紅花黃色素對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

黃玲玲，傅 纓△，資曉飛，李 媛，熊耀斌，曾志濤

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南昌 330006;2.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，南昌 330006; 3.臺(tái)州市中醫(yī)院，浙江臺(tái)州 318000)

紅花黃色素對(duì)人肝癌細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響*

黃玲玲1，傅 纓1△，資曉飛1，李 媛1，熊耀斌2，曾志濤3

(1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院中醫(yī)科，南昌 330006;2.江西省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，南昌 330006; 3.臺(tái)州市中醫(yī)院，浙江臺(tái)州 318000)

目的:探討紅花黃色素(safflor yellow，SY)對(duì)MHCC-97H細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法:選用MHCC-97H細(xì)胞體外培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，加入不同濃度SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L)進(jìn)行體外培養(yǎng)，并設(shè)順鉑陽(yáng)性對(duì)照組(終濃度0.5 μg/ml)，分別干預(yù)24 h、48 h及72 h后，采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法觀察SY對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用，流式細(xì)胞儀觀察細(xì)胞周期及凋亡率的變化，Western–blotting檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:MTT顯示SY對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-97H增殖有一定的抑制作用，與SY濃度及作用時(shí)間有相關(guān)性;流式細(xì)胞術(shù)顯示，細(xì)胞凋亡率隨SY濃度增加有上升趨勢(shì)，細(xì)胞周期無(wú)明顯變化; Western-blotting顯示，隨著SY濃度的增加，Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，而Bcl-2/bax比值下降。結(jié)論:SY對(duì)MHCC-97H細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的抑制作用，但對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯阻滯作用，其可誘導(dǎo)該細(xì)胞凋亡，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，可能為其促凋亡機(jī)制之一。

紅花黃色素;MHCC-97H細(xì)胞;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞周期;Bax;Bcl-2

紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥筒狀花冠，味辛、性溫，入心、肝經(jīng)，有活血通經(jīng)、祛瘀止痛功效?！吨兴幩幚韺W(xué)》明確指出，紅花具有抗腫瘤作用［1］。紅花成分多而雜，大量研究顯示紅花黃色素(safflor yellow，SY)是紅花發(fā)揮藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)SY在抗心腦缺血損傷、肺損傷及抗炎等方面研究較多［2-6］，而對(duì)肝癌的研究相對(duì)較少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究SY對(duì)人肝癌MHCC-97H細(xì)胞周期、凋亡和相關(guān)凋亡蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響，以期為相關(guān)的理論研究及SY應(yīng)用于臨床抗腫瘤提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人肝癌細(xì)胞株MHCC-97H購(gòu)自上海復(fù)蒙生物有限公司。

1.2 藥品及試劑

注射用紅花黃色素(粉劑，浙江永寧藥業(yè)股份有限公司)50 mg(其中含羥基紅花黃色素 42.5 mg)，臨用時(shí)加10 ml完全培養(yǎng)基倍比稀釋至最終濃度為0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L 5個(gè)濃度含藥培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆?順鉑注射液(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)6 ml/30 mg;胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO) (上海索萊寶生物科技有限公司);10%胎牛血清(美國(guó)HyClone公司);Annexin V/PI細(xì)胞凋亡雙染試劑盒(上海貝博生物);細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司);十二烷基苯磺酸鈉(SDS)、甘氨酸(Glyeine)、三羥甲基氨基甲烷(TRIS)(美國(guó)Amresco公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、Bax抗體、Bcl-2抗體、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、顯影液及定影液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.3 儀器

