小鼠不同心肌肥厚模型標(biāo)志性基因表達(dá)變化的比較

闞紅衛(wèi)，司文文，尹艷艷，何　燦，程　杰，汪春彥，張瓊光，楊　雁

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 合肥　230022；2. 安徽省食品藥品審評認(rèn)證中心， 安徽 合肥　230051；3. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥　230051；4. 湖北省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評核查中心，湖北 武漢　430071)

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小鼠不同心肌肥厚模型標(biāo)志性基因表達(dá)變化的比較

闞紅衛(wèi)1,2，司文文3，尹艷艷1，何燦1，程杰3，汪春彥3，張瓊光4，楊雁1

(1. 安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室，安徽 合肥230022；2. 安徽省食品藥品審評認(rèn)證中心， 安徽 合肥230051；3. 安徽省食品藥品檢驗(yàn)研究院，安徽 合肥230051；4. 湖北省食品藥品監(jiān)督管理局技術(shù)審評核查中心，湖北 武漢430071)

中國圖書分類號：R-332；R322.11；R363-332；R394.2；R542.202.2；R977.6

摘要：目的探索小鼠不同心肌肥厚模型間肥厚性標(biāo)志基因心房利尿鈉肽(ANP)、腦利尿鈉肽(BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)基因表達(dá)的差異。方法取C57BL/6小鼠，采用腎上腹主動脈縮窄(AAC)、動靜脈瘺(AVF)和異丙腎上腺素(ISO)分別建立小鼠心肌肥厚模型。造模結(jié)束，稱取各小鼠體重(BW)、心臟重量(HW)和左室重量(LVW)，計(jì)算心臟重量指數(shù)(HW/BW)和左心室指數(shù)(LVW/BW)；HE染色觀察心肌病理組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色觀察心肌組織ANP、BNP 和β-MHC蛋白表達(dá)；采用Real-time PCR檢測心肌ANP、BNP 和β-MHC mRNA表達(dá)。結(jié)果與對照組比較，3種模型的HW/BW和LVW/BW升高，光鏡下觀察各模型小鼠心肌呈現(xiàn)不同程度的肥厚性變化，ANP、BNP和β-MHC在蛋白和mRNA表達(dá)水平均不同程度增加；與AAC組比較，AVF和ISO組心肌組織ANP、BNP和β-MHC在蛋白和mRNA表達(dá)水平均降低。結(jié)論3種心肌肥厚模型造模成功，AAC模型心肌組織在同時表達(dá)肥厚性標(biāo)志基因ANP、BNP和β-MHC時優(yōu)于AVF和ISO。

關(guān)鍵詞:小鼠；心肌肥厚；心房利尿鈉肽；腦利尿鈉肽；β-肌球蛋白重鏈；模型

近年的分子遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，至少有60%～70%的肥厚型心肌病為基因突變所致?，F(xiàn)已知有19個基因與該病有關(guān)，其中胚胎基因心房利尿鈉肽(atrial natriuretic peptide, ANP)、腦利尿鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)、β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain, β-MHC)等的重新表達(dá)被認(rèn)為是心臟肥厚的分子標(biāo)志，檢測這些基因的表達(dá)改變不僅可以肯定心臟肥厚的存在，而且可以判斷肥厚的程度以及預(yù)后[1-2]。

目前研究表明，不同心肌肥厚(cardiac hypertrophy,CH )模型間多數(shù)心室基因表達(dá)譜的變化存在差異，有些基因表達(dá)水平改變的方向相同，部分基因表達(dá)水平改變方向相反[3]。為了解心肌肥厚標(biāo)志性基因在不同模型上的表達(dá)差異, 本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了3種常見小鼠心肌肥厚模型：腎上腹主動脈縮窄(renal abdominal aortic coarctation, AAC)模型、動靜脈瘺(arteriovenous fistula, AVF)[4]模型和異丙腎上腺素( isoproterenol, ISO )模型，這3種模型都是經(jīng)典的且被國內(nèi)外研究者廣泛認(rèn)可，但尚未見到不同心肌肥厚模型間肥厚性標(biāo)志基因(ANP、BNP 和β-MHC)表達(dá)差異性相關(guān)文獻(xiàn)報道。

本文擬通過比較上述3種基因在mRNA和蛋白水平的差異性，來評價心肌肥厚模型的優(yōu)劣，為深入探索心肌肥厚疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，及相關(guān)靶向藥物的篩選研發(fā)、應(yīng)用奠定初步的實(shí)驗(yàn)性理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1動物SPF級C57BL/6小鼠,♀♂各半，體質(zhì)量18～22 g，由安徽省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(皖)2011-002。

