PI3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路介導(dǎo)硫化氫后處理對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用

胡明珠，周　波，盛　瓊，杜　斌，陳俊良，龐慶豐，季　永

[1.江南大學(xué)附屬醫(yī)院 (無錫市第四人民醫(yī)院)麻醉科，江蘇 無錫　214062；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫　214062]

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PI3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路介導(dǎo)硫化氫后處理對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用

胡明珠1,2，周波1，盛瓊2，杜斌2，陳俊良2，龐慶豐2，季永1,2

[1.江南大學(xué)附屬醫(yī)院 (無錫市第四人民醫(yī)院)麻醉科，江蘇 無錫214062；2.江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院，江蘇 無錫214062]

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R322.11；R329.25；R331.31；R542.202.2

摘要：目的探討PI3K/Akt/Sirt1 信號(hào)通路是否參與硫化氫(H2S)抗心肌缺血/再灌注( I/R )損傷的作用。方法采用Langendorff灌流裝置建立大鼠離體心臟I/R損傷模型，平衡灌注20 min后，全心停灌30 min，復(fù)灌60 min。60只♂SD大鼠，隨機(jī)分為5組(n=12)：空白組(Control組)、缺血/再灌注組(I/R組)、H2S后處理組(H2S組)、抑制劑LY294002組(LY組)、H2S后處理+ 抑制劑組(H2S+LY組)。統(tǒng)計(jì)平衡末及再灌注末的左室舒張末期壓(LVEDP)、左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓上升最大速率(+dp/dtmax)和左室內(nèi)壓下降最大速率(-dp/dtmax)；TTC法測(cè)定心肌梗死面積；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法檢測(cè)Sirt1和PGC-1α的 mRNA 含量；通過Western blot法檢測(cè)總的Sirt1和PGC-1α 的蛋白表達(dá)水平；免疫組化檢測(cè)Sirt1的細(xì)胞分布情況。結(jié)果各組間的心功能指標(biāo)在平衡末差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。再灌注60 min，H2S組與I/R組相比，心功能的各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善(P<0.05)，心肌梗死面積減少(26.9±4.9)% vs(48.9±5.6)%(P<0.05)；Sirt1和PGC-1α表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)；Sirt1的細(xì)胞核陽性表達(dá)指數(shù)增加(P<0.05)。LY294002逆轉(zhuǎn)了H2S后處理產(chǎn)生的心肌保護(hù)效應(yīng)，使H2S后處理+抑制劑組心功能指標(biāo)、Sirt1和PGC-1α 的表達(dá)及Sirt1的細(xì)胞核陽性表達(dá)指數(shù)降低，心肌梗死面積增加。結(jié)論P(yáng)I3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路參與了H2S后處理對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：缺血/再灌注損傷；硫化氫；后處理；PI3K/Akt；Sirt1；PGC-1α；心臟保護(hù)

越來越多的研究表明，H2S是一種有效的心臟保護(hù)氣體信號(hào)分子,參與許多心血管系統(tǒng)的病理、生理調(diào)節(jié)過程。雖然本課題組前期研究證實(shí)，外源性H2S后處理通過磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶B(phosphatidyqinositol-3 kinase/protein kinase B，PI3K/Akt) 信號(hào)通路保護(hù)大鼠缺血心肌[1-2]，但其下游靶分子仍未完全清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道，Sirt1表達(dá)水平的降低可導(dǎo)致心肌梗死的發(fā)生[3]，激活PI3K/Akt可磷酸化Sirt1，使其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用[4]。然而，PI3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路是否參與了H2S后處理對(duì)大鼠缺血心肌的保護(hù)作用還未見報(bào)到。本研究擬通過使用大鼠離體心臟I/R損傷模型及PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002來探索PI3K/Akt/Sirt1信號(hào)通路在H2S保護(hù)缺血心肌中的作用。

1材料與方法

1.1試劑氯化三苯基四氮唑(TTC)、硫氫化鈉、 LY294002(Sigma, 美國(guó))；鼠抗Sirt1單克隆抗體(ab110304，Abcam)、兔抗PGC-1α多克隆抗體(ab54481，Abcam)；兔抗β-actin多克隆抗體(Bioworld Technology, 美國(guó))、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物公司)及辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG(武漢博士德生物公司)；SDS-PAGE 凝膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(天根生化科技)；逆轉(zhuǎn)錄及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa，日本)。

1.2儀器Langendorff離體心臟灌流裝置、Power Lab八通道生理記錄儀(ADInstrument ，澳大利亞)；Roche實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Light Cycler480Ⅱ，德國(guó))。