流式細(xì)胞儀(美國(guó) BD公司)，酶標(biāo)儀、二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，蛋白印跡檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Bio-RAD公司)，水浴箱(上海智斌金屬制品有限公司)，血球計(jì)數(shù)儀(上海求精生化儀器廠)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將凍存的MHCC-97H細(xì)胞復(fù)蘇，臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定細(xì)胞活力后常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代3次，細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 MTT法測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC-97H細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml;充分吹打后接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)約12 h待細(xì)胞貼壁完全。實(shí)驗(yàn)組加入不同濃度的SY，其終濃度分別為0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)每個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)組平行設(shè)不加細(xì)胞，只加培養(yǎng)液和同一濃度藥物的空白對(duì)照孔。同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照孔(順鉑注射液終濃度0.5 μg/ml［7］)和空白調(diào)零孔。各孔上清液終體積均為200 μL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后棄原培養(yǎng)基，加入DMEM培養(yǎng)基，每孔避光加入MTT(5 mg/ ml)溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄上清，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，待紫色結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔490 nm波長(zhǎng)處吸光值(OD)。按下列公式計(jì)算:細(xì)胞增殖抑制率(inhibition rate，IR)=(1－實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC-97H細(xì)胞以5×104個(gè)/ ml接種于6ml培養(yǎng)皿中，次日棄上清液，加入含不同濃度 SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L)的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(順鉑注射液終濃度0.5 μg/ml)，各孔細(xì)胞上清液終體積5 ml。繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后以不含EDTA消化酶消化，1000 r/ min離心5 min，用PBS洗2次，加入預(yù)冷的70%乙醇使細(xì)胞懸浮固定，置4℃固定12 h，室溫水化、離心、PBS洗滌后，室溫碘化丙啶(PI)避光染色15 min，以300目篩網(wǎng)過(guò)濾，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml，上流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)。

2.4 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC-97H細(xì)胞，以2.5×104個(gè)/ml接種于6孔板中，次日棄上清液，加入含不同濃度SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/ L)的培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(同2.3)，各孔細(xì)胞上清液終體積2.5 ml。繼續(xù)培養(yǎng)24 h及48 h后消化離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度約1 ×106個(gè)/ml，加入10 μL Annexin V-FITC及5 μL PI，避光室溫反應(yīng)15 min，F(xiàn)CM檢測(cè)。

2.5 Western-blotting

檢測(cè)Bax、Bcl-2表達(dá):取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MHCC-97H細(xì)胞，含不同濃度 SY(0、0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/L)的培養(yǎng)液干預(yù)48 h后，用PBS洗3次提取總蛋白，BCA定量試劑盒測(cè)定各組蛋白質(zhì)含量。各組取等量蛋白上樣，用10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳膠(10%SDS-PAGE)進(jìn)行凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST(0.1%Tween-20，10 mmol/L TrisHCL Ph 7.5，150 mmol/L NaCl)4℃封閉1 h，一抗(1∶1500) 4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次。再與相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶7000)結(jié)合，室溫雜交1 h，TBST洗膜3次，過(guò)氧化物酶法顯色，凝膠纖維攝像系統(tǒng)處理，Quantity One圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析，以β-actin的灰度值為對(duì)照，計(jì)算各組蛋白Bax、Bcl-2相對(duì)表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 SY干預(yù)48 h后MHCC-97H細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖1顯示，在倒置顯微鏡下觀察空白對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈多邊形，胞漿豐富，生長(zhǎng)旺盛，相鄰細(xì)胞生長(zhǎng)融合成片。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞加入SY后，隨著濃度的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)開始變得雜亂，折光性增強(qiáng)，脫壁細(xì)胞增多漂浮在培養(yǎng)基中。

3.2 SY不同作用時(shí)間下MHCC-97H細(xì)胞增殖抑制的變化

表1顯示，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同濃度SY分別干預(yù)MHCC-97H細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，對(duì)MHCC-97H細(xì)胞增殖有一定抑制作用。隨著SY濃度增加及作用時(shí)間延長(zhǎng)，抑制作用逐漸增強(qiáng);與0 mg/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);各時(shí)間點(diǎn)均以0.5 mg/L濃度抑制率最高，分別為29.7%、36.5%和40.5%，具有一定劑量和時(shí)間依賴性。

表1 不同濃度SY不同作用時(shí)間下對(duì)MHCC-97H細(xì)胞增殖抑制變化(±s)

表1 不同濃度SY不同作用時(shí)間下對(duì)MHCC-97H細(xì)胞增殖抑制變化(±s)

