基于正交設(shè)計(jì)的不同針刺因素對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠HPG軸影響的實(shí)驗(yàn)研究*

閔志云，程立紅，閔友江△，丁李立強(qiáng)，張 輝，裴 佳

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006)

基于正交設(shè)計(jì)的不同針刺因素對(duì)腎陽(yáng)虛大鼠HPG軸影響的實(shí)驗(yàn)研究*

閔志云1，程立紅2，閔友江2△，丁李立強(qiáng)1，張 輝1，裴 佳1

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，南昌 330006;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌 330006)

目的:以皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型為研究對(duì)象，采用正交設(shè)計(jì)研究多個(gè)針刺參數(shù)，探索影響針刺療效的主次因素和針刺參數(shù)的最佳組合。方法:采用L9(34)正交表對(duì)4個(gè)參數(shù)(穴位、捻針角度、頻率、時(shí)間)3水平安排試驗(yàn)，運(yùn)用計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清T、垂體LH的水平和RT-PCR檢測(cè)下丘腦中GnRH mRNA的表達(dá)，以比較上述4個(gè)參數(shù)的主次及每一參數(shù)不同水平的優(yōu)劣。結(jié)果:對(duì)針刺療效的影響由大到小依次為穴位、捻針角度、時(shí)間、頻率，其中穴位是影響針刺療效的主要因素，而捻針角度、頻率、時(shí)間都是次要因素。結(jié)論:針刺治療腎陽(yáng)虛大鼠的最佳參數(shù)為A3B3C2D2，即針刺腎俞、捻針90°、頻率120次/min、捻針60 s;本研究中穴位的選擇對(duì)療效的影響最大，其次為捻針角度，再次是捻針時(shí)間，影響最小的為捻針頻率。

正交設(shè)計(jì);腎陽(yáng)虛;T;LH;GnRH

針灸通過(guò)扶正祛邪、疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽(yáng)作用治療疾病，其扶正祛邪的作用又是通過(guò)針灸補(bǔ)虛與瀉實(shí)的效應(yīng)來(lái)達(dá)到。大多學(xué)者認(rèn)為，針灸補(bǔ)虛瀉實(shí)效應(yīng)和補(bǔ)瀉手法、穴位具有相對(duì)特異性與機(jī)體的狀態(tài)、刺激量大小等因素有關(guān)［1-4］。而刺激量的大小又與針刺強(qiáng)度(提插捻轉(zhuǎn)頻率、捻轉(zhuǎn)角度、提插幅度、針具粗細(xì)、針刺深淺)和針刺時(shí)間(行針時(shí)間、留針時(shí)間、針刺次數(shù)或療程、針刺間隔時(shí)間)相關(guān)［3］。但對(duì)于針刺補(bǔ)瀉效應(yīng)與刺激量、穴位具有相對(duì)特異性是否相關(guān)，針刺刺激量如何做到定量，影響針刺療效的主次因素，能否獲取最佳針刺療效等多個(gè)因素最佳組合等問(wèn)題目前研究［5-7］還有不足之處。筆者為進(jìn)一步科學(xué)、客觀、定量研究針刺療效與不同針刺因素的關(guān)系，故在實(shí)驗(yàn)性腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)上，采用L9(34)正交表對(duì)影響針刺療效的4因素(穴位、捻針頻率、捻針角度、捻針時(shí)間)與3水平安排試驗(yàn)，通過(guò)采用計(jì)算機(jī)控制針刺手法儀對(duì)皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠進(jìn)行針刺療效影響因素定性定量化實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)闡述如下。

1 材料

1.1 動(dòng)物

52只清潔級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～240 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供(合格證號(hào)SCXK(湘)2011-0003)，標(biāo)準(zhǔn)配方桿狀飼料喂養(yǎng)，自由放水。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》［8］進(jìn)行定穴并剪去穴位處毛發(fā)。

1.2 試劑與儀器

氫化可的松注射液(5 ml/25 mg)，天津金耀氨基酸有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字 H12020886); Trizol，invitrogen公司;T、LH酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，上海博谷生物科技有限公司;RNaseⅠ，F(xiàn)ermentas公司;SYBR Green PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Thermo公司。華佗牌一次性針灸針(30號(hào)0.5寸)，蘇州醫(yī)療器械廠;移液器，吉爾森P型移液器(Pipetman);酶標(biāo)儀，芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司;低溫冷凍離心機(jī)，Sigma(3K15)公司;針刺手法儀(申請(qǐng)(專利)號(hào) CN200510027586.1，公開(kāi)(公告)號(hào)CN1709215)，上海中醫(yī)藥大學(xué)研制;Real-time檢測(cè)儀，ABI(ABI-7300)公司。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素設(shè)計(jì)

