藏藥二十五味驢血丸對(duì)痹癥(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)大鼠的治療作用及其機(jī)理探討

胡華剛，陶 黎，吳佳瑩，趙宏艷，肖 璇，李岳澤，劉梅潔，汪文來(lái)，徐斯凡，潘靜華，何 堅(jiān)，鞠大宏△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081;5.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福州 350108)

藏藥二十五味驢血丸對(duì)痹癥(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)大鼠的治療作用及其機(jī)理探討

胡華剛1，2，陶 黎2，吳佳瑩2，趙宏艷2，肖 璇3，李岳澤2，劉梅潔2，汪文來(lái)2，徐斯凡4，潘靜華2，何 堅(jiān)5△，鞠大宏1，2△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院博士后科研流動(dòng)站，北京 100700;2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700;3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193;4.中央民族大學(xué)中國(guó)少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081;5.福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福州 350108)

目的:探討藏藥二十五味驢血丸對(duì)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其機(jī)制。方法:選用雌性SD大鼠60只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組和造模組，再將造模成功的大鼠隨機(jī)分為CIA模型組、甲氨蝶呤組、二十五味驢血丸低、中、高劑量組，連續(xù)給藥4周。結(jié)果:與模型組比較，二十五味驢血丸使CIA大鼠的AI評(píng)分和腫脹肢體的腳掌厚度顯著降低，并可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量顯著降低，使TGF-β1含量顯著升高。結(jié)論:二十五味驢血丸對(duì)膠原誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎具有顯著的治療效果，其可能通過(guò)調(diào)控Th17/Treg細(xì)胞平衡從而達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用。

二十五味驢血丸;干黃水;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;Th17/Treg平衡

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征且逐漸導(dǎo)致軟骨及骨關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞和不可逆性殘疾的自身免疫性疾病，并伴有并發(fā)癥，極大地影響了患者的生命質(zhì)量［1］。

藏醫(yī)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有系統(tǒng)而深入的認(rèn)識(shí)，《四部醫(yī)典》就將該類疾病單列成章節(jié)加以詳細(xì)論述。二十五味驢血丸(，藏文名:珍才尼埃日布)是具有國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)的藏醫(yī)經(jīng)典方劑，始載于《四部醫(yī)典》，是藏醫(yī)用于治療RA的主要藥物［2］。雖然二十五味驢血丸具有顯著的臨床療效［3-5］，但目前尚未見(jiàn)到有關(guān)其作用機(jī)制方面的研究報(bào)道。本文以II型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA)大鼠作為RA模型，研究二十五味驢血丸對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療作用，并初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選用6周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(軍)2012-0004)，飼養(yǎng)于中央民族大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑與儀器 主要試劑:牛II型膠原(貨號(hào)20022，批號(hào)150394);不完全弗氏佐劑(貨號(hào)7002，批號(hào)150057);美國(guó) Chondrex公司產(chǎn)品;戊巴比妥鈉(批號(hào)P3761);Sigma公司;大鼠白細(xì)胞介素(IL)-17A ELISA試劑盒(貨號(hào)BMS635，批號(hào)118323013);美國(guó)affymetrix公司;大鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β1ELISA試劑盒(貨號(hào)CSB-E04727r，批號(hào)T02039922);武漢華美生物工程有限公司;二十五味驢血丸(批號(hào)1506114);青海省格拉丹東藥業(yè)有限公司;甲氨蝶呤(批號(hào)150701);通化茂祥制藥有限公司。主要儀器:粉碎機(jī)，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司;單反相機(jī)，日本佳能公司;200目鋼篩，上虞市建化儀器廠;數(shù)顯游標(biāo)卡尺，上海工具廠有限公司;Multiskan Mk3酶標(biāo)儀、Well wash 4 Mk2洗板機(jī)，美國(guó)Thermo公司;K15離心機(jī)，德國(guó)Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及處理［6］適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)選取8只作為空白對(duì)照組，其余的大鼠用尾根部皮下注射II型膠原與不完全弗氏佐劑混合物的方法誘導(dǎo)出類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠模型(CIA模型)，空白對(duì)照組不做任何處理。

第2次免疫7 d后，根據(jù)關(guān)節(jié)炎指數(shù)(arthritis index，AI)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度進(jìn)行0～4級(jí)別評(píng)分。將單個(gè)肢體AI評(píng)分大于2分的大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為CIA模型組、陽(yáng)性藥組、二十五味驢血丸低、中、高劑量組各8只。

