蟾蜍靈在體內(nèi)外抑制急性紅白血病細(xì)胞K562增殖及下調(diào)WT1表達(dá)的研究

汪麗佩，李天一，高瑞蘭，杜月光，趙燕娜

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江 杭州　310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州　310006)

?

蟾蜍靈在體內(nèi)外抑制急性紅白血病細(xì)胞K562增殖及下調(diào)WT1表達(dá)的研究

汪麗佩1，李天一1，高瑞蘭2，杜月光1，趙燕娜2

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，浙江 杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液病研究所，浙江 杭州310006)

中國圖書分類號(hào)：R-332；R282.74；R329.24；R329.28；R733.730.22；R979.1

摘要：目的研究蟾蜍靈在體內(nèi)外抗K562細(xì)胞增殖及對(duì)WT1表達(dá)影響。方法半固體集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蟾蜍靈對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)分析蟾蜍靈對(duì)K562細(xì)胞周期的影響，Western blot觀察蟾蜍靈對(duì)WT1表達(dá)作用。通過高致瘤性K562細(xì)胞制備裸鼠皮下荷瘤模型，分組為模型組、蟾蜍靈組及高三尖杉酯堿組，比較各組皮下瘤體積與重量、病理形態(tài)學(xué)改變及WT1蛋白表達(dá)情況。結(jié)果① 半固體集落形成實(shí)驗(yàn)、流式及Western blot結(jié)果顯示，蟾蜍靈能明顯抑制K562細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞在G0/G1期，并下調(diào)其WT1蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性；② 蟾蜍靈組和陽性對(duì)照組裸鼠腫瘤的抑瘤率均明顯高于模型組(P<0.05)，且蟾蜍靈組和陽性對(duì)照組裸鼠皮下瘤重量均明顯低于模型組(P<0.05)；③ 病理切片顯示，蟾蜍靈導(dǎo)致K562皮下瘤組織內(nèi)腫瘤細(xì)胞大量壞死、凋亡，繼發(fā)出血及纖維化等改變；并明顯抑制K562皮下瘤組織中WT1蛋白表達(dá)水平。結(jié)論蟾蜍靈在體外可抑制K562細(xì)胞增殖及阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，并下調(diào)其WT1蛋白表達(dá)，在體內(nèi)可明顯抑制裸鼠K562皮下瘤體積和重量，導(dǎo)致皮下瘤組織壞死、凋亡，并可下調(diào)其WT1蛋白的表達(dá)。