表1顯示，因素A(針刺穴位選擇):根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，選擇腎俞穴治療腎陽(yáng)虛證大鼠;選擇前三里作為對(duì)照穴位之一;非穴區(qū)擬選擇前三里旁開(kāi)5 mm處非穴點(diǎn)作為對(duì)照穴位之一。

表1 實(shí)驗(yàn)干預(yù)因素具體設(shè)計(jì)方案

表2顯示，影響針刺療效的因素有針刺穴位、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)在皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠模型的基礎(chǔ)上對(duì)上述4因素3水平采用正交表安排試驗(yàn)。查統(tǒng)計(jì)表選擇L9(34)正交設(shè)計(jì)表安排實(shí)驗(yàn)。

2.2 造模、分組和治療方法

2.2.1 分組和造模 52只SD雄性大鼠飼養(yǎng)3 d后按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，正常對(duì)照組8例，實(shí)驗(yàn)造模組44只。造模方法:每只大鼠按0.03 mg/ (g·bw)劑量肌注氫化可的松，每日1次，連續(xù)肌注10 d。腎陽(yáng)虛大鼠造模成功后，隨機(jī)分成10組，其中9組為針刺實(shí)驗(yàn)組4例，最后1組為模型組8例。

2.2.2 治療方法 治療組大鼠用自制固定器捆綁固定，0.5寸30號(hào)毫針刺入穴位5～7 mm，進(jìn)針后稍提插捻轉(zhuǎn)再與針刺手法儀連接，按相應(yīng)干預(yù)因素進(jìn)行針刺手法操作，留針10 min，再手法操作1次，再留針10 min后出針，共治療14 d。正常組與模型組大鼠用相同方式固定20 min，不進(jìn)行針刺操作。

表2 針刺實(shí)驗(yàn)組9個(gè)亞組實(shí)驗(yàn)安排

2.3 指標(biāo)檢測(cè)及方法

2.3.1 標(biāo)本采集 治療結(jié)束第2天處死大鼠。抽取動(dòng)脈血離心取上清液分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩囝^、咬骨鉗去顱骨分離垂體和下丘腦組織，液氮中速凍，－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 血清T(睪酮)、垂體LH(促黃體生成素)檢測(cè) 采用ELISA方法測(cè)量其濃度，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.3.3 下丘腦GnRH(促性腺激素釋放激素) mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR方法檢測(cè)，組織總RNA的抽提按Trizol說(shuō)明書(shū)操作?？俁NA中DNA的消除、反轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR擴(kuò)增、相對(duì)mRNA表達(dá)水平的計(jì)算等操作及方法參考文獻(xiàn)［8］，引物的合成與純化均由上海捷瑞生物科技有限公司提供。GnRH上游引物序列:5'-CGCTGTTGTTCTGTTGAC T-3'，下游引物序列:5'-CTCCTCCTTGCCCATCTC-3'。GAPDH上游引物序列:5'-GCAAGTTCAACG GCACAG-3'，下游引物序列:5'-GCCAGTAGACTCCA CGACAT-3'。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

造模大鼠體質(zhì)量減輕，毛發(fā)失去光澤，弓背、扎堆、反應(yīng)遲鈍，活動(dòng)減少，陰囊皺縮，尿量明顯增多;經(jīng)針刺治療后大鼠食欲增加，體質(zhì)量加重，活動(dòng)增加，毛發(fā)漸有光澤，而模型組大鼠整體情況不佳。

3.2 血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達(dá)

3.2.1 模型組分別與針刺實(shí)驗(yàn)組和正常對(duì)照組比較 表3顯示，血清 T、垂體 LH和下丘腦GnRH mRNA的表達(dá)方面，與正常組比較模型組各指標(biāo)表達(dá)均顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，針刺實(shí)驗(yàn)組大鼠血清 T水平表達(dá)明顯增加(P＜0.05)，垂體LH與下丘腦GnRH mRNA水平增加更具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 各組大鼠血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達(dá)(±s)

表3 各組大鼠血清T、垂體LH和下丘腦GnRH mRNA表達(dá)(±s)

注:與模型組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01

組 別 例數(shù) T(ng/ml) LH(IU/L)GnRH mRNA正常組8 6.62±0.64 10.92±0.81 13.55±1.84針刺實(shí)驗(yàn)組 36 5.34±0.951) 10.02±0.932) 8.22±4.212)模型組8 4.35±0.71 8.46±1.25 4.71±1.04

