左金方和5-FU對胃癌細(xì)胞生長及BAX/Bcl-2表達的調(diào)控研究*

周紅祖，周禹練，余惠旻△

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518020;2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518060)

左金方和5-FU對胃癌細(xì)胞生長及BAX/Bcl-2表達的調(diào)控研究*

周紅祖1，周禹練2，余惠旻2△

(1.深圳市中醫(yī)院，廣東深圳 518020;2.深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東深圳 518060)

目的:研究左金方和5-FU單獨與聯(lián)合對人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌MGC803細(xì)胞生長及凋亡的影響及對BAX/Bcl-2蛋白表達水平的改變。方法:將不同濃度的左金方、5-FU及兩藥聯(lián)合作用于體外培養(yǎng)的人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞MGC803，Cell Counting Kit-8(CCK-8)檢測細(xì)胞增殖率的變化，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western blot法檢測bcl-2、bax蛋白表達。結(jié)果:1.00 ug·mL－1左金方、50.00、100.00 ug·mL－15-FU作用GES-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(107.54± 2.25)%、(53.67±1.91)%和(47.43±1.35)%，作用MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率分別為(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)和(45.60±1.14)%;左金方聯(lián)合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00+100.00)作用GES-1細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率分別為(81.66±2.22)%和(78.68±2.10)%，作用MGC803細(xì)胞24 h后，相應(yīng)的凋亡率為(61.30±1.71)%和(71.30±1.79)%，與單獨用藥比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western Blot凝膠電泳圖可以看出，左金方聯(lián)合5-FU(1.00+50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00 +100.00)作用MGC803細(xì)胞24 h后，進一步促進Bax的表達，降低Bcl-2的表達，與各單獨用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:左金方與5-FU聯(lián)合用藥有大幅降低5-FU細(xì)胞毒性作用，顯著提高人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1的存活率;通過促進MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，促進人胃癌細(xì)胞的凋亡。

左金方;5-FU;GES-1;MGC803;聯(lián)合用藥;凋亡

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一［1-2］，目前尚無廣泛治療作用的抗胃癌中藥制劑問世。左金方是出自《丹溪心法》的名方，目前臨床常用于急慢性胃炎和消化性潰瘍的治療［3］。近年來，研究還發(fā)現(xiàn)它具有抗腫瘤作用［4-5］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，左金方能誘導(dǎo)體外培養(yǎng)胃腺癌細(xì)胞的凋亡，顯著抑制了胃癌裸小鼠移植瘤的生長［6-8］。5-氟尿嘧啶(5-FU)是一種臨床治療胃癌常用的化療藥物，但因生物利用度低，對腫瘤細(xì)胞選擇性小、毒副作用大、治療劑量與中毒劑量接近等缺點，限制了其臨床應(yīng)用。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用體外培養(yǎng)人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1和人胃癌細(xì)胞株MCG803的方法，探討左金方和5-FU單獨及聯(lián)合用藥對胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國Shella公司);DC300型倒置熒光相差顯微鏡(德國Leica公司);超凈工作臺(比利時Esco公司);Rotofix32型離心機(德國Hettich公司);AllegraTM21R型低溫離心機(美國Coulter公司);Epics XL型流式細(xì)胞儀(美國 Coulter公司); Polar star Galaxy型酶標(biāo)儀(德國BMG公司)。

1.2 主要藥物與試劑

黃連、吳茱萸均購自深圳華輝藥業(yè)有限公司，由深圳市中醫(yī)院中藥科劉志誠主任藥師鑒定，分別為毛茛科植物黃連Coptis chinensis Franch.的干燥根莖和蕓香科植物吳茱萸 Evodia rutaecarpa(Juss) Benth.干燥近成熟的果實。Cell Counting Kit-8 (CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所Dojindo)、碘化丙啶(PI)、RNA酶(RNase)均購自美國 Sigma公司; DMEM培養(yǎng)基、胰酶(trypsin，美國Gibico公司);胎牛血清(FBS，美國 Hyclone公司);Hoechst 33258 (瑞士Fluka公司)，5-氟尿嘧啶(5-FU，天津金耀氨基酸有限公司，批號 1412011);Alexa FluorR 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit (美 國Lifetechnology公司)。