1.2儀器與試劑TP1020型脫水機(jī)，萊卡(德國)公司；BX-51型顯微鏡，OLYMPUS。DAB顯色試劑盒，批號：K136621D，北京中杉金橋生物科技有限公司；PV-6000通用型二步法檢測試劑盒，批號：WP133623，北京中杉金橋生物科技有限公司；β-MHC抗體(bs-0259R)，批號：140212，ANP抗體 (bs-2040R)，批號：990398W和BNP抗體(bs-2207R)，批號：980502W，均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。TRIzol 試劑(G&M Gene Technology公司)；引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒(TaKaRa 公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1小鼠AAC法小鼠術(shù)前禁食 12 h，4%水合氯醛麻醉，于小鼠劍突下沿腹中線切開皮膚及肌肉約1.5 cm。隨后可見腹主動脈和下腔靜脈。在腎動脈上方約 0.3 cm 處的腹主動脈，用 5 mL注射器針頭(0.6 mm)緊貼腹主動脈，平行放置，用 4號手術(shù)絲線結(jié)扎，抽出針頭縫合創(chuàng)口。術(shù)后4周，處死小鼠，取材檢測。

1.3.2小鼠AVF法[4]使用4%水合氯醛生理鹽水溶液，麻醉小鼠，于腹正中切口,將連有1 mL注射器的4號靜脈注射針彎折成135°角，斜向上刺穿腹主動脈，繼續(xù)進(jìn)針，刺穿動靜脈聯(lián)合壁，可見有鮮紅色動脈血進(jìn)入下腔靜脈，迅速在腹主動脈針眼處，均勻涂抹醫(yī)用膠，封住針眼，松開血管夾，可見下腔靜脈明顯變紅，觸之有震顫感，證明造瘺成功。于術(shù)后2周末，處死小鼠，取材檢測。

1.3.3小鼠ISO法異丙腎上腺素組皮下注射鹽酸異丙腎上腺素1 mg·kg-1，每天2次，間隔8 h，連續(xù)14 d。對照組皮下注射相同體積的生理鹽水。末次給藥后24 h取材檢測。

1.3.4心臟重量指數(shù)稱取各組小鼠體重(BW)，脫頸處死。稱量心臟重量(HW)，剪去心房及右室，并置于4℃ PBS 緩沖液中清洗，稱量左室重量(LVW)，計(jì)算心臟重量指數(shù)(HW/BW)和左心室指數(shù)(LVW/BW)，留取部分心肌組織用于 HE 和免疫組織化學(xué)染色，其余部分立即置于-80℃ 凍存。

1.3.5心肌肥厚標(biāo)志基因表達(dá)水平的測定將凍存的心肌組織放入組織研磨器中，并加入500 μL TRIzol 抽提總RNA。測定RNA純度、濃度后，反轉(zhuǎn)為cDNA，采用Real-time PCR 檢測。使用Real-time PCR引物，序列如下[5]：引物上、下游序列依次為:ANP:forward:5′-ACAGCCAAGGAGGAAAAGGC-3′,reverse:5′-CCACAGTGGCAATGTGACCA-3′; BNP:forward:5′-TCCAGAGCAATTCAAGATGCA-3′,reverse:5′-CTTTTGTGAGGCCTTGGTCC-3′;β-MHC:forward:5′-GATGTTTTTGTGCCCGATGA-3′,reverse:5′-ACCGT CTTGCCATTCTCCG-3′;GAPDH: forward:5′-TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3′,reverse:5′-CGAAGGTGGAA GAGTGGGAG-3′。

2結(jié)果

2.1HW/BW和LVW/BW比較對照、AAC、AVF和ISO組小鼠體質(zhì)量分別為(31.1±3.9) g、(30.4±3.3) g、(29.6±2.9) g和(30.8±3.1) g，之間差異無顯著性。Fig 1結(jié)果顯示，與對照組比較，AAC、AVF和ISO組的HW/BW、LVW/BW比值均增大(P<0.05～0.01)；與AAC比較，ISO組HW/BW、LVW/BW比值均下降(P<0.01)，AVF組HW/BW比值下降(P<0.05)。

Fig 1　Changes of HW/BW, LVW/BW in

**P<0.05，**P<0.01vscontrol；#P<0.05，##P<0.01vsAAC

2.2不同心肌肥厚模型小鼠左心室的病理形態(tài)學(xué)變化Fig 2結(jié)果顯示，在低倍鏡下，AAC、AVF和ISO組小鼠心肌可以見到室壁增厚，心室腔狹窄，其中AAC組變化明顯；在高倍鏡下，對照組的心肌細(xì)胞是修長而排列整齊，無心肌細(xì)胞肥大、壞死，無炎性細(xì)胞浸潤和間質(zhì)纖維化，AAC、AVF和ISO組部分心肌細(xì)胞變厚，排列稀疏，心肌細(xì)胞肥大，可見間質(zhì)纖維化。