3.2.2 各針刺實(shí)驗(yàn)組組間比較 經(jīng)直觀分析，R值越大針刺治療效果越好。各針刺因素對(duì)血清T水平的影響從大到小依次為穴位選擇、捻針角度、捻針時(shí)間、捻針頻率，最佳組合是A3B3C3D2，即針刺腎俞穴，捻針角度90°，頻率60次/min，捻針60 s;各針刺因素對(duì)垂體組織中LH水平的影響從大到小依次為穴位選擇、捻針時(shí)間、捻針頻率、捻針角度，最佳組合是A2B3C1D1，即針刺前三里穴，捻針角度90°，頻率180次/min，捻針120 s;各針刺因素對(duì)下丘腦GnRH mRNA表達(dá)的影響從大到小依次為:穴位選擇、捻針頻率、捻針角度、捻針時(shí)間，最佳組合是A3B2C2D2，即針刺腎俞穴，捻針角度180°，頻率120次/min，捻針60 s(R值見(jiàn)表4)。結(jié)合表5各因素對(duì)血清T、垂體LH水平和下丘腦中GnRH mRNA表達(dá)影響的方差分析結(jié)果，即不同針刺因素影響針刺療效主次的權(quán)重和每一針刺因素不同水平優(yōu)劣的權(quán)重，各因素影響針刺療效從大到小依次是穴位選擇、捻針角度、捻針時(shí)間、捻針頻率，且最佳組合是A3B3C2D2，即針刺腎俞穴，捻針角度90°，頻率120次/min，捻針60 s。

表5顯示，以血清T、垂體LH的水平和下丘腦中GnRH mRNA的表達(dá)為觀察對(duì)象進(jìn)行上述4因素3水平間比較的方差分析結(jié)果顯示，穴位選擇對(duì)血清T含量、下丘腦中GnRH mRNA表達(dá)的影響都是主要因素(P＜0.01和P＜0.01)，對(duì)垂體LH含量的影響是重要因素(P＜0.05);捻針角度對(duì)血清T、垂體LH含量的影響都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，對(duì)下丘腦中GnRH mRNA表達(dá)的影響是重要因素(P＜0.05);捻針頻率對(duì)上述3個(gè)指標(biāo)的影響都屬于次要因素(P均＞0.05);捻針時(shí)間對(duì)血清T、垂體LH含量的影響都是次要因素(P＞0.05和P＞0.05)，對(duì)下丘腦中GnRH mRNA表達(dá)的影響是重要因素(P＜0.05)。根據(jù)不同因素主次的權(quán)重和每一因素不同水平優(yōu)劣的權(quán)重綜合分析(3個(gè)指標(biāo)結(jié)果不一致的，以其中的2個(gè)一致的結(jié)果決定)，穴位選擇是影響針刺療效的主要因素，而捻針角度、頻率、時(shí)間都是影響針刺療效的次要因素。

表4 4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及相關(guān)指標(biāo)極差分析

表5 以血清T、垂體LH水平和下丘腦中GnRH mRNA表達(dá)為觀察指標(biāo)的針刺多因素方差分析

4 討論

腎陽(yáng)虛證是中醫(yī)的常見(jiàn)證型。皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛證模型是實(shí)驗(yàn)研究中運(yùn)用最多且比較成功的動(dòng)物模型之一。該模型是根據(jù)臨床腎陽(yáng)虛患者腎上腺皮質(zhì)功能低下而設(shè)計(jì)的?；谡n題組前期研究［10］及按照陳英華等［12］提出評(píng)價(jià)腎陽(yáng)虛動(dòng)物模型從一般狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、客觀指標(biāo)、藥物反證幾個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)的科學(xué)設(shè)想，表3實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛證動(dòng)物模型通過(guò)氫化可的松肌肉注射的方法是成功的。

本實(shí)驗(yàn)分別以血清T(testosterone，T睪酮)、垂體LH(luteinizing hormone，LH促黃體生成素)的含量 和 下 丘 腦 中 GnRH(gonadotropin-releasing hormone，GnRH促性腺激素釋放激素)mRNA的表達(dá)作為觀察對(duì)象進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明穴位選擇是影響針刺療效的主要因素。對(duì)于腎陽(yáng)虛證來(lái)說(shuō)，選擇腎俞穴的治療效果要好于前三里和非穴區(qū)。筆者曾從背俞穴的意義、穴名釋義、古文獻(xiàn)、現(xiàn)代神經(jīng)解剖等方面做過(guò)分析［10］。黃成等［13］研究發(fā)現(xiàn)，艾灸或針剌老年大鼠“腎俞”能增加其垂體及血清LH、FSH(卵泡生成素)含量，因此認(rèn)為針灸可使老年大鼠低下的垂體內(nèi)分泌水平得到恢復(fù)。楊廉等［11］研究發(fā)現(xiàn)，溫針灸腎俞穴具有明顯調(diào)節(jié)性激素的作用，可以使老年雌性大鼠明顯低下的E2與孕酮含量升高。而前三里是手陽(yáng)明大腸經(jīng)的腧穴，與腎無(wú)直接的關(guān)系;從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)分析，前三里與腎陽(yáng)虛證的靶腺(腎上腺、甲狀腺、性腺)也沒(méi)有直接聯(lián)系，而所選擇的非穴區(qū)更無(wú)上述相關(guān)聯(lián)系。因此，通過(guò)上述分析與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，腧穴主治作用還是有相對(duì)特異性的。

