糖腎煎對早期2型糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞α-actinin-4、ZO-1表達的影響*

胡愛民，晏 玲，張利芳，趙 靜，張顯林，萬巧巧

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065)

糖腎煎對早期2型糖尿病腎病大鼠足細(xì)胞α-actinin-4、ZO-1表達的影響*

胡愛民1，晏 玲1，張利芳1，趙 靜1，張顯林1，萬巧巧2

(1.武漢市中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430014;2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢 430065)

目的:探討α-輔肌動蛋白-4(α-actinin-4)、緊密連接蛋白(ZO-1)在早期糖尿病腎病(DN)大鼠腎臟表達與DN的關(guān)系，中藥糖腎煎對保護腎臟的作用機制。方法:采用單腎切除+高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，結(jié)合行為干預(yù)建立早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病病證結(jié)合大鼠模型，按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組(N組)、模型組(M組)、糖腎煎組(T組)、貝那普利組(B組)。干預(yù)16周，觀察各組大鼠一般狀況、空腹血糖(FBG)、負(fù)荷后血糖(P2hBG)、空腹胰島素(FINS)、胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、24 h尿白蛋白(24 h-UAlb)、尿β2微球蛋白(U-β2MG)、血尿素氮(BUN)、血肌酐(Cr))、足細(xì)胞密度及病理改變，應(yīng)用免疫組化及熒光定量PCR方法觀察α-actinin-4、ZO-1及mRNA表達。結(jié)果:與N組比較，M組一般狀況較差，F(xiàn)BG、P2hBG、FINS、HOMA-IR、24 h-UAlb、U-β2MG水平指標(biāo)均有明顯上升，α-actinin-4、ZO-1的累積光密度值(IOD)下降，PCR表達下降，足細(xì)胞密度較少，足突增寬、融合;與M組比較，T、Z組各指標(biāo)均有改善;與B組比較，T組HOMA-IR、α-actinin-4、ZO-1的IOD有所改善，余指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:中藥糖腎煎能上調(diào)足細(xì)胞α-actinin-4、ZO-1的表達從而保護足細(xì)胞、延緩DN的進展。

2型糖尿病腎病;α-actinin-4;ZO-1;糖腎煎

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，足細(xì)胞及其相關(guān)蛋白的變化與DN發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。本研究通過建立DN病證結(jié)合模型，從基因水平探討足細(xì)胞α-actinin-4、ZO-1蛋白與DN發(fā)生發(fā)展關(guān)系并研究中藥復(fù)方糖腎煎對其影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 采用左腎切除+高脂飼料+小劑量鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射，并結(jié)合行為干預(yù)(饑飽失常、過度疲勞、驚嚇)方式，建立早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病大鼠的病證結(jié)合模型［1］。采用隨機數(shù)字表法將SPF級Wistar大鼠分為假手術(shù)組(N)、造模組，初步造模成功(腹腔注射STZ72h后剪尾取血行OGTT試驗，用強生血糖儀檢測血糖，以FBG≥5.6 mmol/L、P2hBG≥7.8 mmol/L為標(biāo)準(zhǔn))的大鼠再隨機分為模型組(M組)、糖腎煎組(T組)、貝那普利組(B組)。T組用糖腎煎(水煮醇提法制備成浸膏，用生理鹽水稀釋成濃度為2.5 g/ml的溶液)、B組用貝那普利(用生理鹽水稀釋成濃度為2 mg/ ml的溶液)分別以10 g/kg·d、10 mg/kg·d灌胃，每天1次，連續(xù)16周;N組和M組灌等體積飲用水。

1.2 標(biāo)本采集

實驗結(jié)束前1周采用金屬代謝籠收集24 h尿標(biāo)本。實驗結(jié)束前1 d行OGTT試驗及胰島素釋放試驗。實驗結(jié)束禁食12～14 h稱重，以戊巴比妥鈉腹腔麻醉，腹主動脈取血分離血清備用。取右腎并稱重，取部分腎組織分別固定于4%多聚甲醛溶液(光鏡標(biāo)本)和2.5%戊二醛溶液(4℃保存，電鏡標(biāo)本)備用。取部分腎皮質(zhì)在冰浴條件下制成勻漿氯化鈉液，離心取上清液，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法

