Pyrin重組蛋白對肺纖維化大鼠VEGF/VEGFR2/MMP-9 信號通路的影響

安鐘健，金　燕，延光海，齊　鵬，鄭明昱，李良昌，樸紅梅

(1.延邊大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 延吉　133000; 2.延邊大學中醫(yī)學院，吉林 延吉　133002;3. 延邊大學醫(yī)學院解剖學教研室，吉林 延吉　133002)

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Pyrin重組蛋白對肺纖維化大鼠VEGF/VEGFR2/MMP-9 信號通路的影響

安鐘健1，金燕3，延光海2，齊鵬1，鄭明昱2，李良昌3，樸紅梅1

(1.延邊大學附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，吉林 延吉133000; 2.延邊大學中醫(yī)學院，吉林 延吉133002;3. 延邊大學醫(yī)學院解剖學教研室，吉林 延吉133002)

中國圖書分類號：R-332；R322.35；R329.25；R563.13；R977.3；R977.6

摘要:目的探討Pyrin重組蛋白對博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化的影響及其機制是否與VEGF/VEGFR2/MMP-9信號通路有關(guān)。方法60只SD大鼠隨機分為對照組(n=10)、模型組(n=20)、Pyrin重組蛋白組(n=20)、SU5416陽性對照組(n=10)，除對照組外，其余3組均經(jīng)氣道注入博萊霉素5 mg·kg-1建立大鼠肺間質(zhì)纖維化模型; 造模d 2各組予以相應(yīng)藥物進行干預(yù)。于d 14及d 28分兩批進行取材，用HE染色觀察肺泡炎程度、用Masson染色觀察肺纖維化程度，免疫組化及RT-PCR檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白和mRNA表達。結(jié)果d 14及d 28模型組大鼠肺組織，肺泡炎和纖維化程度以及VEGF、VEGFR2、MMP-9蛋白及mRNA表達較對照組明顯增強(P<0.05)；d 14 Pyrin重組蛋白組肺泡炎和纖維化程度以及VEGF、VEGFR2、MMP-9蛋白及mRNA表達較d 14模型組減弱(P<0.05)，d 28 Pyrin重組蛋白組肺泡炎和纖維化程度以及VEGF、VEGFR2、MMP-9蛋白及mRNA表達較d 28模型組減弱(P<0.05)。結(jié)論Pyrin重組蛋白可能通過下調(diào)VEGF/VEGFR2/MMP-9信號通路而發(fā)揮抗肺纖維化作用。

關(guān)鍵詞:Pyrin重組蛋白; 肺纖維化; 血管內(nèi)皮生長因子; 血管內(nèi)皮生長因子受體2; 基質(zhì)金屬蛋白酶-9; 大鼠

肺纖維化是各種不同病因?qū)е碌姆伍g質(zhì)疾病的共同結(jié)局，包括特發(fā)性肺纖維化、塵肺及藥物引起的纖維化等，日久患者因肺結(jié)構(gòu)改變、呼吸衰竭而死亡[1]。近幾年，國內(nèi)外對肺纖維化的發(fā)病機制有較多研究進展，已經(jīng)從最初的“炎癥學說”轉(zhuǎn)移到“損傷修復(fù)學說”為中心，認為肺微血管生成在肺纖維化發(fā)病中具有重要作用。前期研究表明Pyrin重組蛋白明顯減少哮喘模型小鼠氣道重塑和氣道炎癥，而且通過NF-κB信號通路減少肺纖維化的進程[2-3]。肺微血管生成是肺纖維化的重要環(huán)節(jié)，迄今尚未見有Pyrin重組蛋白抗肺纖維化血管生成及相關(guān)信號通路的研究。本實驗通過檢測Pyrin重組蛋白對肺纖維化大鼠VEGF、VEGFR2、MMP-9基因表達影響，探討Pyrin重組蛋白抗肺纖維化血管生成的作用及其作用機制。

1材料

1.1動物♂ SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20) g，清潔級，購自延邊大學實驗動物中心，合格證號SCXK(吉)2011-0007。本研究得到延邊大學醫(yī)學院倫理委員會批準，在整個實驗中遵守《實驗動物管理條例》，做到減輕大鼠痛苦，增加其舒適度。