2.3比較不同心肌肥厚模型小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC免疫組織化學(xué)染色的變化Fig 3結(jié)果顯示，對照組ANP、BNP和β-MHC的組織染色幾乎未見陽性細(xì)胞；與對照組比較，AAC、AVF和ISO組ANP、BNP和β-MHC的表達(dá)明顯增加；與AAC組比較，AVF和ISO組ANP、BNP和β-MHC表達(dá)降低。

2.4不同心肌肥厚模型小鼠左心室ANP、BNP和β-MHC mRNA表達(dá)水平Fig 4結(jié)果顯示，與對照組比較，AAC和AVF 組ANP、BNP和β-MHC mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05～0.01)，ISO組BNP mRNA表達(dá)水平增加(P<0.05)；與AAC組比較，AVF和ISO組ANP mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，ISO組BNP、β-MHC mRNA表達(dá)降低(P<0.01)。

Fig 2　Histopathological changes of heart in three models

Fig 3　Expression of ANP,BNP and β-MHC in different mouse models(n=6 )

Fig 4　Expression of ANP, BNP and β-MHC mRNA in three CH models (n=6)

3討論

心肌肥厚過程伴隨著復(fù)雜的基因表達(dá)水平變化，與心肌肥厚表型的發(fā)生、發(fā)展互為因果，其中ANP、BNP和β-MHC基因在心肌肥厚過程的再表達(dá)已經(jīng)得到公認(rèn)[2]。ANP主要由心房肌細(xì)胞分泌，ANP 基因的表達(dá)是所有哺乳動物心肌肥厚的特征，也是臨床上判斷疾病嚴(yán)重程度的預(yù)測指標(biāo)[6]。BNP主要在心室合成和分泌，研究表明，血漿中BNP濃度與心室射血分?jǐn)?shù)具有相關(guān)性，心室射血分?jǐn)?shù)不足時，大量的血液聚集在心室內(nèi)，導(dǎo)致心室壓力增大，心室腔擴(kuò)張，從而引起B(yǎng)NP 合成和釋放[7]。心肌肌球蛋白是心肌肌原纖維的主要成分和收縮蛋白, 主要由一對重鏈(即α-MHC 和β-MHC)和兩對輕鏈組成，通過研究各種因素引起的心肌肥厚發(fā)現(xiàn)，在早期常伴有MHC同型異構(gòu)體轉(zhuǎn)換，當(dāng)發(fā)生心肌肥厚時，β-MHC mRNA表達(dá)則明顯增強(qiáng)，心肌α-MHC向β-MHC發(fā)生轉(zhuǎn)化，所以β-MHC是心肌肥厚的一個重要的標(biāo)志性基因[8]。因此，同時檢測ANP、BNP和β-MHC基因的表達(dá)，對心肌肥厚的判定和預(yù)后將有重要的意義。

研究心肌肥厚的機(jī)制，離不開動物模型的制備，目前心肌肥厚動物模型的造模方法主要分為3類：①壓力超負(fù)荷法。采取主動脈縮窄的方法，心臟后負(fù)荷增加，導(dǎo)致心臟做功與耗氧量增加，左心室重構(gòu)而最終導(dǎo)致心肌肥厚[9]；②容量超負(fù)荷法。如動靜脈造瘺法引起動靜脈短路，增加右心室前負(fù)荷，形成右心室肥厚[4]；③激素誘導(dǎo)法。目前主要有去甲腎上腺素和甲狀腺素等[10]。研究表明[11]，只有接近臨床肥厚患者實(shí)際患病過程的模型，才有更高的研究價值。ISO法不能完全地模擬生理分泌腎上腺素的過程，且劑量過大可能導(dǎo)致動物的死亡，劑量過小則不能成功地建立肥厚模型；AVF法實(shí)驗(yàn)操作相對復(fù)雜；AAC法主要是經(jīng)過緩慢的病理變化模擬心肌肥厚，更接近肥厚疾病的真實(shí)病理進(jìn)程。如在此基礎(chǔ)上能深入地研究心肌肥厚疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，可最終為減少和改善心肌肥厚及相關(guān)治療藥物的研發(fā)和應(yīng)用奠定科學(xué)的理論基礎(chǔ)。本研究結(jié)果表明，AAC、AVF和ISO組小鼠心肌可以見到室壁增厚，心室腔狹窄，但AAC組變化明顯。