將二十五味驢血丸粉碎后過(guò)200目篩，制成混懸液。按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》第四版中的換算公式，將人的劑量換算成大鼠的劑量。二十五味驢血丸低、中、高劑量分別是150、300、600 mg/kg，每天灌胃1次，連續(xù)4周。陽(yáng)性藥為甲氨蝶呤(3 mg/(kg ·week))，空白對(duì)照組和模型組給等體積雙蒸水。

1.2.2 取材 給藥4周后戊巴比妥鈉麻醉，腹主動(dòng)脈取血，2500 r/min離心，20 min后取血清，分裝后－80℃保存。

1.2.3 指標(biāo)的檢測(cè) ①給藥后每隔3 d進(jìn)行AI評(píng)分［7］。0分:正常;1分:1個(gè)或多個(gè)趾關(guān)節(jié)紅或紅腫;2分:踝關(guān)節(jié)以下中度紅腫;3分:包括膝關(guān)節(jié)在內(nèi)的嚴(yán)重紅腫;4分:包括膝關(guān)節(jié)在內(nèi)的完全紅腫，關(guān)節(jié)變形、殘廢;②給藥后每隔6 d用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測(cè)量各組大鼠腫脹肢體腳掌厚度的同時(shí)測(cè)量大鼠體質(zhì)量;③按試劑盒說(shuō)明測(cè)定血清 IL-17A和TGF-β1含量。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，若數(shù)據(jù)為正態(tài)分布時(shí)釆用單因素方差分析，方差齊性時(shí)組間兩兩比較，采用LSD檢驗(yàn);若方差不齊則用其項(xiàng)下Tamhane’s T2(M)進(jìn)行檢測(cè);若數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布時(shí)，采用非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis單因素ANOVA(k樣本)(W)，組間兩兩比較采用Stepwise step-down檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠AI評(píng)分影響

表1圖1顯示，與CIA模型組比較，給藥第4天，二十五味驢血丸高劑量組大鼠的AI評(píng)分顯著降低(P＜0.05);給藥8 d后，二十五味驢血丸使類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的AI評(píng)分顯著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤組和二十五味驢血丸給藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠AI評(píng)分的影響(±s)

表1 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠AI評(píng)分的影響(±s)

注:與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組 別 鼠數(shù) 給藥前 給藥4 d 給藥8 d 給藥12 d 給藥16 d 給藥20 d 給藥24 d 給藥28 d空白對(duì)照組80 0 0 0 0 0 0 0模 型 組 8 3.67±0.35 3.61±0.24 3.54±0.39 3.40±0.39 3.30±0.26 3.25±0.35 3.08±0.49 3.00±0.33甲氨蝶呤組 8 3.64±0.38 3.14±0.38 2.69±0.37＊＊2.38±0.23＊＊2.25±0.27＊＊2.21±0.39＊＊2.05±0.28＊＊2.00±0.32＊＊低劑 量 組 8 3.65±0.34 3.45±0.37 3.00±0.27＊＊2.59±0.20＊＊2.50±0.27＊＊2.44±0.32＊＊2.33±0.25＊＊2.21±0.27＊＊中劑 量 組 8 3.63±0.35 3.32±0.41 2.83±0.35＊＊2.50±0.33＊＊2.39±0.33＊＊2.33±0.35＊＊2.14±0.24＊＊2.11±0.22＊＊高劑 量 組 8 3.69±0.26 3.07±0.19* 2.81±0.26＊＊2.42±0.20＊＊2.33±0.26＊＊2.25±0.27＊＊2.11±0.29＊＊2.04±0.27＊＊

2.2 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響

表2顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腫脹肢體的腳掌厚度顯著增加(P＜0.01)。給藥2周后與模型組比較，二十五味驢血丸可使CIA大鼠腫脹肢體的腳掌厚度顯著降低(P＜0.01)，甲氨蝶呤組和二十五味驢血丸給藥組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給藥3周后，二十五味驢血丸低、中、高劑量組大鼠腫脹肢體的腳掌厚度與空白對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠體質(zhì)量的影響

表3顯示，與空白對(duì)照組比較，CIA大鼠的體質(zhì)量均顯著降低。給藥4周后，甲氨蝶呤組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組大鼠(P＜0.05)，二十五味驢血丸的中、高劑量組大鼠體質(zhì)量顯著高于模型組(P＜0.01)，二十五味驢血丸給藥組和陽(yáng)性藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響(±s)