注:與0 mg/L比較:＊＊P＜0.01

組別 例數(shù)24 h 48 h 72 h OD值 IR(%) OD值 IR(%) OD值 IR(%) 0 mg/L 5 0.745±0.085 — 0.870±0.073 — 1.142±0.063—0.03125 mg/L 5 0.681±0.072＊＊ 8.6 0.717±0.062＊＊ 17.6 0.914±0.072＊＊ 20.0 0.0625 mg/L 5 0.633±0.066＊＊ 15.0 0.673±0.054＊＊ 22.6 0.856±0.064＊＊ 25.0 0.125 mg/L 5 0.595±0.071＊＊ 20.2 0.632±0.083＊＊ 27.4 0.785±0.091＊＊ 31.3 0.25 mg/L 5 0.557±0.083＊＊ 25.2 0.581±0.075＊＊ 33.2 0.737±0.087＊＊ 35.5 0.5 mg/L 5 0.524±0.094＊＊ 29.7 0.552±0.062＊＊ 36.5 0.680±0.092＊＊ 40.5順鉑對(duì)照組 5 0.505±0.078＊＊ 32.2 0.515±0.081＊＊ 40.8 0.627±0.075＊＊45.1

表2 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞周期變化(±s)

表2 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞周期變化(±s)

注:與0 mg/L比較:＊＊P＜0.01

組別 例數(shù)G1 S G2 G2/G1 0 mg/L 3 74.40±1.49 13.12±1.23 12.54±1.37 1.9 1.903±0.019 23±0.017 0.03125 mg/L 3 73.12±1.05 12.91±1.40 13.94±1.17 1.878±0.020 0.0625 mg/L 3 71.94±1.25 13.86±1.14 14.28±1.20 1.871±0.015 0.125 mg/L 3 74.92±1.31 11.98±1.01 13.12±1.28 1.899±0.018 0.25 mg/L 3 73.27±1.41 12.63±1.26 13.57±1.34 1.890±0.017 0.5 mg/L 3 71.33±1.27 14.40±1.15 14.35±1.24 1.917±0.015順鉑對(duì)照組 3 62.67±1.30＊＊ 11.68±1.42 25.72±1.34＊＊

圖1 不同濃度SY干預(yù)48 h后MHCC-97H細(xì)胞形態(tài)變化(×200)

3.3 SY對(duì)MHCC-97H細(xì)胞周期的影響

表2顯示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度SY干預(yù)MHCC-97H細(xì)胞48 h，對(duì)細(xì)胞周期G1、S及G2期的阻滯無(wú)明顯差異，與0 mg/L比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);順鉑對(duì)照組G1期細(xì)胞比例減少，G2/M期細(xì)胞比例增加，與0 mg/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

3.4 SY對(duì)MHCC-97H細(xì)胞凋亡率的影響

表3顯示，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，不同濃度SY干預(yù)48 h，MHCC-97H細(xì)胞的早期及中晚期凋亡率均有一定變化，以早期凋亡率變化為主，與0 mg/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);0.03125 mg/L～0.5 mg/L總凋亡率分別為 19.62%、22.29%、26.71%、28.51%、34.58%，有一定的濃度相關(guān)性;凋亡率變化 0.5mg/L濃度明顯(34.58%)，與順鉑對(duì)照組(46.05%)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？偟蛲雎?%)=早期細(xì)胞凋亡率(%)+中晚期細(xì)胞凋亡率(%)。

3.5 SY對(duì)MHCC-97H細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響

表4圖2顯示，Western-blotting檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SY(0.0625 mg/L～0.5 mg/L)作用MHCC-97H細(xì)胞48 h，Bax表達(dá)逐漸增加，Bcl-2表達(dá)逐漸減少，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，具有一定的濃度依賴性，與0 mg/L比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

表3 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞凋亡率變化(±s)

表3 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞凋亡率變化(±s)

注:與0 mg/L比較:*P＜0.05，與順鉑對(duì)照組比較:#P＜0.05

組 別 例數(shù) 早期凋亡率(%)中晚期凋亡率(%)總凋亡率(%) 0 mg/L 5 8.32±0.63 1.65±0.58 9.97±0.79 0.03125 mg/L 5 15.43±0.75* 4.19±0.63* 19.62±0.80*0.0625 mg/L 5 18.06±0.81* 4.23±0.73* 22.29±0.92*0.125 mg/L 5 20.63±0.57* 6.08±0.38* 26.71±0.53*0.25 mg/L 5 21.93±0.54* 6.58±0.46* 28.51±0.60*0.5 mg/L 5 26.32±0.91*，#8.26±0.64*，# 34.58±1.26*，#順鉑對(duì)照組 5 36.02±1.63* 10.03±2.01* 46.05±2.24*