關(guān)鍵詞：蟾蜍靈；WT1；K562；細(xì)胞周期；G0/G1期；皮下瘤

蟾蜍靈(bufalin)作為傳統(tǒng)中藥蟾酥成分中的蟾毒配基之一，在體外能抑制多種腫瘤細(xì)胞生長，并能誘導(dǎo)多種白血病細(xì)胞分化[1]。Numazawa等[2]研究表明，蟾蜍靈以劑量依賴方式抑制白血病細(xì)胞生長，但相關(guān)機(jī)制報(bào)道較少。我們以急性紅白血病細(xì)胞株K562為研究對(duì)象，體內(nèi)外觀察蟾蜍靈單體對(duì)K562細(xì)胞的作用及其對(duì)癌基因WT1蛋白表達(dá)的影響，從而為蟾蜍靈進(jìn)一步應(yīng)用于白血病治療提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑K562細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存。蟾蜍靈、瓊脂粉及細(xì)胞周期試劑盒購自美國Sigma公司，高三尖杉酯堿購自北京協(xié)和藥廠，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，新生牛血清購自杭州四季青生物工程材料研究所，無菌注射用水購自平湖沙普愛思制藥公司，WT1抗體、羊抗兔多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1K562細(xì)胞株培養(yǎng)在37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中用DMEM培養(yǎng)液(含10%新生牛血清)培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2半固體集落形成實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系含30%小牛血清、1×105U·L-1青鏈霉素、300 mg·L-1L-谷氨酰胺及含0.3%瓊脂的IMDM培養(yǎng)基，接種2×106·L-1細(xì)胞。以上體系中分別加入終濃度為0、0.01、0.05、0.1和0.5 μmol·L-1的不同濃度蟾蜍靈，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃、5% CO2飽和濕度下培養(yǎng)5 d，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞組成為1個(gè)集落。以蟾蜍靈濃度為橫坐標(biāo)，集落抑制率為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)10次。集落抑制率/%=(對(duì)照組集落數(shù)-實(shí)驗(yàn)組集落數(shù))/對(duì)照組集落數(shù)×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期各組分別取2×105個(gè)細(xì)胞，冷PBS洗滌1次，離心去上清，加入0.5 mL含PI和RNAase A的DNA染液，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析白血病細(xì)胞DNA含量。以PI熒光強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞數(shù)量為縱坐標(biāo)繪制曲線圖，調(diào)整G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞位置，排除黏連細(xì)胞后，分析目的細(xì)胞DNA表達(dá)情況。使用multicycle 軟件分析，并計(jì)算亞二倍體峰的百分率，同時(shí)計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)。同樣的實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.4Western blot法檢測(cè)K562 細(xì)胞內(nèi)WT1蛋白表達(dá)收集各組細(xì)胞，提取40 μg總蛋白，分別混合上樣緩沖液，100℃加熱5 min后通過10% SDS-PAGE膠分離，并轉(zhuǎn)膜到PVDF膜上，1% BSA封閉后，WT1一抗4℃孵育過夜，二抗孵育2 h后，ECL顯影，以β-actin為內(nèi)參，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5高致瘤性K562細(xì)胞的制備及皮下荷瘤裸鼠模型的建立和分組取5×107/0.2 mL的對(duì)數(shù)生長期K562細(xì)胞懸液注入4~5周齡裸鼠前肢腋下外側(cè)皮下，成瘤2周后處死裸鼠，無菌條件下取瘤塊，杵狀玻璃勻漿器勻碎瘤組織，并用100目孔徑的不銹鋼網(wǎng)過濾后，制成單細(xì)胞懸液，接種于100 mL培養(yǎng)瓶，傳代10~15代，即獲得高致瘤性K562細(xì)胞。將處于對(duì)數(shù)生長期的高致瘤K562細(xì)胞1×107/0.2 mL接種于4~5周齡免疫缺陷裸鼠前肢腋下外側(cè)皮下，并隨機(jī)分成3組，每組10只：① 模型組用生理鹽水0.2 mL·d-1灌胃21 d；② 蟾蜍靈組1.5 mg·kg-1·d-1灌胃21 d；③ 陽性對(duì)照組高三尖杉酯堿(Hom)1 mg·kg-1·d-1腹腔注射治療3 d。

1.2.6皮下瘤體積與重量檢測(cè)治療21 d，頸椎脫臼法處死裸鼠，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組裸鼠瘤體最長徑(a)、最短徑(b)并稱重，得到裸鼠皮下瘤體積V(mm3)=ab2/2，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率計(jì)算公式：抑瘤率/%=(1-治療組瘤體體積/對(duì)照組瘤體體積)×100%。

1.2.7腫瘤組織切片及HE染色各組裸鼠處死取瘤組織，固定后包埋、切片，進(jìn)行HE染色，并在顯微鏡下觀察瘤組織病理情況。

1.2.8免疫組化法檢測(cè)腫瘤組織中WT1蛋白表達(dá)情況取上述病理石蠟切片，用1 ∶500稀釋的WT1一抗及Envision加強(qiáng)型二抗工作液孵育后，DAB顯色，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性顯色，并用蘇木精復(fù)染，光學(xué)顯微鏡下觀察記錄結(jié)果。

2結(jié)果

2.1蟾蜍靈抑制K562細(xì)胞集落生成處理K562細(xì)胞5 d后，蟾蜍靈0、0.01、0.05、0.1和0.5 μmol·L-1處理后的增殖抑制率分別為0、(21.31±2.53)%、(59.28±4.21)%、(70.53±5.10)%及(81.52±6.18)%，提示隨著蟾蜍靈劑量增加，K562細(xì)胞集落生成數(shù)量明顯降低(P<0.05)，呈劑量依賴性(Fig 1)。