1.3大鼠離體心臟I/R模型的制備清潔級(jí)♂SD大鼠60只(8~10周齡，250±30 g)，上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (滬) 2012-0002。腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(80 mg·kg-1)麻醉，肝素鈉500 U·kg-1抗凝。麻醉后迅速打開胸腔取出心臟，置于呈冰水混合物狀態(tài)的95% O2和5% CO2混合氣體飽和的K-H液中，然后經(jīng)主動(dòng)脈逆行插管固定在Langendorff 灌注裝置上。使用37 ℃恒溫加熱的95% O2和5% CO2混合氣體飽和的改良K-H液進(jìn)行常規(guī)恒流灌注(12 mL·min-1)。改良的K-H液成分為(mmol·L-1)：NaCl 118.5、KCl 4.7、CaCl22.5、MgSO41.2、KH2PO41.2、NaHCO324.8、D-Glucose 11、EDTA-2Na 0.125，pH=7.2~7.4。通過左心室內(nèi)自制球囊實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)心臟血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)：左室發(fā)展壓(LVDP)、左室內(nèi)壓上升/下降最大速率(±dp/dtmax)和左室舒張末壓(LVEDP)等。

1.4實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組60 只♂SD大鼠隨機(jī)分為5組(n=12)：① Control組，全心持續(xù)灌注110 min；② I/R組，平衡20 min后，全心停灌30 min，再灌注60 min；③ I/R + NaHS組(H2S組)，全心停灌30 min后，復(fù)灌即刻給予含NaHS 10 μmol·L-1的K-H液15 s，不含NaHS的K-H液15 s，連續(xù)重復(fù)4次[1]，其余處理同I/R組；④ I/R+LY294002組(LY組), 平衡末10 min及復(fù)灌前5 min給予15 μmol·L-1LY294002[8]溶于0.02% DMSO的K-H液，共15 min，其余處理同I/R組；⑤ I/R+NaHS+LY294002組(H2S+LY組),平衡末10 min及復(fù)灌前5 min給予15 μmol·L-1LY294002溶于0.02% DMSO的K-H液，共15 min，同時(shí)復(fù)灌即刻給予含NaHS 10 μmol·L-1的K-H液15 s，不含NaHS的K-H液15 s，重復(fù)4次，其余處理同I/R組。

1.5TTC法測(cè)定心肌梗死面積復(fù)灌末取下大鼠心臟，置于-80 ℃冷凍5~10 min，剔除右心室和右心房后，將心臟橫切成約2~3 mm的薄片(4~6片)，然后浸于37 ℃的1% TTC磷酸緩沖液(pH 7.4)中閉光孵育20 min。終止反應(yīng)后，可見梗死的灰白色心肌以及存活的磚紅色心肌。甲醛固定后，將切片心肌進(jìn)行掃描，采用Image J軟件計(jì)算心肌梗死面積百分比/%=(梗死心肌面積之和/心肌總面積之和)× 100%。

1.6熒光實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)Sirt1和PGC-1α的 mRNA含量取復(fù)灌末置于-80 ℃冰箱保存的心肌組織，按照總RNA提取試劑盒說明書步驟提取總RNA，并以總RNA為模板，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑合成 cDNA。根據(jù)SYBR Green 試劑盒說明書，以cDNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，通過Roche Light Cycler480Ⅱ熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度。根據(jù)Light Cycler480 optical system software(SW1.5.1)提供的CP值，以GAPDH為內(nèi)參，用算術(shù)公式“2-ΔΔCT”對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算后再統(tǒng)計(jì)分析[3]。以檢索Genbank得到的基因序列設(shè)計(jì)引物如下：Sirt1，5′-CACCGAGGAACTACCTGAT-3′(forward),5′-CATCCCAGCCTCCGTTAT-3′(reverse)。PGC-1α， 5′-CCTCCATGCCTGACGGCACC-3′(forward),5′-GAGCTGAGTGTTGGCTGGCG-3′(reverse)。GAPDH，5′-GGA TGGAATTGTGAGGGAGA-3′(forward),5′-GTGGACCT CATGGCCTACAT-3′(reverse)。引物均由上海生工合成。