表4 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)(±s)

表4 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)(±s)

注:與0 mg/L比較:＊＊P＜0.01

組 別 例數(shù) Bax Bcl-2 Bcl-2/Bax比值0 mg/L 3 1.000±0.000 1.000±0.000 1.000±0.000 0.0625 mg/L 3 2.859±0.039＊＊0.885±0.065＊＊ 0.309±0.003＊＊0.125 mg/L 3 2.933±0.031＊＊0.791±0.047＊＊ 0.269±0.002＊＊0.25 mg/L 3 4.624±0.046＊＊0.627±0.026＊＊ 0.136±0.002＊＊0.5 mg/L 3 5.263±0.036＊＊0.414±0.041＊＊ 0.079±0.001＊＊

圖2 不同濃度SY作用48 h后MHCC-97H細(xì)胞內(nèi)Bax及Bcl-2蛋白表達(dá)(β-actin為內(nèi)參照)

4 討論

紅花是中醫(yī)活血化瘀抗腫瘤方中的代表藥，主要含查爾酮類色素、黃酮類、多糖類等多種活性成分，其抗腫瘤有效活性成分研究較多的是SY、羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow HSYA)及紅花多糖［8］。Xi SY等［9］通過(guò)建立人胃腺癌BGC-823移植瘤裸鼠模型發(fā)現(xiàn)，HSYA對(duì)裸鼠皮下移植瘤內(nèi)微血管生長(zhǎng)有抑制作用，可能與其多靶點(diǎn)綜合調(diào)節(jié)復(fù)雜的腫瘤細(xì)胞微環(huán)境相關(guān)。尹華偉［10］研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的SY對(duì)小鼠H22皮下移植瘤具有明顯的抑制作用，對(duì)機(jī)體損傷較環(huán)磷酰胺小。近年來(lái)不少研究表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與腫瘤凋亡關(guān)系密切，不少抗腫瘤藥物作用的強(qiáng)弱與其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)。大量的研究發(fā)現(xiàn)，大部分的抗腫瘤藥物直接參與細(xì)胞周期調(diào)控蛋白表達(dá)的調(diào)控，檢測(cè)細(xì)胞周期變化也成為中藥抗腫瘤作用機(jī)制研究中的常用指標(biāo)，但并不是實(shí)驗(yàn)的抗癌藥物都會(huì)對(duì)腫瘤的周期產(chǎn)生明顯的影響或是阻滯作用。王麗芳［11］等研究發(fā)現(xiàn)，黃連素可顯著抑制人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡，且對(duì)細(xì)胞周期無(wú)明顯影響。Bcl-2基因可抑制細(xì)胞凋亡，而Bax基因是Bcl-2同源基因，能促進(jìn)細(xì)胞凋亡;Bcl-2/Bax比值常被稱之為“死亡開關(guān)”，其值高低與細(xì)胞凋亡進(jìn)展相關(guān)［12］。連梓敏［13］等研究發(fā)現(xiàn)，Wistar大鼠肝癌細(xì)胞中Bcl-2/Bax表達(dá)比例降低，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的凋亡進(jìn)而抑制肝癌細(xì)胞的增殖能力。朱開梅［14］等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，莽草酸通過(guò)降低Bcl-2/Bax比例可誘導(dǎo)肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)，SY可抑制MHCC-97H細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，且隨SY濃度的增加及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用逐漸增強(qiáng)，并呈一定劑量和時(shí)間依賴性;以0.5 mg/L作用72 h較明顯，與順鉑組比較，抑制細(xì)胞增殖作用不及順鉑;SY在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面，以早期凋亡細(xì)胞變化為主，具有一定的濃度相關(guān)性;0.5 mg/L作用下的細(xì)胞總凋亡率不及順鉑組，可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制與順鉑存在差異有關(guān)。SY對(duì)細(xì)胞周期阻滯無(wú)明顯差異，有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道有些藥物屬于細(xì)胞周期非特異性藥物，它們引起細(xì)胞凋亡時(shí)不產(chǎn)生周期阻滯，其具體作用機(jī)制尚不明確。SY是否有可能屬于這類藥物及延長(zhǎng)作用時(shí)間是否對(duì)細(xì)胞周期產(chǎn)生影響尚有待進(jìn)一步探討。隨著SY濃度的增加，Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少，Bcl-2/Bax比值呈一定下降趨勢(shì)，提示通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax比值可能為其促凋亡的機(jī)制之一。同時(shí)比較 Bcl-2/bax比值發(fā)現(xiàn)，在 0.0625 mg/L及0.125 mg/L作用下差異均不明顯，提示SY作用于腫瘤細(xì)胞可能存在一個(gè)效量相關(guān)的作用濃度。