Fig 1　Bufalin inhibits colon number of K562 cell

**P<0.05vsthe untreated control

2.2蟾蜍靈阻滯K562細(xì)胞周期隨著蟾蜍靈藥物濃度增加，K562細(xì)胞處于G0/G1期的比例從(32.53±0.31)%逐漸升高到(58.97±2.61)%，而S期的比例則從(51.46±0.27)%逐漸降低到(30.72±1.53)%，K562細(xì)胞增殖指數(shù)從(62.27±0.51)%明顯下降到(40.61±2.01)%(P<0.05，P<0.01)，提示蟾蜍靈能夠有效地阻滯K562細(xì)胞進(jìn)入增殖周期S期，而停滯于G0/G1期(Tab 1、Fig 2)。

2.3蟾蜍靈抑制K562細(xì)胞中WT1表達(dá)K562細(xì)胞經(jīng)不同濃度蟾蜍靈處理5 d后，Western blot結(jié)果顯示，隨著蟾蜍靈劑量增加，K562細(xì)胞中WT1蛋白表達(dá)明顯下降，呈劑量依賴性(Fig 3)。

2.4蟾蜍靈在裸鼠體內(nèi)抑制K562皮下瘤重量和體積裸鼠接種K562細(xì)胞株后，皮下成瘤時(shí)間平均為5~10 d，移植后d 10所有裸鼠瘤塊都明顯可見，達(dá)到成瘤標(biāo)準(zhǔn)，d 21時(shí)處死裸鼠并取皮下瘤，游標(biāo)卡尺測(cè)量瘤體體積及稱重。結(jié)果顯示，蟾蜍靈組和陽性對(duì)照組裸鼠皮下瘤重量和體積均明顯低于模型組(P<0.05)，其抑瘤率則明顯高于模型組(Tab 2)。

Tab 1　Effects of bufalin on K562 cell ±s，n=5)

**P<0.05，**P<0.01vsthe untreated control

Fig 2Bufalin arrests cell cycle of

K562 cell(n=5)

A:0 μmol·L-1bufalin; B: 0.01 μmol·L-1bufalin; C：0.05 μmol·L-1bufalin; D：0.1 μmol·L-1bufalin; E：0.5 μmol·L-1bufalin

Fig 3　Expression of WT1 in K562 cells analyzed by Western blot

Tab 2　Effect of bufalin on nude mice

**P<0.05，**P<0.01vsmodel group

2.5蟾蜍靈誘導(dǎo)裸鼠皮下瘤壞死凋亡病理切片觀察各組裸鼠皮下瘤組織，低倍鏡及高倍鏡下均可見模型組瘤組織白血病細(xì)胞密集，數(shù)量多且生長旺盛，細(xì)胞異型性明顯，細(xì)胞核體積大，染色細(xì)膩，核質(zhì)比明顯增加，并常見病理性核分裂像；蟾蜍靈組皮下瘤組織中出現(xiàn)不同程度的細(xì)胞壞死或凋亡，其中核固縮、核碎裂及核溶解現(xiàn)象明顯，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，并伴隨出血、間質(zhì)纖維化等改變；而陽性對(duì)照組皮下瘤組織亦發(fā)生了變性和壞死現(xiàn)象，與蟾蜍靈組相類似(Fig 4、5)。

2.6蟾蜍靈下調(diào)裸鼠皮下瘤組織中WT1蛋白表達(dá)各組裸鼠皮下瘤組織切片通過免疫組化染色，觀察瘤組織中WT1蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，模型組瘤組織WT1蛋白表達(dá)呈強(qiáng)陽性，鏡下顯示所有腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)密集大量棕黃色陽性物質(zhì)，瘤細(xì)胞均出現(xiàn)強(qiáng)陽性反應(yīng)“”，提示W(wǎng)T1蛋白在模型組中呈高表達(dá)狀態(tài)；蟾蜍靈組皮下瘤組織在鏡下可見腫瘤細(xì)胞內(nèi)WT1蛋白陽性表達(dá)率降低，數(shù)量明顯減少，其胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒樣物質(zhì)亦減少，而腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡現(xiàn)象多見，呈現(xiàn)弱陽性“+”，提示W(wǎng)T1蛋白在蟾蜍靈組皮下瘤組織中表達(dá)明顯降低；陽性對(duì)照組皮下瘤組織在鏡下可見大多數(shù)腫瘤細(xì)胞壞死、凋亡，細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清，WT1蛋白陽性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞少見，腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)少見棕黃色顆粒，大多數(shù)細(xì)胞WT1表達(dá)水平很低，為“±”，提示高三尖杉酯堿亦可下調(diào)WT1蛋白的表達(dá)(Fig 6、7)。