1.3 細(xì)胞

人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1和人低分化胃腺癌細(xì)胞系MGC803購自中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物細(xì)胞中心(細(xì)胞源自美國ATCC細(xì)胞庫)。

2 方法

2.1 藥物制備

左金方傳統(tǒng)湯劑凍干粉由本實驗室提供，取黃連30 g、吳茱萸5 g加8倍蒸餾水浸泡30 min，加水煎煮3次，每次30 min過濾，合并3次濾液，冷凍干燥，每克干粉含生藥3.98 g。經(jīng)HPLC法測定，左金方凍干粉中含小檗堿39.85%，巴馬汀9.19%，藥根堿4.86%，吳茱萸堿0.17%，吳茱萸次堿0.19%。將左金方凍干粉溶于去離子水中配置成1 mg/mL的母液，實驗時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

5-FU的配制方法:取適量5-氟尿嘧啶注射液原液加細(xì)胞培養(yǎng)液配制成1 mg/ml母液，實驗時用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

GES-1人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株、MGC803人胃腺癌細(xì)胞株在10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中，于37℃條件下，在濕度為100%、含CO2為5%(體積分?jǐn)?shù))的CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

2.3 觀察指標(biāo)與方法

2.3.1 CCK-8檢測細(xì)胞活性 取人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1對數(shù)生長期細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液(5×104/mL)加入96孔板、100 μL/孔，培養(yǎng)12 h后給藥，實驗組分別加入不同濃度的供試藥物，分別培養(yǎng)24、48 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(OD)。其中將未經(jīng)處理的對照組細(xì)胞存活率設(shè)定為100%。細(xì)胞抑制率=(1－實驗組平均OD值/對照組平均OD值)× 100%。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測 調(diào)整人胃腺癌細(xì)胞MGC803密度為2×105/mL，以1.5 mL/well種入6孔板，每組6個復(fù)孔。藥物作用24 h后，細(xì)胞刷刮取細(xì)胞，800 r/min離心5 min去上清，加入PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL。取適量于流式管中，加入工作液500 uL，再加入熒光染料(10 uL Annexin V FITC和5uL PI混合液)，350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾去除細(xì)胞團塊，室溫避光染色15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率(激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI)。測定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進行數(shù)據(jù)處理，以右下代表的早期凋亡率加上右上代表的中后期凋亡率的總和代表細(xì)胞調(diào)亡率。

2.3.3 Western blot檢測Bcl-2和Bax的表達

提取蛋白前將PMSF 10 μL加入1 mL細(xì)胞裂解液RIPA，取經(jīng)藥物作用后細(xì)胞約2.4×106個加入RIPA，冰上裂解30 min，10000 r/min離心10 min取上清。BCA測定蛋白濃度，酶標(biāo)儀測定波長為A562，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出蛋白濃度。灌制12%分離膠，4%濃縮膠的SDS-PAGE凝膠。吸取80 μg總蛋白，恒壓100 V電泳直到溴酚藍(lán)到達分離膠底部。濕法電轉(zhuǎn)恒壓100 V、120 min，將蛋白從SDSPAGE凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜。3%的脫脂奶粉/PBS-T封閉，按1∶500稀釋Rabbit anti-Bcl-2/-Bax，4℃孵育過夜。1∶3000稀釋二抗Goat anti-Rabbit IgG，孵育1 h，增強化學(xué)法(Enhanced Chemiluminescence，ECL)顯影，UVI凝膠成像系統(tǒng)攝像。