李平等[3]對以上3種心肌肥厚模型的基因表達(dá)譜進(jìn)行分析研究，結(jié)果顯示不同造模方法引起的心肌肥厚，其基因表達(dá)譜存在差異。那么這3種模型ANP、BNP和β-MHC基因表達(dá)有無差異呢？目前，同時檢測心肌組織ANP、BNP和β-MHC表達(dá)的，AAC法造模動物多采用大鼠和基因改造小鼠；AVF法造模多采用大鼠；ISO多用于誘導(dǎo)體外心肌細(xì)胞的表達(dá)。由于實(shí)驗(yàn)動物品系的差別、實(shí)驗(yàn)條件的不同，通過目前文獻(xiàn)綜述來比較3種模型ANP、BNP和β-MHC表達(dá)差異存在諸多困難。本研究表明，AAC法造模小鼠心肌組織在表達(dá)ANP、BNP和β-MHC時優(yōu)于AVF和ISO法，說明不同的造模方法ANP、BNP和β-MHC表達(dá)存在一定的差異性。提示采用AAC法制作的小鼠心肌肥厚模型，在心肌肥厚標(biāo)志性基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平上，有著更加明顯的優(yōu)勢。

本文采用的小鼠是研究心血管系統(tǒng)常用品系C57BL/6，李曉梅等[12]通過比較KM小鼠與C57BL/6兩種品系小鼠的主動脈弓縮窄模型發(fā)現(xiàn)，雖然兩種品系的小鼠均產(chǎn)生左室肥厚，但是在手術(shù)成功率、心衰發(fā)生率以及心肌肥厚出現(xiàn)時間等方面均存在差異。那么，采用不同品系小鼠對腎上腹主動脈縮窄法制作心肌肥厚模型的標(biāo)志性基因表達(dá)是否會產(chǎn)生影響呢？本課題組將會進(jìn)一步研究。

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Comparison of marker gene expression changes in different mouse models of cardiac hypertrophy

KAN Hong-wei1,2, SI Wen-wen3, YIN Yan-yan1, HE Can1, CHENG Jie3,WANG Chun-yan3,ZHANG Qiong-guang4, YANG Yan1

(1.DeptofPharmacology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China; 2.AnhuiCenterforFoodandDrugEvaluationandCertification,Hefei230051,China; 3.AnhuiProvincialFoodandDrugInspectionInstitute,Hefei230051,China;4.HubeiProvincialFoodandDrugAdministrationfortheTechnicalReviewVerificationCentre,Wuhan430071,China)

Abstract:AimTo explore the differences in hypertrophic marker genes such as atrial natriuretic peptide (ANP), brain natriuretic peptide (BNP) and β-myosin heavy chain (β-MHC) genes in different models of cardiac hypertrophy. MethodsRespectively using renal abdominal aortic coarctation (AAC), arteriovenous fistula (AVF) and isoproterenol (ISO) methods to establish C57BL/6 mouse model of cardiac hypertrophy. After modeling, each mouse’s body weight (BW), heart weight (HW) and left ventricular weight (LVW) were weighed, and the heart weight (HW/BW) and left ventricular index (LVW/BW) were calculated; myocardium by HE staining, pathological morphological changes were observed; myocardium by immunohistochemistry, ANP, BNP and β-MHC protein expression was observed; myocardium by Real-time PCR detection, ANP, BNP and β-MHC mRNA expression was observed. ResultsCompared with control group, HW/BW and LVW/BW were increased in three models. Through the light microscope, each mouse model showed varying degrees of cardiac hypertrophy. ANP, BNP and β-MHC were increased in the protein and mRNA expression. Compared with AAC group, AVF and ISO groups’ myocardial tissue ANP, BNP and β-MHC expression were decreased in the protein and mRNA expression. ConclusionsThree cardiac hypertrophy models are successful. Cardiac tissue ANP, BNP and β-MHC expression in AAC model exceeds AVF and ISO model.

Key words:mice; cardiac hypertrophy; ANP; BNP; β-MHC; model

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0274-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.024

作者簡介：闞紅衛(wèi)(1977-)，男，碩士，副研究員，研究方向：心血管和腫瘤藥理學(xué)，E-mail:hongweikan@163.com；楊雁(1964-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:yangyan@ahmu.edu.cn

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 1308085MH144);創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目(No AH201310366005)

收稿日期：2015-09-24，修回日期：2015-10-26

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.048.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57