3討論

白血病作為一種臨床常見惡性腫瘤，占所有惡性腫瘤總發(fā)病率的5%左右，隨著環(huán)境污染等原因，近年來發(fā)病率不斷攀升[3]。現(xiàn)階段白血病尤其是急性白血病的治療仍以化療為主，但是當(dāng)前臨床常用的化療藥物存在不同程度毒副作用，例如目前常用的高三尖杉酯堿對(duì)緩解及治療白血病效果明顯，但其對(duì)心血管系統(tǒng)尤其是心肌的毒性作用仍不容忽視[4]。中藥治療腫瘤因其生物活性廣泛、作用緩和，并具有提高機(jī)體免疫力、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌功能、不易導(dǎo)致耐藥及骨髓抑制，且服用方便經(jīng)濟(jì)等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，日益引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[5]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蟾蜍靈在體內(nèi)外均可明顯抑制白血病細(xì)胞K562增殖，并可下調(diào)白血病特異性癌基因WT1蛋白表達(dá)，效果與化療藥物相當(dāng)。

Fig 4　Effect of bufalin on morphology of K562 subcutaneous tumor in nude mice(100×)

Fig 5　Effect of bufalin on morphology of K562 subcutaneous tumor in nude mice(400×)

Fig 6　Expressions of WT1 in K562 subcutaneous tumor of nude mice detected by cell immunochemistry(100×)

Fig 7　Expressions of WT1 in K562 subcutaneous tumor of nude mice detected by cell immunochemistry(400×)

WT1基因作為一種參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的雙相調(diào)節(jié)子，是細(xì)胞生長、發(fā)育過程中的重要調(diào)控分子，因發(fā)現(xiàn)最初可導(dǎo)致兒童腎母細(xì)胞瘤(Wilms′tumor-1)而得名[6]。近年來，在白血病細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)WT1基因參與造血調(diào)控，與多種造血生長因子相互作用調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄速度，進(jìn)而參與造血細(xì)胞增殖、分化、凋亡等各個(gè)過程。正常人外周血細(xì)胞中WT1基因表達(dá)很低或無表達(dá)，而在多種白血病細(xì)胞株及約80%左右白血病患者中，該基因存在過度表達(dá)現(xiàn)象，發(fā)揮著癌基因的作用。如將這些白血病患者按照FAB分型，則其中分化類型較好的患者外周血中WT1基因表達(dá)陽性率明顯低于分化類型相對(duì)較差的患者，且隨著病情的惡化其表達(dá)相應(yīng)逐漸增高，與預(yù)后不良正相關(guān)。因此，臨床上可用于白血病預(yù)后的判斷和微小殘留白血病(minimal residual disease, MRD)的監(jiān)測(cè)[7]，未來可能成為白血病基因治療和特異性免疫治療的新靶點(diǎn)。有研究顯示，在體外抑制白血病細(xì)胞增殖的同時(shí)，?？沙霈F(xiàn)WT1基因表達(dá)下降[8]，推測(cè)通過下調(diào)WT1表達(dá)可能抑制白血病細(xì)胞增殖并阻滯其細(xì)胞周期，與本文得到結(jié)果一致，但其中具體分子機(jī)制不詳，仍有待后續(xù)的進(jìn)一步研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)工作主要在浙江省中西醫(yī)結(jié)合血液病研究所、國家中醫(yī)藥管理局“血液細(xì)胞分子生物學(xué)”三級(jí)實(shí)驗(yàn)室及浙江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)研究所的大力支持下完成，在此予以感謝！)

參考文獻(xiàn):

[1]Zhang L, Nakaya K, Yoshida T, et al. Induction of bufalin of differentiation of human leukemia cells HL-60, U937, and ML1 toward macrophage/monocyte-like cells and its potent synergistic effect on the differentiation of human leukemia cells in combination with other inducers[J].CancerRes, 1992,52: 4634-42.