1.7Western blot 法測(cè)定Sirt1和 PGC-1α的蛋白表達(dá)取適量-80 ℃保存的心肌組織置于冰上，加入預(yù)冷的裂解液，快速制備組織勻漿，4 ℃ 14 000×g離心10 min后取上清。BCA法測(cè)定蛋白濃度后配平，加入5×SDS上樣緩沖液后煮沸。取40 μg總的心肌蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。5%的脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h ，加入TBST稀釋的一抗(Sirt1，1 ∶1 000； PGC-1α，1 ∶1 000；β-actin，1 ∶3 000)，4℃搖床孵育過夜，TBST漂洗后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)，繼續(xù)室溫?fù)u床封閉2 h ，最后采用超敏ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光，用Image J對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.8免疫組化法檢測(cè)Sirt1的細(xì)胞分布心肌組織石蠟切片，按照SABC即用型免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記染色(武漢博士德生物公司)。按標(biāo)準(zhǔn)免疫組化步驟處理石蠟切片。加入PBS稀釋的一抗(Sirt1，1 ∶300)，4 ℃孵育過夜后DAB顯色，鏡下不斷觀察染色程度，終止反應(yīng)后蘇木精染核。每張切片在×400鏡頭下隨機(jī)選取6個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)相應(yīng)視野內(nèi)的Sirt1 陽性細(xì)胞核個(gè)數(shù)，以細(xì)胞核陽性表達(dá)指數(shù)(%)即視野內(nèi)陽性細(xì)胞核個(gè)數(shù)/視野內(nèi)所有心肌細(xì)胞個(gè)數(shù)來反映各組心肌組織中Sirt1的細(xì)胞分布情況 。

GroupBaselineReperfusion30min60minLVEDP/kPaControl0.83±0.181.05±0.191.09±0.20I/R0.85±0.166.06±0.85*6.46±0.75*I/R+NaHS0.84±0.164.38±0.57#4.50±0.76#I/R+LY2940020.85±0.186.46±0.91△6.06±0.91△I/R+LY294002+NaHS0.83±0.185.98±0.89△5.80±0.90△LVDP/kPaControl14.30±0.6513.75±0.5113.49±0.52I/R14.33±0.915.86±1.11*6.13±1.33*I/R+NaHS13.99±0.838.00±1.56#8.32±1.70#I/R+LY29400214.08±0.895.58±1.21△5.61±1.57△I/R+LY294002+NaHS13.82±0.995.84±1.55△5.66±1.47△+dp/dtmax/kPa·s-1Control361±23358±25348±25I/R360±25170±25*155±25*I/R+NaHS341±24208±23#230±27#I/R+LY294002345±26148±27△152±27△I/R+LY294002+NaHS331±26151±25△146±25△-dp/dtmax/kPa·s-1Control-311±24-293±24-290±24I/R-298±23-125±27*-113±29*I/R+NaHS-293±23-161±27#-163±27#I/R+LY294002-297±26-117±26△-112±29△I/R+LY294002+NaHS-316±24-124±28△-128±28△

**P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2結(jié)果

2.1硫氫化鈉后處理對(duì)大鼠各項(xiàng)心功能指標(biāo)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在平衡末各組心功能指標(biāo)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。除Control組外，復(fù)灌30 min 和60 min后，其它4組與平衡末基礎(chǔ)值相比，LVEDP明顯升高(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組 LVEDP 明顯降低(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組LVEDP明顯升高(P<0.05)，LVDP和±dp/dtmax明顯降低(P<0.05)，見Tab 1。

2.2硫氫化鈉后處理對(duì)大鼠缺血心肌梗死面積的影響復(fù)灌末I/R組的心肌梗死面積為(48.9±5.6) %，與Control組梗死面積百分比(16.3±4.1)%相比明顯增加(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組梗死面積百分比減小，為(26.9±4.9)%(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組梗死面積百分比增加為(49.0±5.7)% (P<0.05)，見Fig 1。

Fig 1　Percentage of infract size of myocardium

One representative image of the myocardial infarct size of each group is shown. a: Control; b:I/R; c:I/R +NaHS; d:I/R+LY294002; e: I/R+LY294002+NaHS.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2.3硫氫化鈉后處理對(duì)大鼠缺血心肌Sirt1和PGC-1α mRNA水平的影響實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果見Fig 2A和Fig 2B。I/R組Sirt1、PGC-1α mRNA的表達(dá)水平升高，但與Control組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1、PGC-1α mRNA的表達(dá)水平進(jìn)一步升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組Sirt1、PGC-1α mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

Fig 2　Effects of NaHS on Sirt1 and ±s,n=3)

A and B: The levels of Sirt1 and PGC-1α mRNA were tested using real-time PCR; C and D: The protein levels of Sirt1 and PGC-1α were tested using Western blot.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