1.2藥物與試劑Pyrin重組蛋白由日本巖手醫(yī)科大學山內(nèi)廣平教授提供；博萊霉素購自哈爾濱博萊制藥有限公司，用生理鹽水配制成1 g·L-1溶液；VEGF、VEGFR2、MMP-9購自美國Santa Cruz公司；免疫組化試劑盒由長春百奧公司提供。

1.3儀器輪轉(zhuǎn)式切片機(2135型，德國徠卡公司)，真彩色病理顯微圖像分析系統(tǒng)(CH30RF200，中國)，分光光度計(Thermo 公司)，PCR議(Perkin-Elmer Applied Biosystems，美國)，酶聯(lián)免疫檢測儀(RT-2100C，美國),5415D型低溫高速多功能離心機(Eppendorf公司)，凝膠成像系統(tǒng)(Flour Chem公司)，Western blot轉(zhuǎn)膜儀(BioRad公司)。

2方法

2.1模型制備與分組給藥將SD大鼠隨機分成6組：對照組(n=10)、模型組(n=20)、Pyrin重組蛋白組(n=20)、SU5416陽性對照組(n=10)。將大鼠用10%水合氯醛3.5 mL·kg-1腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于手術(shù)板上，頸正中切開，暴露氣管，對照組一次性氣管內(nèi)注入生理鹽水0.2 mL·kg-1，模型組、Pyrin重組蛋白高劑量組、SU5416陽性對照組向氣管內(nèi)一次性注入溶解了博萊霉素(5 mL·kg-1)的生理鹽水0.2 ml，對照組注入等量生理鹽水，然后將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，以使藥液在肺內(nèi)分布均勻。動物清醒后隨意進食、飲水。從造模后d 2起，每日上午氣道內(nèi)注入Pyrin重組蛋白以0.1 mg·kg-1配制成0.2 mL液體，按時間點連續(xù)治療14 d、28 d，持續(xù)到處死動物的前1 天。SU5416以50 mg·kg-1配制成0.2 mL液體，進行腹腔注射。于造模后d 14、28，隨機分兩批用10%水合氯醛3.5 mL·kg-1麻醉，將大鼠仰臥固定，打開胸腔，止血鉗夾閉右側(cè)肺。從左心尖置入針頭，用止血鉗連心室一起夾住，針頭連接50 mL注射器(針頭磨平)，右心耳剪一約2 mm左右切口。向左心室快速勻速灌注生理鹽水100 mL，至肺內(nèi)血液沖洗干凈，肺組織潔白。將灌注液體換為4%多聚甲醛，繼續(xù)灌注100 mL，直至大鼠全身變硬，停止灌注。剪下灌注后的左肺，放入4%多聚甲醛中固定24 h，切取合適大小組織放入包埋盒、流水過夜、常規(guī)脫水、石蠟包埋，連續(xù)組織切片(厚4 μm)，進行HE染色和Masson染色; 右肺迅速剪下，錫紙包裹，放入-80℃保存，行RT-PCR檢測。

2.2肺泡炎癥、肺纖維化程度判斷左肺石蠟切片行常規(guī)HE染色和Masson染色，光鏡下觀察肺組織病理學改變。參照Szapiel等[4]的方法用HE染色評定肺組織肺泡炎癥程度，0分: 無肺組織炎；1分：輕度肺組織炎，炎性細胞浸潤僅限于局部或近胸膜部，面積小于全肺的20%；2分：中度肺組織炎，受累面積占全肺的20%～50%；3分: 重度肺組織炎，受累面積大于50%。Masson染色評定肺組織纖維化程度，0分：無肺纖維化；1分：輕度肺纖維化，受累面積少于全肺20%；2分：中度肺纖維化，受累面積占20%～50%；3分：重度肺纖維化，受累面積大于50%，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂。

2.3免疫組化染色石蠟切片脫蠟, PBS液浸泡，一抗孵育過夜，PBS沖洗，標記二抗，緩沖液沖洗后DAB顯色，自來水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明干燥、封片。胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性反應(yīng)。半定量圖像分析:每張切片隨機取5個視野，400倍光鏡下觀察，利用Media Cybemetics公司圖像分析管理系統(tǒng)對免疫組化實驗結(jié)果進行圖像分析，測定陽性細胞面積， 平均光密度，計算總光密度。