FBG、P2hBG用葡萄糖氧化酶法，INS、U-β2MG采用化學(xué)發(fā)光法，24 h-UAlb用免疫透射比濁法，BUN用尿素酶-谷氨酸脫氫酶法，Cr用酶法，均嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。HOMA-IR=(FBG×FINS)/ 22.5。足細(xì)胞相對密度:組織石蠟切片經(jīng)梯度脫水后行WT1免疫組化染色，光鏡400視野下采集圖像，運用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，采用逐點描繪區(qū)域法計算腎小球面積，同時計數(shù)腎小球內(nèi)褐色陽性細(xì)胞核即足細(xì)胞核個數(shù)。足細(xì)胞相對密度=足細(xì)胞核個數(shù)與腎小球面積之比，取其平均值。電鏡采用鈾鉛雙染。α-actinin-4、ZO-1免疫組化:組織石蠟切片經(jīng)梯度脫水后采用DAB染色，每組內(nèi)每張切片隨機挑選3個光鏡200倍視野進行拍照，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色作為陽性統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，分析得出每張照片陽性細(xì)胞的累積光密度值(IOD)，IOD值越大陽性表達越強，并計算其平均值。熒光定量PCR:總RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄、定量PCR。擴增條件:預(yù)變性95℃，10 min;循環(huán)(40次)95℃，15s→60℃，60 s;溶解曲線75℃→95℃，每20 s升溫1℃)，ΔΔCT法處理結(jié)果(ΔΔCT法:αactinin-4、ZO-1基因相對表達差異用表達倍數(shù)=2－K表示)，K=A-B，A=CT(待測樣本基因)－CT(βactin)，B=CT(假手術(shù)組目的基因)－CT(假手術(shù)組β-actin)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料方差齊采用t檢驗，方差不齊采用t＇檢驗，多個樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀況

N組大鼠肌肉豐滿，毛發(fā)潔白順滑，精神飽滿，大便黑褐色顆粒狀，舌淡紅潤澤;M組大鼠消瘦，喜蜷臥或成堆趴臥，少數(shù)急躁易怒易驚恐，毛色暗黃無光澤、舌胖大少津等氣陰兩虛表現(xiàn)明顯;T組大鼠上述狀況均有明顯改善;B組大鼠上述狀況有一定程度的改善。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量、FBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR及腎質(zhì)量/體質(zhì)量結(jié)果比較(表1)

2.3 各組大鼠24 h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及足細(xì)胞相對密度結(jié)果比較(表2)

表1 各組大鼠體重、FBG、P2hBG、FINS、HOMA-IR及腎重/體質(zhì)量結(jié)果比較

表2 各組大鼠24 h-UAlb、U-β2MG、BUN、Creat及足細(xì)胞相對密度結(jié)果比較

2.4 電鏡下病理改變

圖1顯示，N組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，GBM均勻無增厚，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，足突分布均勻且無融合;M組腎小球結(jié)構(gòu)欠清晰，足細(xì)胞足突增寬變形、節(jié)段性融合，嚴(yán)重者廣泛融合;與M組比較，T組和B組GBM輕度增厚，足細(xì)胞足突增寬程度較輕，足突部分融合。

2.5 各組大鼠ZO-1、α-actinin-4鏡下免疫組化結(jié)果

圖2顯示，N組大鼠腎組織α-actintin-4沿腎小球毛細(xì)血管袢呈連續(xù)均勻的點線狀分布;M組染色強度較N組明顯降低;T組、B組染色強度較M組明顯增加。

圖1 各組大鼠足細(xì)胞透射電鏡下病理變化(鈾鉛雙染色2500×)

圖2 各組大鼠α-actintin-4免疫組化染色(DAB染色200×)

圖3顯示，N組大鼠腎組織ZO-1沿腎小球毛細(xì)血管袢呈連續(xù)均勻的點線狀分布;M組染色強度較N組明顯降低，呈點狀、短線狀和節(jié)段性缺失;T組、B組染色強度較M組明顯增加。

2.6 各組大鼠α-actinin-4、ZO-1的IOD值(表3)