2.3.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 1010統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 (±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 藥物對GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.1.1 左金方對GES-1細(xì)胞存活率的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示，左金方對GES-1細(xì)胞活力的影響很小，即當(dāng)給藥濃度增加到一定程度后(如10 ug·mL－1)，隨著給藥濃度的增加、作用時間的延長，細(xì)胞活力稍有減弱。圖1顯示，小劑量的左金方能促進人正常胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和分裂，1.00 ug ·mL－1左金方作用GES-1細(xì)胞24、48 h的細(xì)胞存活率分別為(107.54±2.25)%和(115.96±2.86)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3.1.2 5-FU對GES-1細(xì)胞存活率的影響CCK-8實驗結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞生長良好，5-FU對GES-1細(xì)胞活力的影響呈現(xiàn)“濃度-時間依賴性”的關(guān)系，即隨著給藥濃度的增加和作用時間的延長，細(xì)胞活力逐漸減弱，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。圖2顯示，小劑量的5-FU會對人正常胃黏膜細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，隨著用藥濃度增加其毒性亦增強。

圖1 不同濃度的左金方作用不同時間對GES-1細(xì)胞存活率的影響

圖2 不同濃度5-FU作用不同時間對GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.2 藥物對MGC803細(xì)胞凋亡的影響

表1顯示，不同濃度左金方、5-FU作用于MGC803細(xì)胞24 h，腫瘤細(xì)胞中后期凋亡率隨給藥濃度的逐漸增高，給藥時間的延長而逐漸增大，以中后期細(xì)胞凋亡更為明顯，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

3.3 聯(lián)合用藥對GES-1和MGC803細(xì)胞生長的影響

3.3.1 聯(lián)合用藥對GES-1細(xì)胞存活率的影響 表2顯示，根據(jù)左金方與5-FU單獨用藥影響，GES-1和MGC803細(xì)胞生長的實驗結(jié)果，選定1.00 ug·mL－1為左金方，50.00、100.00 ug·mL－1為5-FU聯(lián)合用藥的濃度。聯(lián)合用藥的CCK-8結(jié)果顯示，1.00 ug·mL－1左金方與50.00、100.00 ug·mL－15-FU聯(lián)合用藥，可大幅度降低5-FU對細(xì)胞的毒性，提高人正常胃黏膜細(xì)胞的存活率，聯(lián)合用藥的效果與5-FU單獨用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3.3.2 聯(lián)合用藥對MGC803細(xì)胞凋亡的影響 圖3、4顯示，從流式細(xì)胞的檢測結(jié)果可以看出，1.00 ug·mL－1左金方分別與50.00 ug·mL－1、100.00 ug·mL－15-FU聯(lián)合用藥作用于MGC803細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率大幅度提高(中后期凋亡占主導(dǎo))，聯(lián)合用藥組與左金方和5-FU單獨用藥比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，即聯(lián)合用藥組誘導(dǎo)凋亡的作用優(yōu)于各單獨用藥組。

表1 不同濃度藥物作用24 h對MGC803細(xì)胞凋亡率的影響(n=6)

表2 左金方與5-FU聯(lián)合用藥作用不同時間對GES-1細(xì)胞存活率的影響

3.4 左金方和5-FU單獨與聯(lián)合對人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響

Western Blot凝膠電泳圖顯示，1.00 ug·mL－1左金方、50.00 ug·mL－15-FU、100.00 ug·mL－15-FU分別作用于MGC803細(xì)胞24 h后，Bax的表達增加，而Bcl-2的表達減少;左金方聯(lián)合5-FU(1.00+ 50.00)、左金方聯(lián)合5-FU(1.00+100.00)用藥24 h后，Bax的表達進一步增加，而Bcl-2的表達進一步減少，與各單獨用藥組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);圖5顯示，左金方和50.00 ug·mL－15-FU對人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響。

4 討論

胃癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程。早期胃癌多無癥狀或僅有輕微癥狀，當(dāng)臨床癥狀明顯時病變已屬晚期，所以胃癌切除術(shù)后化療已成為晚期胃癌的主要治療方法［9］。常用的化療藥物有絲裂霉素(MMC)、順鉑(DDP)、氟脲嘧啶(5-FU)、足葉乙甙(VP-16)、阿霉素(ADM)、優(yōu)福定(UFT)等。化療藥物在胃癌的治療中有一定的效果，但其具有嚴(yán)重的毒副作用，會產(chǎn)生明顯的消化道反應(yīng)、骨髓抑制、身體虛弱、發(fā)熱、脫發(fā)、腎毒性、神經(jīng)毒性和過敏反應(yīng)等并發(fā)癥［10］。大量研究證實，中藥配合化療治療胃癌可明顯改變癥狀、增加有效率、延長生存期，防復(fù)發(fā)、抗轉(zhuǎn)移，平衡和調(diào)節(jié)機體內(nèi)環(huán)境，提高和改善機體免疫能力，保護重要器官功能，減輕化療毒副反應(yīng)，提高生存質(zhì)量［11］。