2.4大鼠肺組織VEGF、VEGFR2、MMP-9 mRNA表達① 按照TRIzol試劑說明書步驟嚴格操作，提取右肺組織總RNA，測量RNA樣品純度，OD值1.9～2.2認為有效，測定濃度。② 采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。取2 μL總RNA作為模板，寡核苷酸(oligo-dT)做引物，反應(yīng)體系為20μL，所得混合物25℃退火5 min，42℃延伸1 h，70℃滅活15 min，合成cDNA。③RT-PCR: PCR循環(huán)條件為95℃ 2 min，1個循環(huán)→95℃ 15 s，60℃ 60 s，40個循環(huán)→95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s，1個循環(huán)。為了消除樣本提取、逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)過程中造成的差異，同時進行管家基因β-actin mRNA表達的測定。β-actin前引物5′-TCCCTGGAGAAGAGCTATGAG-3′，后引物5′-TCCATACCCAGGAAGGAAG-3′;VEGF前引物5′-GAGACCCTGGTGGACATCTT-3′，后引物5′-GATCCGCATGATCTGCATAG-3′;VEGR2前引物5′-AAGAGATTTGTTCCGGATGG-3′，后引物5′-CGGCAGATAGCTCAATTTCA-3′；MMP-9前引物5′-GGAGACCTGAGAACC-3′，后引物5′-TCCAATAGGTGATGTYGTCGG-3′。PCR結(jié)束后，分析結(jié)果并統(tǒng)計，用2-△△CT法來決定目的基因在各組的相對表達量。

3結(jié)果

3.1各組大鼠肺組織病理變化光鏡下可見對照組肺泡清晰完整，肺泡隔無增厚，氣管肌層可見膠原沉積，偶有大鼠肺泡間質(zhì)有少量炎細胞浸潤。各造模組可見肺泡塌陷融合，肺泡隔增厚，肺實變呈斑片狀分布，氣管周圍明顯。肺局部可見出血，大小不等的囊性氣腔，氣管周圍及肺間質(zhì)有大量淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、巨噬細胞浸潤，肺泡中有巨噬細胞浸潤。局部可見成纖維灶，氣管及肺泡周圍可見膠原纖維沉積。d 28炎癥細胞浸潤較d 14減輕，但是膠原沉積則加重。HE染色分級:模型組及給藥各組在d 14和d 28肺泡炎程度較對照組嚴重(P<0.05)。d 14及d 28時Pyrin重組蛋白治療組肺泡炎程度較模型組有改善(P<0.05)。d 14時，Pyrin重組蛋白治療組及SU5416陽性對照組較模型組肺泡炎有改善(P<0.05)。每組肺泡炎程度，d 14與d 28比較，未見差異。見Fig 1。Masson 染色分級: 模型組及給藥各組纖維化程度在d 14和d 28均較對照組明顯(P<0.05)。纖維化呈進展趨勢，其中Pyrin重組蛋白組d 14及d 28纖維化程度均較模型組改善(P<0.05)。d 14和d 28各組肺纖維化程度對比差異雖無顯著性(P>0.05)，但可見纖維化有加重趨勢。見Fig 1。統(tǒng)計學分析表明，與模型組同期比較，Pyrin重組蛋白d 14、28肺泡炎癥明顯減輕(P<0.05)，d 14、28纖維化程度亦明顯降低(P<0.05) 。見Tab 1。

Tab 1　Effect of PRP on pulmonary

**P<0.05vsmodel group

3.2肺組織VEGF、VEGFR2、MMP-9免疫組化染色 d 14模型組大鼠肺組織VEGF、VEGFR2、MMP-9表達較d 14對照組增強(P<0.05); d 14 Pyrin重組蛋白治療組和SU5416陽性對照組大鼠肺組織VEGF、VEGFR2、MMP-9表達較d 14模型組減弱(P<0.05)。d 28模型組VEGF、VEGFR2、MMP-9仍維持較高表達水平，與d 28對照組比較明顯增強(P<0.05); d 28 Pyrin重組蛋白治療組和SU5416陽性對照組VEGF、VEGFR2、MMP-9表達水平較d 28模型組減弱(P<0.05)。見Fig 2。

3.3VEGF、VEGFR2、MMP-9 mRNA表達對照組VEGF、VEGFR2、MMP-9 mRNA表達水平穩(wěn)定，其余各組均可見d 28 VEGF、VEGFR2、MMP-9表達水平較d 14組有升高趨勢，但差異無顯著性(P>0.05)。模型組、Pyrin重組蛋白治療組及SU5416陽性對照組VEGF、VEGFR2、MMP-9表達水平較對照組明顯增高(P<0.05)。Pyrin重組蛋白治療組VEGF、VEGFR2、MMP-9表達水平d 14及d 28均較模型組明顯降低(P<0.05)。見Fig 3。