表2 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠腫脹肢體腳掌厚度的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 鼠數(shù) 給藥前 給藥1周 給藥2周 給藥3周 給藥4周空 白 對(duì) 照 組 8 6.09±0.86 6.53±0.59 6.64±0.43 6.79±0.48 6.86±0.54模 型 組 8 8.49±1.10## 9.31±1.40## 9.23±0.86## 8.89±1.12## 8.41±0.71##甲 氨 蝶 呤 組 8 8.41±1.06## 8.56±1.01## 7.50±0.53#＊＊ 7.32±0.79＊＊ 7.11±0.36＊＊低 劑 量 組 8 8.32±0.68## 9.06±1.09## 8.19±0.52##＊＊ 7.39±0.42＊＊ 7.20±0.42＊＊中 劑 量 組 8 8.57±0.72## 8.67±0.49## 7.80±0.34##＊＊ 7.28±0.40＊＊ 7.12±0.77＊＊高 劑 量 組 8 8.32±0.66## 8.58±1.07## 7.66±0.64##＊＊ 7.21±0.64＊＊ 7.07±0.53＊＊

表3 二十五味驢血丸對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(±s)

表3 二十五味驢血丸對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù) 給藥前 給藥1周 給藥2周 給藥3周 給藥4周空 白 對(duì) 照 組 8 335.82±12.87 374.81±20.13 425.33±18.48 447.10±15.37 462.55±21.17模 型 組 8 283.21±14.48## 307.74±14.64## 331.06±13.31## 363.89±14.01## 363.82± 9.58##甲 氨 蝶 呤 組 8 283.88±29.18## 311.01±39.74## 353.26±25.20## 377.99±16.00## 387.78±12.51##*低 劑 量 組 8 284.81±25.28## 306.09±31.66## 349.54±23.87## 375.47±22.55## 383.48±18.17##中 劑 量 組 8 283.18±19.62## 310.24±17.96## 355.16±14.30## 380.46±10.43## 394.31± 8.84##＊＊高 劑 量 組 8 283.88±23.50## 313.02±22.22## 360.85±19.83## 381.38±18.51## 401.32±15.49##＊＊

圖1 末次給藥前各組大鼠AI評(píng)分觀察

2.4 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響

表4顯示，與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-17A水平顯著升高，TGF-β1水平顯著降低(P＜0.01)。與模型組比較，二十五味驢血丸可使CIA大鼠血清中IL-17A含量顯著降低的同時(shí)，血清中TGF-β1的含量顯著升高(P＜0.05)。

表4 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響(±s)

表4 二十五味驢血丸對(duì)CIA大鼠血清中IL-17A和TGF-β1水平的影響(±s)

注:與空白對(duì)照組比較:#P＜0.05，##P＜0.01;與模型組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 例數(shù) IL-17A的含量(pg/ml) TGF-β1的含量(ng/ml)空白對(duì)照組8 0.52±0.04 34.15±2.88模 型 組 8 1.09±0.11## 27.96±3.69##甲氨蝶呤組 8 0.58±0.11＊＊ 35.91±3.99*低 劑 量 組 8 0.65±0.09* 37.11±3.34*中 劑 量 組 8 0.58±0.09＊＊ 37.45±3.65＊＊高 劑 量 組 8 0.52±0.07＊＊ 37.52±3.41＊＊

3 討論

RA屬于藏醫(yī)“真布”病，是藏醫(yī)臨床常見(jiàn)?。?］。藏醫(yī)認(rèn)為［8-10］，若人久居或勞作于寒濕之地，長(zhǎng)期過(guò)量進(jìn)食油脂之物，或精神壓抑或生活不規(guī)律等因素，導(dǎo)致人體三大因素(龍、赤巴、培根)失衡，進(jìn)而使精華不化、清濁不分，飲食精微未在本位成熟而變成“黃水”，致使“黃水”激增。“黃水”擴(kuò)散至骨關(guān)節(jié)、肌肉和筋絡(luò)后腐蝕關(guān)節(jié)、肌肉、骨骼和筋脈，從而導(dǎo)致RA的發(fā)生。藏醫(yī)對(duì)RA的治療以“干黃水”為主，同時(shí)調(diào)節(jié)“三大因素”的平衡［8］?！案珊渣S水”是藏醫(yī)治療RA的方法論，而二十五味驢血丸是藏醫(yī)“干黃水”用于治療RA的主要藥物。CIA大鼠模型是經(jīng)典的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)藥物抗炎和免疫抑制作用的動(dòng)物模型［11］。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，二十五味驢血丸不但對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠具有顯著的治療作用，還能增加CIA大鼠的飲食，這與藏醫(yī)臨床研究的結(jié)果相符。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，Th17/Treg細(xì)胞失衡在RA的發(fā)病機(jī)制中扮演著非常重要的角色［12-14］。Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一類新型CD4+T細(xì)胞亞群，能特異性高水平地分泌白細(xì)胞介素-17A(interleukin-17A，IL-17A)。IL-17A可刺激滑膜細(xì)胞表達(dá)IL-6/ IL-8，這些因子能募集中性粒細(xì)胞、未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞、T細(xì)胞在關(guān)節(jié)滑液中聚集，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)［15-16］，還可刺激滑膜細(xì)胞分泌多種血管因子促進(jìn)血管翳的形成［17］。IL-17A作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞，使其大量表達(dá)核因子κB受體活化因子配體(RANKL )，RANKL與破骨細(xì)胞的前體細(xì)胞和破骨細(xì)胞表面受體結(jié)合，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟，加快骨吸收［18］。Treg細(xì)胞是具有免疫抑制作用、維持免疫耐受自然發(fā)生的專職免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能控制免疫應(yīng)答強(qiáng)度，減輕對(duì)機(jī)體組織損傷［19］。Treg細(xì)胞分泌的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)在誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為成熟Treg細(xì)胞的同時(shí)，還能抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖和分化，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其免疫調(diào)節(jié)作用［20］。