表3 各組大鼠α-actinin-4、ZO-1的IOD結(jié)果比較

圖2 3 各組大鼠ZO-1免疫組化染色(DAB染色 200×)

2.7 各組大鼠α-actinin-4、ZO-1熒光定量PCR (ΔΔCT表示)結(jié)果比較(表4)

表4 各組大鼠α-actinin-4、ZO-1熒光定量PCR結(jié)果比較

3 討論

蛋白尿是DN早期的臨床表現(xiàn)，也是診斷DN的主要依據(jù)［2］。蛋白尿發(fā)生發(fā)展的機制十分復(fù)雜，各種原因?qū)е碌哪I小球濾過屏障結(jié)構(gòu)及功能的改變是蛋白尿產(chǎn)生的病理生理基礎(chǔ)，足細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變和(或)其分子表達異常與DN蛋白尿產(chǎn)生密切相關(guān)。足細(xì)胞是終末分化多突狀細(xì)胞，位于GBM的外側(cè)，由胞體、主足突和次級足突構(gòu)成，相鄰的足突呈并指狀相互交錯，形成拉鏈樣的結(jié)構(gòu)，稱為裂孔膈膜(SD)。α-actinin-4是 actinin(輔肌動蛋白)家族的成員之一，特異表達于腎小球足細(xì)胞，具有交聯(lián)肌動蛋白微絲的功能，可以將松散的肌動蛋白交聯(lián)成具有收縮能力的纖維束，在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。胡光華［4］等綜述國內(nèi)外研究進展認(rèn)為，病理條件下α-actinin-4表達和分布的異常，一方面影響足細(xì)胞SD的正常結(jié)構(gòu)和功能，另一方面干擾纖維狀肌動蛋白(F-actin)和整合素 α3β1(integrin α3β1，足細(xì)胞貼近GBM側(cè)的跨膜蛋白)二者的平衡，以上2種變化都可能造成F-actin的解聚和重分布，引起足突融合以及與GBM的作用減弱。張路路等［5］體外實驗結(jié)果表明，高糖刺激后足細(xì)胞內(nèi)αactinin-4的表達下調(diào)，并向細(xì)胞內(nèi)部集中，可能刺激足細(xì)胞肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)重排。李思佳等［6］

研究表明，α-actinin-4的表達降低參與了DN大鼠蛋白尿的發(fā)生。ZO-1是一種在上皮細(xì)胞間的緊密連接蛋白，在腎小球上位于SD插入足突處的胞質(zhì)側(cè)，主要表達在足突上，能與肌動蛋白(actin)細(xì)胞骨架相互作用，將SD蛋白連接至actin細(xì)胞骨架上，對穩(wěn)定足突結(jié)構(gòu)非常重要［7］。鄒敏書等［8］研究結(jié)果表明，DM鼠腎小球ZO-1表達降低，從足細(xì)胞膜至胞漿易位并重新分布，導(dǎo)致其他足細(xì)胞連接蛋白的改變，使SD從肌動蛋白細(xì)胞骨架中分離，蛋白的通透性增加，參與了DN的發(fā)病。殷玉紅［9］等研究表明，ZO-1在糖尿病腎病發(fā)展過程中表達減低，并與足細(xì)胞數(shù)目呈正相關(guān)，ZO-1的表達減低與足細(xì)胞數(shù)目減少、尿蛋白的發(fā)生密切相關(guān)。

DN屬于中醫(yī)“消渴”“水腫”“尿濁”等范疇。本病基本特點為本虛標(biāo)實，本虛為氣陰兩虛，標(biāo)實為痰熱郁瘀［10］。本研究采用筆者臨床經(jīng)驗方“糖腎煎”(由生黃芪、太子參、生地黃、山藥、山茱萸、茯苓、丹皮、五味子、赤芍、三七組成)進行干預(yù)，方中重用黃芪為君，益氣利水消腫;太子參、山藥健脾益氣;生地清熱涼血、養(yǎng)陰生津;山茱萸補益肝腎;茯苓健脾滲濕、利水消腫;丹皮清熱涼血、活血化瘀;三七化瘀止血消腫;五味子補腎益氣生津，全方共奏補益脾腎、益氣養(yǎng)陰清熱、活血通絡(luò)之功。

