組、假手術(shù)組和模型組按治療時(shí)間同樣抓取，不進(jìn)行任何治療。連續(xù)觀察10 d，詳細(xì)觀測、記錄各組大鼠的一般情況、體質(zhì)量和血壓。

1.6 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.6.1 HE染色法觀察缺血局部腦皮質(zhì)病理形態(tài)變化 大鼠灌注后迅速取腦，剝離腦膜除去嗅球、延髓和小腦，在視交叉平面前后2 mm處將腦冠狀切開，所取組織置于固定液中進(jìn)行脫水、包埋、切片，用二甲苯和無水乙醇進(jìn)行切片脫蠟，放入Harris蘇木素染3～8 min，自來水洗，1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍(lán)，流水沖洗;再入伊紅染液中染色1～3 min;將切片依次放入95%酒精I(xiàn) 5 min－95%酒精I(xiàn)I 5 min－無水乙醇Ⅰ5 min－無水乙醇Ⅱ5 min－二甲苯Ⅰ5 min－二甲苯Ⅱ5 min中脫水至透明后晾干，中性樹膠封片。

1.6.2 IL-6含量測定 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.3 P-JAK2、P-STAT5蛋白含量測定 頸椎脫臼法處死大鼠，冰上剝?nèi)∧X皮質(zhì)充分勻漿(在碎冰塊中進(jìn)行)，振蕩并冰浴30 min，12000 g離心5 min，收集上清為總白蛋白液，－80℃保存?zhèn)溆?采用Bradford方法測定蛋白濃度，在40 μg蛋白標(biāo)本中加入適當(dāng)體積的5×蛋白上樣緩沖液，95～100℃處理5 min;根據(jù)蛋白質(zhì)20KD相對分子量選用對應(yīng)濃度的分離膠，按濃縮膠75 V、分離膠120 V進(jìn)行恒壓電泳，至溴酚藍(lán)剛出膠;以200 mA/h為條件進(jìn)行轉(zhuǎn)膜;脫色搖床上用5%的脫脂牛奶(0.5%TBST配)封閉30 min;用TBST溶解的5%脫脂牛奶稀釋一抗，4℃過夜;室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min;將辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體，用TBST稀釋3000倍，室溫下孵育30 min;用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次5 min，最后進(jìn)行顯影和定影，Alpha軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的吸光度值。以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算 P-JAK2/β-actin、P-STAT5/ β-actin吸光度比值，反映P-JAK2和P-STAT5相對含量變化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析和q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同時(shí)間腦皮質(zhì)病理形態(tài)

HE染色后光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常組和假手術(shù)組大鼠腦皮質(zhì)形態(tài)正常，染色均勻，組織結(jié)構(gòu)清晰致密，細(xì)胞質(zhì)淡紅色，胞核藍(lán)染，輪廓清楚;假手術(shù)組僅見極少量炎性細(xì)胞。造模后大鼠局部腦皮質(zhì)可見神經(jīng)細(xì)胞減少，胞漿疏松，胞體縮小、變形，染色變淺;間質(zhì)水腫，炎性細(xì)胞增多，微血管內(nèi)皮水腫明顯甚至脫落，管腔變形;微血管周圍間隙增寬，周圍結(jié)構(gòu)不清。頭針治療后，其組織結(jié)構(gòu)紊亂及間質(zhì)水腫明顯減輕。

2.2 大鼠腦皮質(zhì)IL-6含量比較

表1顯示，假手術(shù)組IL-6含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);造模后IL-6明顯增多，除IR 24 h外，頭針組IL-6含量均少于模型組(P＜0.05)，特別是在IR 48 h時(shí)差異最明顯(P＜0.01)。

表1 各組大鼠腦皮質(zhì)IL-6含量比較(±s，pg/mg)

表1 各組大鼠腦皮質(zhì)IL-6含量比較(±s，pg/mg)

注:與同時(shí)間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時(shí)間模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

12 h 24 h 48 h 72 h正常對照組組別 例數(shù)10 2.87±0.63 2.87±0.63 2.87±0.63 2.87±0.63假 手 術(shù) 組 10 2.92±1.01 2.92±1.01 2.92±1.01 2.92±1.01模 型 組 40 8.92±0.39△△ 10.57±0.68△△ 12.39±0.54△△ 11.83±0.83△△頭 針 組 40 7.59±0.92△△# 10.21±0.71△△ 10.77±1.14△△## 10.01±0.76△△#

2.3 大鼠腦皮質(zhì)P-JAK2蛋白含量比較

表2和圖1顯示，假手術(shù)組P-JAK2蛋白含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IR 12 h和IR 72 h頭針組P-JAK2蛋白含量較模型組多(P＜0.05)，而IR 24 h和48 h電針組P-JAK2蛋白含量與同時(shí)間模型組比較，2組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組大鼠腦皮質(zhì)P-JAK2蛋白含量比較(±s)