圖3 各組Annexinⅴ/PI凋亡檢測圖

圖4 各組腫瘤細(xì)胞凋亡率

圖5 左金方和5-FU對人胃癌MGC803細(xì)胞BAX/Bcl-2蛋白表達的影響

本研究CCK-8結(jié)果顯示，左金方對人正常胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1活力影響很小，而小劑量的5-FU具有很明顯的細(xì)胞毒性。左金方與5-FU聯(lián)合用藥后，顯著提高人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細(xì)胞毒性。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，左金方與5-FU均能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC803的凋亡，二者聯(lián)合用藥后，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MGC803凋亡的作用優(yōu)于左金方或5-FU單獨用藥。

細(xì)胞凋亡是目前腫瘤研究中的熱點之一，目前普遍認(rèn)為凋亡與細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化類似，受細(xì)胞內(nèi)多種基因調(diào)控，是一個級聯(lián)式(cascade)基因表達的結(jié)果，bcl-2和bax的比率就成為細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的關(guān)鍵因素［12］和評價藥物抗腫瘤的重要指標(biāo)。大量的研究表明，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡是中藥治療腫瘤的重要機制。本研究中Western Blot凝膠電泳中Bax與Bcl-2蛋白表達的結(jié)果表明，左金方與5-FU聯(lián)合用藥，促進了MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，其作用優(yōu)于單獨用藥。結(jié)合CCK-8和流式細(xì)胞儀的檢測結(jié)果說明，左金方與5-FU聯(lián)合用藥顯著提高人正常胃黏膜細(xì)胞GES-1的存活率，大幅降低5-FU的細(xì)胞毒性作用，并通過促進MGC803細(xì)胞中Bax蛋白的高表達和Bcl-2的低表達，促進胃腺癌細(xì)胞的凋亡。

臨床上依據(jù)腫瘤的組織分化(高分化、中分化和低分化)來判斷其惡性程度，高分化腫瘤惡性程度低、預(yù)后較好，低分化腫瘤惡性程度高、預(yù)后較差，中分化腫瘤介于二者之間。MGC-803細(xì)胞株屬于低分化胃腺癌細(xì)胞系，結(jié)合前期左金方誘導(dǎo)人胃腺癌細(xì)胞株SGC-7901(中分化)的研究［6-8］，本研究不僅為左金方誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡作用增添了新的實驗依據(jù)，也為拓展可用于臨床治療胃癌的中藥及其復(fù)方制劑、降低抗胃癌化療藥物的毒副作用、提高治療效果提供了新的思路。

［1］Katharina Hütz，Raquel Mejías-Luque，Katarina Farsakova，et al.The stem cell factor SOX2 regulates the tumorigenic potential in human gastric cancer cells［J］.Carcinogenesis，2014，35: 942-950.

［2］Jianming Liu，Lilin Ma，Zhiwei Wang，et al.MicroRNA expression profile of gastric cancer stem cells in the MKN-45 cancer cell line［J］.Acta Biochim Biophys Sin，2014，46:92-99.

［3］陳艷芬，陳蔚文，李茹柳，等.左金丸和反左金丸對大鼠胃腺黏膜保護機制的比較研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20(2):133-135.

［4］蔣惠芳.左金丸新用［J］.新中醫(yī)，2001，33(10):67-68.

［5］張保國，劉慶芳.左金丸現(xiàn)代臨床新用［J］.中成藥，2010，32 (8):1408-1410.

［6］周紅祖，徐麗霞，余惠旻，等.左金方、黃連、吳茱萸誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的作用比較［J］.藥物分析雜志，2015，35(7):34-39.