2.4硫氫化鈉后處理對(duì)大鼠缺血心肌Sirt1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平的影響Western blot法分析結(jié)果見Fig 2C和Fig 2D。I/R組與Control組相比，Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1 蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組Sirt1蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。PGC-1α在正常心肌組織中表達(dá)量比較低，在I/R組中，PGC-1α蛋白表達(dá)水平升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與I/R組比較，H2S組PGC-1α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與H2S組相比，H2S+LY組PGC-1α蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

2.5硫氫化鈉后處理對(duì)大鼠缺血心肌Sirt1的細(xì)胞分布影響免疫組化法檢測(cè)心肌組織中Sirt1的細(xì)胞分布，見Fig3A、3B。結(jié)果顯示，在Control組中Sirt1主要位于細(xì)胞核中，陽性表達(dá)指數(shù)為(51±4)%，與Control組比較，I/R組Sirt1陽性細(xì)胞核個(gè)數(shù)明顯減少，為(22±3)%(P<0.05)；與I/R組比較，H2S組Sirt1細(xì)胞核陽性表達(dá)指數(shù)增加，為(43±4)%(P<0.05)；與H2S組比較，H2S+LY組Sirt1細(xì)胞核陽性表達(dá)指數(shù)減少，為(25±4)%(P<0.05)。

3討論

Sirt1是尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)依賴的高度保守第三類組蛋白/非組蛋白去乙酰酶抑制劑家族的成員之一，作為敏感的能量感應(yīng)器調(diào)節(jié)著許多重要的代謝和生理過程。本課題組的近期研究表明，PGC-1α參與了H2S后處理對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用[5]。雖然PGC-1α作為Sirt1的直接下游靶分子，可以被Sirt1去乙酰化而激活，發(fā)揮其調(diào)節(jié)線粒體生物合成和能量代謝的重要作用[6]，但是Sirt1是否也參與了H2S的抗心肌缺血作用還尚未知。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Sirt1 在I/R組減少，而在硫化氫后處理組增加，同時(shí)心肌梗死面積減少及心臟整體功能提高，認(rèn)為Sirt1在硫化氫后處理保護(hù)缺血大鼠心肌中起重要作用。這與Wu等[7]近期研究結(jié)果：硫化氫可通過Sirt1途徑減輕氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌凋亡相一致。

Fig 3　Effects of NaHS on location of ±s,n=3)

A:Sirt1 location was examined by IHC(40×).One representative image of each group is shown. a： Control; b:I/R; c:I/R+NaHS; d:I/R+LY294002; e:I/R+LY294002+NaHS. B:The percentage of Sirt1-positive nuclei for each group was quantified.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group;△P<0.05vsI/R+NaHS group

PI3K/Akt是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,在細(xì)胞的生存、凋亡以及增殖等活動(dòng)中發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。季永等[8]研究結(jié)果表明，外源性硫化氫后處理通過PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)線粒體Cx43蛋白，保護(hù)大鼠缺血心肌。有文獻(xiàn)報(bào)道[5]，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激時(shí)，激活PI3K/Akt,磷酸化Sirt1，使其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮作用。為了研究Sirt1在硫化氫后處理中的保護(hù)機(jī)制及H2S是否通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)Sirt1的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)使用PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制劑LY294002，觀察各組心功能指標(biāo)、心肌梗死面積、Sirt1和PGC-1α的表達(dá)水平以及Sirt1的細(xì)胞分布。

研究結(jié)果顯示，離體大鼠心臟經(jīng)過全心缺血30 min，復(fù)灌60 min后，心臟整體功能明顯下降。與I/R組比較，H2S組明顯改善了心臟功能，主要表現(xiàn)為L(zhǎng)VDP和±dp/dtmax均升高，LVEDP降低，心肌梗死面積減少等。在Control組中，Sirt1 的表達(dá)量較高，I/R損傷明顯降低了Sirt1 的表達(dá)量。但在H2S后處理后，與I/R組比較，Sirt1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平及mRNA水平都明顯提高了。而加入PI3K/Akt抑制劑LY294002 后，H2S后處理的缺血心肌改善作用被廢除，Sirt1和PGC-1α蛋白表達(dá)水平及mRNA水平降低，提示PI3K/Akt/Sirt1 參與了H2S后處理對(duì)心肌I/R損傷的保護(hù)作用。