本實(shí)驗(yàn)分別以血清T、垂體LH的含量和下丘腦中GnRH mRNA的表達(dá)為觀察對(duì)象進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明針刺捻針角度、捻針頻率和捻針時(shí)間是影響針刺療效的次要因素。捻針角度、捻針頻率和捻針時(shí)間是構(gòu)成針刺刺激量的主要要素之一，但針具的粗細(xì)也是構(gòu)成針刺刺激量的主要要素之一。至于針刺捻針角度、頻率、時(shí)間在本實(shí)驗(yàn)中處于次要因素的可能原因是，體質(zhì)量200 g大鼠的表面積是70kg人的1/56［10］，30號(hào)(直徑0.32mm)針灸針作用于大鼠，則相當(dāng)于一枚直徑為2.39mm的鋼釘作用于人體，刺激量相當(dāng)大。當(dāng)相當(dāng)于鋼釘一樣粗細(xì)的針刺入到大鼠體內(nèi)不需要捻針，刺激量在短時(shí)間內(nèi)可能超出取得療效的刺激量閾值的上限，當(dāng)再進(jìn)行捻針時(shí)，其捻針的角度、頻率、時(shí)間所形成的針刺刺激量的累積，大鼠可能已經(jīng)感受不到了。

本次實(shí)驗(yàn)采用的針刺手法儀只能對(duì)針刺捻針的角度、頻率、時(shí)間進(jìn)行定量控制，筆者曾對(duì)該儀器的改進(jìn)做過(guò)設(shè)想［14］。但由于軟硬件等方面的限制，該針刺手法儀還不能模擬針刺補(bǔ)瀉手法，而針刺補(bǔ)瀉手法很可能與針刺取穴、捻針角度、捻針頻率、捻針時(shí)間存在交互作用。由于儀器的原因，針刺補(bǔ)瀉手法沒(méi)有作為獨(dú)立因素進(jìn)行研究，這是本實(shí)驗(yàn)的不足之處，但也是我們今后努力的方向。

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Experimental Study on the Effect of Acupuncture on Hpg Axis of Kidney Yang Deficiency Rats Based on Orthogonal Design

MIN Zhi-yun1，CHENG Li-hong2，MIN You-jiang2△，DING Li-li-qiang1，ZHANG Hui1，PEI Jia1
(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China; 2.Affiliated Hospital of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330006，China)

Objective:To explore primary＆secondary factors that influences acupuncture effectiveness and the best combination of acupuncture parameters，orthogonal design was adopted to study several acupuncture factors.The rats model of kidney-Yang deficiency made by hydrocortisone as the study objects.Methods:4 influential factors(i.e.selection of acupoints，twisting-rotating angle，twisting-rotating frequency and acupuncture time)plus 3 levels of each factor were arranged to L9(34)orthogonal table.Kidney-Yang deficiency rats were treated by computer controlled acupuncture manipulation device.Serum T and pituitary LH were evaluated by ELISA method and hypothalamic GnRH mRNA expression by real time fluorescent quantitation PCR to illustrate the primary＆secondary factors and the good＆bad of different levels in each factor that could affect the acupuncture effectiveness.Results:Among 4 factors mentioned above，the order for influential factors from major to small was acupoints selection，twisting-rotating angle，acupuncure time and twisting-rotating frequency，among which，selection of acupoints was the major factors，twisting-rotating angle，twistingrotating frequency and acupuncture time all were secondary factors and.Conclusion:The best acupuncture parameters for treating kidney-Yang deficiency rats was combination of A3B3C2D2:selecting Shenshu acupoint(B23)，90°of twistingrotating angle，120tpm of twisting-rotating frequency and 60s of acupuncture time;In this study，selection of acupoints became the biggest influential factor，the next was twisting-rotating angle，the secondary was acupuncture time，and the last one was twisting-rotating frequency.

Orthogonal design;kidney-Yang deficiency;T;LH;GnRH

R245.31

:B

:1006-3250(2016)08-1080-04

2016-02-13

江西省衛(wèi)計(jì)委中醫(yī)藥科研計(jì)劃項(xiàng)目(2014Z006)(重點(diǎn)課題)-采用正交設(shè)計(jì)方法研究不同針刺因素對(duì)皮質(zhì)酮腎陽(yáng)虛大鼠下丘腦-垂體-性腺軸影響的機(jī)制

閔志云(1989-)，男，江西南昌人，在讀碩士，從事針灸的臨床與研究。

△通訊作者:閔友江(1975-)，男，江西安義人，副教授，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病的針灸治療與研究，Tel:13177788362，E-mail:myj2002@126.com。