綜上所述，SY可抑制人肝癌MHCC-97H細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，均以0.5 mg/L作用較明顯，且呈一定的量-效、時(shí)-效關(guān)系，通過(guò)下調(diào)Bcl-2/Bax比值可能為其促凋亡機(jī)制之一。目前關(guān)于SY對(duì)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞作用的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多，有文獻(xiàn)報(bào)道HSYA能抑制正常及腫瘤條件培養(yǎng)液刺激下內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，且與濃度成反比［15］。本研究未發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，其對(duì)不同的腫瘤細(xì)胞是否存在特異性作用需更多方面的研究證實(shí)。下一步可通過(guò)建立動(dòng)物模型驗(yàn)證SY誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的凋亡作用，并確定其最佳作用濃度及時(shí)間，進(jìn)一步明確SY抗腫瘤的具體作用機(jī)制，為SY作為臨床抗腫瘤輔助用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effect of Safflower Yellow on Apoptosis and Expression of Related Proteins in Human Hepatocellular Carcinoma Cells

HUANG Ling-ling1，F(xiàn)U Ying1△，ZI Xiao-fei1，LI Yuan1，XIONG Yao-bin2，ZENG Zhi-tao3
(1.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China;2.Jiangxi Academy of Medical Sciences，Nanchang 330006，China;3.Taizhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Taizhou 318000，China)

Objective:To investigate the effect of safflower yellow(SY)on apoptosis and related protein expression in MHCC-97H cells.Methods:MHCC-97H cells cultured in vitro in logrithmic growth phase wered selected.Then different concentrations(0，0.03125，0.0625，0.125，0.25，0.5 mg/L)of SY were added to cell culture medium in matched experimental groups，and positive control group to Cisplatin(at concentration of 0.5μg/ml).Respectively intervene of 24 h，48 h and 72 h，Inhibition on cell proliferation of experimental groups was evaluated by four methyl thiazolyl tetrazolium (MTT)method.The changes of cycle and apoptosis rate were detected with flow cytometry.Expression of Bax and Bcl-2 protein in all experimental groups was detected by Western blotting method.Results:MTT results show that，SY has a certain inhibitory effect on the proliferation of human hepatoma MHCC-97H cells，is correlated with SY concentration and action time.Flow cytometry analysis show that，the apoptosis rate decreased with increasing SY concentration has an upward trend，no significant changes in cell cycle.Western-blotting results show that，with the increase of SY concentration，the expression of Bax was increased，Bcl-2 expression decreased，and the decrease of the ratio of Bcl-2/ bax.Conclusion:A certain degree of inhibition of SY on the growth of MHCC-97H cells and induce its apoptosis，no obvious blocking effect on cell cycle，by decreasing the ratio of Bcl-2/Bax may be one of mechanisms of promoting apoptosis.

Safflower yellow;MHCC-97H cells;Apoptosis;Cell cycle;Bax;Bcl-2

R285.5

:B

:1006-3250(2016)08-1061-04

2016-02-18

江西省衛(wèi)生計(jì)生委科技計(jì)劃項(xiàng)目(20155224)-紅花黃色素對(duì)人肝癌細(xì)胞MHCC-97H細(xì)胞凋亡影響

黃玲玲(1987-)，女，江西都昌人，醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病的臨床與研究。

△通訊作者:傅 纓，女，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合消化系統(tǒng)疾病的臨床與研究，Tel: 13970975901，E-mail:yingfu_116@163.com。