表2 各組大鼠腦皮質(zhì)P-JAK2蛋白含量比較(±s)

注:與同時(shí)間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時(shí)間模型組比較:#P＜0.05

組別 例數(shù)12 h 24 h 48 h 72 h正常對照組10 0.30±0.38 0.30±0.38 0.30±0.38 0.30±0.38假 手 術(shù) 組 10 0.34±0.59 0.34±0.59 0.34±0.59 0.34±0.59模 型 組 40 0.85±0.09△△ 1.40±0.07△△ 2.04±0.12△△ 1.27±0.52△△頭 針 組 40 1.09±0.34△△# 1.38±0.61△△ 1.92±0.29△△ 1.59±1.09△△#

圖1 各組大鼠腦皮質(zhì)P-JAK2蛋白電泳檢測結(jié)果

2.4 大鼠腦皮質(zhì)P-STAT5蛋白含量比較

假手術(shù)組P-STAT5蛋白含量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);不同缺血再灌注時(shí)間電針組比模型組P-STAT5蛋白含量表達(dá)均多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)P-STAT5蛋白含量比較(±s)

表3 各組大鼠腦皮質(zhì)P-STAT5蛋白含量比較(±s)

注:與同時(shí)間正常對照組比較:△△P＜0.01;與同時(shí)間模型組比較:#P＜0.05，##P＜0.01

組別 例數(shù)12 h 24 h 48 h 72 h正 常對照 組10 0.10±0.38 0.10±0.38 0.10±0.38 0.10±0.38假 手 術(shù) 組 10 0.09±0.59 0.09±0.59 0.09±0.59 0.09±0.59模 型 組 40 0.29±2.21△△ 0.57±1.57△△ 0.86±0.92△△ 0.70±3.43△△頭 針 組 40 0.69±1.54△△# 1.12±1.16△△## 1.47±2.59△△## 1.25±1.05△△##

圖2 各組大鼠腦皮質(zhì)P-STAT5蛋白電泳檢測結(jié)果

3 討論

頭針是一種臨床治療腦血管病常見、簡便、有效的中醫(yī)外治方法，起源于《黃帝內(nèi)經(jīng)》?！鹅`樞·五亂》明確記載:“亂于頭，則為厥逆，頭重眩仆……氣在于頭者，取之天柱大杼?！鳖^為諸陽之會(huì)，氣血聚集之要，“病變在腦、首選督脈”為歷代醫(yī)家的共識(shí)［5-6］。本實(shí)驗(yàn)選用的頭針刺“頂顳前斜線、頂顳后斜線”主要治療中樞性肢體癱和肢體感覺障礙，為改善中風(fēng)后神經(jīng)行為學(xué)障礙的首選［7］，在改善腦電活動(dòng)、縮小梗死體積、抑制神經(jīng)元凋亡等方面療效獨(dú)特［8-9］。

中風(fēng)導(dǎo)致神經(jīng)元壞死并產(chǎn)生局部腦組織的炎癥反應(yīng)，IL-6作為一種多功能單鏈糖蛋白細(xì)胞因子，其表達(dá)水平的高低是反映缺血再灌注炎癥損傷的重要指標(biāo)［10-11］。在本實(shí)驗(yàn)中隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，IL-6的含量相應(yīng)增加，與以往結(jié)論相似。但細(xì)胞因子的這一炎癥效應(yīng)可以向有益的方向轉(zhuǎn)變，取決于其在腦組織中的濃度、缺血再灌注時(shí)間和非常復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的激活［12］。通過病理形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，IR 12 h和IR 24 h腦皮質(zhì)損傷的速度雖快，但基本形態(tài)還算完整，但到后期隨著IL-6含量的不斷增加，局部神經(jīng)元變形壞死、微血管內(nèi)皮脫落、胞質(zhì)疏松、水腫明顯，頭針干預(yù)后能明顯降低皮質(zhì)中IL-6的表達(dá)速度，以減輕炎癥反應(yīng)的程度。另一方面，缺血后JAK2在局部組織的異常激活和過度表達(dá)會(huì)增加炎癥反應(yīng)［12］。本研究也發(fā)現(xiàn)，造模后隨著時(shí)間的延長，腦皮質(zhì)中P-JAK2含量不斷上升，特別是在IR 48 h表達(dá)最多，此時(shí)IL-6的含量也最高，組織結(jié)構(gòu)損傷最嚴(yán)重;對MCAO大鼠給予頭針治療后，雖然在IR 72 h P-JAK2蛋白含量較同時(shí)間模型組的含量多，但高濃度的P-JAK2并沒有引起進(jìn)一步腦損傷，反而受損的神經(jīng)元和微血管開始修復(fù)。這可能與頭針的作用有關(guān)，說明頭針干預(yù)IL-6的分泌可能是通過調(diào)控P-JAK2表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，因?yàn)镴AK2能激活I(lǐng)L-2、IL-6、EPO、INF-γ等相關(guān)炎癥因子受體［14］。