Fig 1　Effect of PRP on inflammation of lung tissues (HE×100)

HE staining:(A: Control group; B: Model group 14 d; C: Model group 28 d; D: Pyrin recombinant protein group 14 d; E: Pyrin recombinant protein group 28 d; F: SU5416 group 28 d)； Masson stain (G: Control group; H: Model group 14 d; I: Model group 28 d; J: Pyrin recombinant protein group 14 d; K: Pyrin recombinant protein group 28 d; L: SU5416 group 28 d).

Fig 2　VEGF,VEGFR2,MMP-9 subunit examined by immunohistochemistry staining (×100)

VEGF staining (A: Control group; B: Model group 14 d; C: Model group 28 d; D: Pyrin recombinant protein group 14 d; E: Pyrin recombinant protein group 28 d; F: SU5416 group 28 d)； VEGFR2 staining (G: Control group; H: Model group 14 d; I: Model group 28 d; J: Pyrin recombinant protein group 14 d; K: Pyrin recombinant protein group 28 d; L: SU5416 group 28 d); MMP-9 staining (M: Control group; N: Model group 14 d; O: Model group 28 d; P: Pyrin recombinant protein group 14 d; Q: Pyrin recombinant protein group 28 d; R: SU5416 group 28 d).

Fig 3　Effect of Pyrin recombinant protein on

A: Control group; B: Model group 14 d; C: Model group 28 d; D: Pyrin recombinant protein group 14 d; E: Pyrin recombinant protein group 28 d; F: SU5416 group 28 d.#P<0.05vscontrol;*P<0.05vsthe same time period of model

4討論

目前的研究認為，異常的血管生成是肺纖維化進展中的重要病理環(huán)節(jié)，血管過度生成與炎性反應(yīng)和纖維化修復(fù)并行。肺纖維化動物模型早期觀察到的肺炎性反應(yīng)時肺血管內(nèi)皮損傷，血管內(nèi)皮細胞增生，由抗黏附、抗凝、舒張表型轉(zhuǎn)換為促黏附、促凝、收縮表型，繼之發(fā)生微血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖, 異常的血管生成是纖維化性修復(fù)、纖維沉積的啟動和推動因素[5]。VEGF信號途徑在新生血管形成中起核心作用, 新生血管形成后為代謝活躍的炎癥細胞提高氧氣和營養(yǎng)供給,同時也為纖維化炎性病灶帶走大量壞死物和代謝廢物，在纖維化過程中發(fā)揮重要作用。VEGF是一種營養(yǎng)因子，促進內(nèi)皮增殖、遷移和存活等，內(nèi)皮細胞在纖維化中具有重要作用。VEGF主要通過與受體結(jié)合發(fā)揮其生理功能，VEGF的受體主要包括VEGFR1、VEGFR2等; 生理狀態(tài)下VEGF的少量表達能維持血管正常狀態(tài)和完整性，病理狀態(tài)下，兩者結(jié)合能夠抑制血管內(nèi)皮細胞的凋亡且促進其增生、遷移及分化，促進血管通透性增加、刺激體內(nèi)新生血管生成。VEGFR為介導(dǎo)血管生成的主要信號傳遞分子，VEGF與VEGFR結(jié)合是血管內(nèi)皮細胞介導(dǎo)血管生成的主要通路[6]。Qu等[7]研究發(fā)現(xiàn)，博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化中VEGF/VEGFR2表達明顯增高，肺泡炎期毛細血管數(shù)目明顯增加，VEGF受體阻斷劑SU5416通過VEGF/VEGFR2信號通路明顯減少小鼠的肺間質(zhì)血管密度以及肺纖維化的進程。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠VEGF及受體VEGFR2的基因表達從d 14到d 28有遞增趨勢。提示氣管內(nèi)給予博萊霉素后存在持續(xù)的炎癥反應(yīng)、血管新生，該過程持續(xù)28 d。Pyrin重組蛋白可以下調(diào)VEGF及VEGFR2基因表達水平，顯示Pyrin重組蛋白通過減少肺泡炎時的異常血管新生而具有抗肺間質(zhì)纖維化作用。MMP-9是參與細胞外基質(zhì)(ECM)降解的重要蛋白酶類,它對肺基膜及其結(jié)構(gòu)支架的完整性、ECM合成與降解平衡的維持起至關(guān)重要的作用, 與肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生肺結(jié)構(gòu)廣泛改建的特發(fā)性肺纖維化中，MMP-9在上皮細胞、肺巨噬細胞、中性粒細胞中表達增強[8]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠MMP-9基因表達水平從d 14到d 28有平穩(wěn)趨勢。提示氣管內(nèi)注入博萊霉素后存在持續(xù)的炎癥反應(yīng)，該過程持續(xù)28 d。Pyrin重組蛋白可以下調(diào)MMP-9基因表達水平，提示Pyrin重組蛋白通過減少ECM而具有抗肺間質(zhì)纖維化作用。研究報道VEGF/VEGFR2通過STAT1上調(diào)MMP-9信號通路，激活慢性淋巴細胞白血病細胞的遷移[10]；酒精攝入通過VEGFR2/MMP-9信號通路可引起腦功能不全和腦部炎癥。表明VEGF/VEGFR2可通過激活MMP-9信號通路在肺纖維化中起到重要的作用。本實驗結(jié)果也顯示，VEGF受體阻斷劑SU5416可抑制MMP-9蛋白的表達，進一步說明在肺纖維化進程中VEGF/VEGFR2可調(diào)控MMP-9信號通路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Pyrin重組蛋白通過VEGF/VEGFR2/MMP-9信號通路，產(chǎn)生抗肺纖維化作用，這些作用機制的揭示為指導(dǎo)臨床用藥提供了可靠的藥理學依據(jù)，但其作用與機制仍有待進一步深入探討。