[2]Numazawa S, Honma Y, Yamamoto T, et al. A cardiotonic steroid bufalin-like factor in human plasma induces leukemia cell differentiation[J].LeukRes, 1995, 19(12): 945-53.

[3]Krille L, Dreger S, Schindel R, et al. Risk of cancer incidence before the age of 15 years after exposure to ionising radiation from computed tomography: results from a German cohort study[J].RadiatEnvironBiophys, 2015, 54(1):1-12.

[4]劉志剛. 高三尖杉酯堿聯(lián)合方案治療高白細(xì)胞慢性粒細(xì)胞白血病療效分析[J]. 華西醫(yī)學(xué), 2010, 25(8): 2421-2.

[4]Liu Z G. Curative effect of homoharringtonine united program on patients with chronic myelocytic leukemia[J].WestChinaMedJ, 2010, 25(8): 2421-2.

[5]趙燕娜，高瑞蘭，汪麗佩，等. 白藜蘆醇對(duì)K562白血病細(xì)胞抑制增殖和誘導(dǎo)分化的作用[J].中國藥理學(xué)通報(bào), 2014, 30(6): 853-6.

[5]Zhao Y N, Gao R L, Wang L P, et al. Effect of resveratrol on proliferation and differentiation in K562 cells[J].ChinPharmacolBull, 2014, 30(6): 853-6.

[6]Tian F, Yourek G, Shi X, et al. The development of Wilms tumor: from WT1 and microRNA to animal models[J].BiochimBiophysActa, 2014, 1846(1):180-7.

[7]Steinbach D, Bader P, Willasch A, et al. Prospective validation of a new method of monitoring minimal residual disease in childhood acute myeloid leukemia[J].ClinCancerRes, 2015, 21(6):1353-9.

[8]Li Y, Wang J, Li X, et al. Role of the Wilms' tumor 1 gene in the aberrant biological behavior of leukemic cells and the related mechanisms[J].OncolRep, 2014, 32(6):2680-6.

Bufalin inhibits proliferation and downregulates expression of WT1 in K562 cellsinvivoandvitro

WANG Li-pei1, LI Tian-yi1, GAO Rui-lan2, DU Yue-guang1, ZHAO Yan-na2

(1.DeptofPathology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310053,China;2.ResearchInstituteofHematology,theFirstAffiliatedHospital,ZhejiangChineseMedicalUniversity,Hangzhou310006,China)

Abstract:AimTo investigate the effect of bufalin on proliferation and expression of WT1 in K562 cells.MethodsThe colony number of K562 cell was detected with semi-solid culture assay. The cell cycle was measured by flowcytometry, and the expression of WT1 was observed with immunocytochemistry. Subcutaneous tumor models established by K562 cells in BALB/C nu/nu mice were divided into three groups, including model group, bufalin group and positive control group. After 21 days, the subcutaneous tumors were removed for calculating the inhibitory rate of tumor growth. HE staining and immunohistochemistry were used to observe the morphological changes and the expression of WT1.Results① Bufalin could significantly decrease the colony number of K562 cell, arrest it at G0/G1phase and down-regulate its expression of WT1 in a dose-dependent manner. ② Compared with the model group, the tumor inhibitory rate was much higher, while the volume and the weight were obviously lower in the other two groups. ③ Bufalin could induce apoptosis, necrosis, hemorrhage and fibrosis with HE staining, and down-regulate the expression of WT1.ConclusionBufalin could inhibit the proliferation, arrest the cell cycle at G0/G1phase and down-regulate the expression of WT1 in vitro. Bufalin could inhibit the tumor inhibitory rate, the volume and the weight of the subcutaneous tumors, induce apoptosis, necrosis, hemorrhage and fibrosis with HE staining and down-regulate the expression of WT1.

Key words:bufalin; WT1; K562; cell cycle; G0/G1phase; subcutaneous tumor

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0229-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.016

作者簡介：汪麗佩(1983-)，女，博士，講師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療血液病，E-mail:wanglipei@gmail.com；趙燕娜(1984-)，女，碩士，助理研究員，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療血液病，通訊作者，E-mail:zyn77@126.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81403223)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No LQ14H290003)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科技計(jì)劃項(xiàng)目(No 2014KYA151)

收稿日期:2015-10-26,修回日期:2015-11-30

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.032.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57