早在2006年，有學(xué)者［15］就檢測到JAK蛋白在SD大鼠腦內(nèi)有廣泛表達(dá)，并與STAT協(xié)同作用來影響腦缺血后神經(jīng)元的凋亡;JAK2的磷酸化可激活下游分子 STAT5，提高缺血區(qū)神經(jīng)元耐缺氧能力［16-17］。通過對P-STAT5蛋白印跡檢測發(fā)現(xiàn)，急性腦缺血后局部腦皮質(zhì)P-STAT5蛋白含量在IR 12 h就開始增加，48 h表達(dá)到峰值，且 P-JAK2與 PSTAT5的表達(dá)水平保持一致。雖然IR 24 h和IR 48 h頭針組P-JAK2減少，但在IR12 h和72 h頭針對P-JAK2蛋白表達(dá)又有促進(jìn)作用;且頭針組P-STAT5蛋白含量一直多于模型組，進(jìn)一步說明頭針對MCAO大鼠局部腦皮質(zhì)中的JAK2/STAT5信號(hào)通路的激活有促進(jìn)作用。

綜上所述，頭針能有效激活急性腦缺血再灌注后局部腦皮質(zhì)中JAK2/STAT5分子信號(hào)通路，促進(jìn)該通路中JAK2、STAT5蛋白分子的磷酸化。在缺血再灌注早期，頭針可能通過降低P-JAK2含量以調(diào)控IL-6的表達(dá)來減輕局部皮質(zhì)的炎癥反應(yīng);在缺血再灌注中后期，可能通過增加P-JAK2蛋白含量促進(jìn)其下游P-STAT5蛋白表達(dá)，以改善受損腦皮質(zhì)的病理形態(tài)。但急性腦缺血后血流再灌注引起的炎癥反應(yīng)涉及多個(gè)分子信號(hào)傳導(dǎo)通路，因此頭針治療的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究和探討。

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《中醫(yī)雜志》(ISSN 1001-1668，CN 11-2166/R)是由中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)和中國中醫(yī)科學(xué)院主辦的全國性中醫(yī)藥綜合性學(xué)術(shù)期刊。1955年創(chuàng)刊以來始終堅(jiān)持“以提高為主，兼顧普及”的辦刊方針，是我國中醫(yī)藥界創(chuàng)刊早、發(fā)行量大、具有較高權(quán)威性和學(xué)術(shù)影響力的國家級(jí)中醫(yī)藥期刊之一，是中國中文核心期刊和科技核心期刊、中國精品科技期刊、首屆國家期刊獎(jiǎng)獲得者和中國期刊方陣雙獎(jiǎng)期刊、新中國60年有影響力的期刊、中國百強(qiáng)科技期刊、中國百種杰出學(xué)術(shù)期刊，榮獲第二屆、第三屆新聞出版政府獎(jiǎng)期刊獎(jiǎng)提名獎(jiǎng)。

《中醫(yī)雜志》主要欄目中當(dāng)代名醫(yī)和臨證心得分別介紹名老中醫(yī)和臨床醫(yī)生辨證用藥治療疑難病的經(jīng)驗(yàn);臨床研究介紹中醫(yī)藥治療的新方法、新成果;學(xué)術(shù)探討、思路與方法、專家論壇、病例討論、綜述、百家園等欄目，提供最新學(xué)術(shù)觀點(diǎn)、研究成果與治療方法，成為學(xué)習(xí)中醫(yī)藥、研究中醫(yī)藥，不斷提高臨床及研究水平的良師益友。

《中醫(yī)雜志》為半月刊，每月2日和17日出版，每期定價(jià)15.00元，全年360元。讀者可以到全國各地郵局辦理訂閱手續(xù)(郵發(fā)代號(hào):2-698)，也可以與本刊讀者服務(wù)部聯(lián)系郵購，郵購免郵費(fèi)。電話:010-64035632，010-64089195。國外發(fā)行:中國國際圖書貿(mào)易總公司(北京399信箱，郵編:100044，代號(hào):M140)。

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海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20158371)-不同時(shí)間頭針對MCAO大鼠缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生的影響研究

梁 超(1984-)，女，湖北武漢人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

△通訊作者:姜 濤(1982-)，男，遼寧沈陽人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel: 15348880418，E-mail:17664226@qq.com。