CIA大鼠體內(nèi)存在Th17/Treg細(xì)胞分化失衡，Th17細(xì)胞數(shù)量顯著大于Treg細(xì)胞的數(shù)量［21］。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，二十五味驢血丸和甲氨蝶呤皆可使CIA大鼠血清中IL-17A的含量顯著降低，TGF-β1的含量顯著升高。孫夢(mèng)怡等［22］研究發(fā)現(xiàn)，甲氨蝶呤可以有效降低小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率及平均關(guān)節(jié)炎指數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，甲氨蝶呤組Th17細(xì)胞比例顯著降低，Treg細(xì)胞比例顯著增加。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與此具有一致性，表明二十五味驢血丸可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th17/Treg細(xì)胞的平衡從而達(dá)到治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用，但二十五味驢血丸治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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Discussion of Treating Effects and Its Mechanism of Tibetan Medicine Twenty-five Flavor Lvxue Pills to Bi Syndrome(Rheumatoid Arthritis)

HU Hua-gang1，2，TAO Li2，WU Jia-ying2，ZHAO Hong-yan2，XIAO Xuan3，LI Yue-ze2，LIU Mei-jie2，WANG Wen-lai2，XU Si-fan4，PAN Jing-hua2，HE Jian5△，JU Da-hong1，2△
(1.Postdoctoral Research Station，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;2.Institute of Basic Theory for Chinese medicine，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China;3.The Institute of Medicinal Plant Development，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 10193，China; 4.Institute of Chinese Minority Traditional Medicine，Minzu University of China，Beijing 100081，China;5.Fuzhou of Fujian University of Traditional Chinese Medicine and Rehabilitation Medicine，350108，China)

Objective:To explore the therapeutic effect and mechanism of tibetan compound prescription of Ershiwuwei lvxue pills on Collagen-Induced Arthritis(CIA)rats.Method:Eight rats were randomly selected as blank control group from sixty SD female rats which were six weeks old，and other rats as Rheumatoid arthritis model group.The successful model rats were randomly devided into CIA group，positive drug(MTX)group，low dose ershiwuwei lvxue pills group，medium dose ershiwuwei lvxue pills group and high dose ershiwuwei lvxue pills group.Every group was eight rats.The blank control group and the CIA model group were fed with equal volume of double distilled water for four weeks.The contents of IL-17A and TGF-β1 in serum were measured by ELISA after the rats were killed.Result:Compared with CIA group，the AI scores and paw thickness of the Ershiwuwei lvxue pills groups obviously decreased.Compared with CIA group，the level of IL-17A in serum of ershiwuwei lvxue pills groups decreased obviously while the level of TGF-β1 increased evidently.Conclusion:Ershiwuwei lvxue pills has a obviously therapeutic effect on CIA rats and may play the role of the treatment of RA through regulating the balance of Th17/Treg cells.

ershiwuwei lvxue pills;Dry yellow water;Rheumatoid Arthritis;Th17/Treg balance

R593.22

:B

:1006-3250(2016)08-1053-04

2015-12-16

胡華剛(1983-)，男，山東濟(jì)寧人，醫(yī)學(xué)博士后，從事傳統(tǒng)醫(yī)藥治療痹癥的基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:何 堅(jiān)，男，副教授，從事骨關(guān)節(jié)疾病的中醫(yī)康復(fù)研究，Tel:18960818819;鞠大宏(1963-)，男，遼寧鳳城人，研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)防治痹癥(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨質(zhì)疏松癥)的臨床與基礎(chǔ)研究，Tel:010-64089025，E-mail: judahong@sohu.com。