Sirt1幾乎在所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中都有表達(dá)，但其亞細(xì)胞定位卻不盡相同，有的僅在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，有的僅在細(xì)胞核中表達(dá)，還有一些在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)[9-10]。已有研究表明Sirt1是一種可以往返于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的蛋白[11]，而且Sirt1細(xì)胞核轉(zhuǎn)移量對(duì)其發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)功能至關(guān)重要[12]。因此，我們采用了免疫組化的方法檢測(cè)了Sirt1的亞細(xì)胞定位。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Control組中，Sirt1主要位于細(xì)胞核中，I/R損傷降低了Sirt1 的陽性細(xì)胞核指數(shù)。而與I/R組相比，H2S組提高了Sirt1 的陽性細(xì)胞核指數(shù)，提示H2S后處理通過調(diào)節(jié)Sirt1的蛋白表達(dá)量以及增加Sirt1陽性細(xì)胞核指數(shù)，保護(hù)大鼠缺血心肌。但Sirt1發(fā)揮其保護(hù)作用的具體機(jī)制將有待于進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明H2S 后處理通過PI3K/Akt 信號(hào)通路增加Sirt1、PGC-1α的 表達(dá)及Sirt1陽性細(xì)胞核指數(shù)，減輕離體大鼠I /R 損傷。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)研究主要在江南大學(xué)無錫醫(yī)學(xué)院龐慶豐教授、邱麗穎教授實(shí)驗(yàn)室以及醫(yī)學(xué)院綜合實(shí)驗(yàn)平臺(tái)完成，感謝龐慶豐教授和邱麗穎教授給予課題實(shí)驗(yàn)的悉心指導(dǎo)！)

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PI3K/Akt/Sirt1 signaling pathway mediated hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against I/R injury

HU Ming-zhu1,2,ZHOU Bo1,SHENG Qiong2,DU Bin2,CHEN Jun-liang2,PANG Qing-feng2,JI Yong1,2

[1.DeptofAnesthesiology,theAffiliatedHospitalofJiangnanUniversity(Wuxi4thPeople′sHospital),WuxiJiangsu214062,China;2.WuxiMedicalSchool,JiangnanUniversity,WuxiJiangsu214062,China]

Abstract:AimTo explore the role of PI3K/Akt/Sirt1 pathway in cardioprotection of hydrogen sulfide(H2S) postconditioning against ischemia/reperfusion(I/R) injury.MethodsLangendorff perfusion apparatus was used to build an isolated rat myocardial I/R model. Isolated rat hearts were subjected to 30 min global ischemia followed by 60 min reperfusion after 20 min of equilibrium. 60 male SD rats were randomly divided into 5 groups(n=12): control group(Control), ischemia/reperfusion group(I/R), H2S postconditioning group(H2S), inhibitor LY294002 group(LY) and H2S with inhibitor group(H2S+LY). The left ventricular diastolic pressure(LVEDP),the left ventricular developed pressure(LVDP), the maximum rate of increase or decrease of left ventricular pressure(±dp/dtmax) were registered at the end of 20 min equilibrium, 30 and 60 min of reperfusion separately. Triphenyl tetrazolium chloride(TTC) staining was used to determine the myocardial infarct size. The levels of Sirt1 and PGC-1 mRNA were tested using real-time PCR. The expressions of Sirt1and PGC-1α were detected with Western blot analysis. Immunohistochemical method was used to determine the location of Sirt1.ResultsThere were no differences in equilibrium hemodynamics observed between the experimental groups(P>0.05). At the end of reperfusion, compared with I/R group, H2S group had obviously ameliorated functional recovery and significantly decreased the myocardial infarct size(26.9±4.9)% vs(48.9±5.6)%(P<0.05). Meanwhile, the expression of Sirt1 and PGC-1α increased significantly. However,LY294002 reversed the cardioprotective effects provided by hydrogen sulfide postconditioning and reduced the level of Sirt1and PGC-1α, the percentage of Sirt1-positive nuclei.ConclusionPI3K/Akt/Sirt1 signaling pathway mediates the hydrogen sulfide postconditioning-induced protection against I/R injury.

Key words:ischemia/reperfusion; hydrogen sulfide; postconditioning; PI3K/Akt; Sirt1; PGC-1α; cardioprotection

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0268-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.023

作者簡(jiǎn)介：胡明珠(1989-)，女，碩士生，研究方向：重要臟器功能衰竭的機(jī)制及預(yù)防，E-mail :luhehude@163.com；季永(1969-)，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心、 肺、腦功能衰竭的機(jī)制及預(yù)防，通訊作者，E-mail:jiyong6914@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81270126)；無錫市醫(yī)學(xué)管理中心醫(yī)學(xué)科研面上項(xiàng)目(No YGZXM1407)；江蘇省大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No KYLX_1174)

收稿日期:2015-10-26,修回日期:2015-11-28

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.046.html

網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57