本研究中，模型組氣陰兩虛表現(xiàn)明顯，血糖升高，HOMA-IR、24 h-UAlb、U-β2MG升高，腎功能尚正常，符合早期(氣陰兩虛型)2型糖尿病腎病特點。模型組中α-actinin-4、ZO-1的IOD下降，基因表達下降，與尿蛋白成負(fù)相關(guān)，表明其與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。中藥糖腎煎干預(yù)后血尿生化指標(biāo)改善，足細(xì)胞密度較少程度及足突融合程度較模型組好轉(zhuǎn)，α-actinin-4、ZO-1的IOD增加，基因表達上調(diào)，證實糖腎煎能顯著減少DN尿蛋白，改善足細(xì)胞損傷，對腎臟具有保護作用，其作用機制可能是通過上調(diào)足細(xì)胞α-actinin-4、ZO-1蛋白的基因表達實現(xiàn)的。

［1］胡愛民，晏玲，張利芳，等.2型糖尿病腎病氣陰兩虛型動物模型的建立及評價［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2015，21 (10):1251-1253.

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Tangshenjian’Impact on the Early Type 2 Diabetic Nephropathy Rats Podocyte Alpha Actinin-4、ZO-1 Expression

HU Ai-min1，YAN Lin1，ZHANG Li-fang1，ZHAO Jing1，ZHANG Xian-lin1，WAN Qiao-qiao2
(1.Wuhan Hospital of Traditional Chinese Medcine Endocrinology，Hubei Wuhan 430014，China; 2.Hubei University of Traditional Chinese Medcine，Hubei Wuhan 430000，China)

Objective:To investigate the α-actinin-4、ZO-1 in early diabetic nephropathy(DN)in the rat kidney expression and traditional Chinese medicine Tangshenjian on its interventi-on，to study the effect of the renal protective mechanism.Methods:using single renal resection+high-fat+small dose of streptozocin(STZ)intraperitoneal injection，combined with behav-ior intervention，establish early(Qiyin deficiency type)in type 2 diabetic nephropathy ratsmodel，were rando-mly divided into control group(N group)，model group(M)，Tangshenjiangroup(group T)，the Captopril group(group B).Intervention to observe each group for 16weeks general condition，blood and urine of rats biochemical indicators(fasting blood glucose(FBG)，load after blood glucose(P2hBG)，fasting insulin(FINS)，insulin resistance index(HOMA IR)，24Hurinary albumin(24 h-UAlb)，urine β2 microglobulin(U-β2MG)，blood ureanitrogen(BUN)，serum creatinine(Cr)，the density of podocyte and pathological changes of thepodocyte undere lectron microscope，immunohistochemical and fluorescence quantitative PCRmethod is appl-ied to observe Alpha auxiliary actin-4(α-actinin-4)、zonula occludens-1(ZO-1)proteinand mRNA expression changes.Results:compared with N group，group Mpoor generalcondition，F(xiàn)BG，P2hBG，F(xiàn)INS，HOMA IR，24 h-UAlb，U-β2MG level indicators aresignificantlyincreased，alpha actinin-4、ZO-1proteinthe cumulative values optical density(IOD)，PCR expression podocytedensity decreased，foot process broadening andfusion;compared with group M，T，each index Z group were improved;compared with group B，group T HOMA IR，α-actinin-4，ZO-1 IOD improved，the index has no obvious difference.Conclusion:Tangshenjian can improvethe early DN rat general condition and related indicators，such as urinary protein，it may be through the podocyte αactinin-4、ZO-1 expression so as to protect the podocyte cell，delay the progress of DN.

Tangshenjian;type 2 diabetic nephropathy;α-actinin-4;ZO-1

R285.5

:B

:1006-3250(2016)08-1050-03

2015-06-24

湖北省衛(wèi)生計生委資助課題(2013Z-Y36);武漢市2014年“黃鶴英才(醫(yī)療衛(wèi)生)”計劃;武漢市衛(wèi)生局資助課題(武衛(wèi)(2009)76號)

胡愛民(1960-)，男，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師，從事內(nèi)分泌代謝病的中醫(yī)藥臨床與研究。

【實驗研究】