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Effects of pyrin recombinant protein on VEGF/VEGFR2/MMP-9 signaling pathway in pulmonary fibrosis of rats

AN Zhong-jian1, JIN Yan3, YAN Guang-hai2, QI Peng1, ZHENG Ming-yu2, LI Liang-chang3, PIAO Hong-mei1

(1.DeptofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofYanbianUniversity,YanjiJilin133000,China;2.YanbianUniversityCollegeofTraditionalChineseMedicine,YanjiJilin133002,China;3.DeptofAnatomy,YanbianUniversityCollegeofMedicine,YanjiJilin133002,China)

Abstract:AimTo study the effects of pyrin recombinant protein(PRP) on VEGF/VEGFR2/ MMP-9 signaling pathway in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats. MethodsSixty male Wistar rats were randomly divided into groups of control (n=10), model (n=20), PRP (n=20), and SU5416 (n=10). All the rats, except for those in control group, were established as the model of interstitial pulmonary fibrosis by perfusion of bleomycin (5 mg·kg-1) through tracheal intubation. From the second day after modeling, all rats were intragastrically administered with drugs or saline, according to different groups designed. The rats were sacrificed on the 14th and 28th day, and lung samples were taken out. The pathological changes of interstitial pulmonary fibrosis were observed by HE staining and Masson staining to evaluate the degree of alveolitis and pulmonary fibrosis. Expressions of VEGF, VEGFR2, MMP-9 protein and mRNA were detected by immunohistochemistry and RT-PCR. ResultsOn the 14th and 28th day, the alveolitis, pulmonary fibrosis, expression of VEGF, VEGFR2, MMP-9 and mRNA increased significantly in the model group compared with in the control group(P<0.05), and decreased significantly in PRP group than those in the model group(P<0.05). ConclusionPRP plays a role of anti-pulmonary fibrosis via the down-regulation of VEGF/VEGFR2/MMP-9 signaling pathway.

Key words:pyrin recombinant protein; pulmonary fibrosis; VEGF; VEGFR2; MMP-9; rats

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0234-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.017

作者簡介:安鐘健(1980-),男，碩士生，研究方向：過敏性疾病，E-mail:852078595@qq.com;樸紅梅(1969-)，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：支氣管哮喘與肺間質(zhì)疾病，通訊作者，E-mail: piaohm2000@aliyun.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81260016，30960140，81260665)；吉林省科技廳自然科學基金資助項目(No 201215235)；吉林省科技廳中青年科技創(chuàng)新領(lǐng)軍人才及創(chuàng)新團隊項目(No 20140519013JH)

收稿日期：2015-10-22，修回日期：2015-11-16

網(wǎng)絡(luò)出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.034.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57