［7］周紅祖，余惠旻.左金方及其組方成分對人胃癌細(xì)胞 SGC-7901凋亡及膜電位的影響［J］.中南藥學(xué)，2015，13(6): 598-602.

［8］彭求賢，余惠旻，胡勝全，等.左金丸誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡的研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2009，41(4):70-71.

［9］Chuanwu Cao，Chenhui Lu，Jichong Xu，et al.Expression of Rab25 correlates with the invasion and metastasis of gastric cancer［J］.Chin J Cancer Res，2013，25(2):192-199.

［10］Osaki M，Tatebe S，Goto A，et al.5-Fluorouracil(5-FU) induced apoptosis in gastric cancer cell lines:role of the p53 gene［J］.Apoptosis，1997，2(2):221-226.

［11］Tan YL，Goh D，OngES.Investigation of differentially expressed proteins due to the inhibitory effects of berberine in human liver cancer cell line HepG2［J］.Mol Biosyst，2006，2 (5):250-258.

［12］Ferlini C，Raspaglio G，Mozzetti S，et al.Bcl-2 down-regulation is a novel mechanism of paclitaxel resistance ［J］.Mol2Pharmacol，2003，64(1):51-58.

Regulation of Growth and BAX/Bcl-2 Expression of Human Gastric Cancer Cells by Zuojin Decoction and 5-FU

ZHOU Hong-zu1，ZHOU Yu-lian2，YU Hui-min2△
(1.Shenzhen Chinese Medicine Hospital，Guangdong Shenzhen 518020，China; 2.School of Medicine，Shenzhen University，Guangdong Shenzhen 518060，China)

Objective:to study the cell growth of Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1，the apoptosis of Human Gastric Carcinoma MGC803 and the changes of Bax/Bcl-2 in the level of protein expression caused by ZuoJinFang and 5-Fu separately and together.Methods:Human Gastric Mucosal Epithelial Cell GES-1 and Human Gastric Carcinoma MGC803 cells were cultured in vitro and treated by ZuoJinFang and 5-Fu with different concentration separately and together，the growth inhibitions of GES-1 cell were analyzed by Cell Counting Kit-8(CCK-8)，the apoptosis rates of MGC803 cell were studied by flow cytometry and the expressions of Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.Results:After the cells treated by 1.00 ug·mL－1ZuoJinFang，50.00、100.00 ug·mL－15-FU for 24 h separately，the percentage of GES-1 cell viabilities were(107.54±2.25)%，(53.67±1.91)and(47.43±1.35)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(45.46±1.66)%、(37.02±1.68)and(45.60±1.14)%;after the cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00+50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the percentage of GES-1 cell viabilities were(81.66±2.22)%and(78.68±2.10)%，the percentages of apoptosis of MGC803 cell were(61.30± 1.71)and(71.30±1.79)%，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.The Western Blot gel electrophoresis figures show that the expressions of Bax were further increased and the expressions of Bcl-2 were decreased accordingly after the MGC803 cells treated by ZuoJinFang combined with 5-FU(1.00 +50.00 or 1.00+100.00 ug·mL－1)for 24 h，the differences in comparison with ZuoJinFang and 5-Fu group separately were statistically significant.Conclusion:ZuoJinFang combined with 5-FU，greatly reduced the side effects of 5-FU，significantly increased the survival rates of the GES-1 cells，promoted the apoptosis of gastric carcinoma MGC803 cells by promoting high expression of Bax protein and low expression of Bcl-2 protein.

ZuoJinFang;5-FU;GES-1;MGC803;Drug conbibation;Apoptosis

R285.5

B

1006-3250(2016)06-0777-04

2015-10-12

廣東省中醫(yī)藥局項目(20141253)

周紅祖(1971-)，女，新疆人，副主任藥師，從事中藥腫瘤藥理學(xué)及中藥學(xué)基礎(chǔ)研究。

△通訊作者:余惠旻(1972-)，男，新疆人，醫(yī)學(xué)博士，從事中藥及其復(fù)方抗腫瘤的臨床與研究，Tel:0755-86671902，E-mail:yuhuimin@szu.edu.cn。