EGFR siRNA通過(guò)阻礙STAT3磷酸化抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

錢(qián)　紅, 劉理靜, 李艷春，謝　明，武　衡，劉雙喜，武　斌

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化　418000；2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化　418000；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng)　421001；4. 懷化市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化　418000)

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EGFR siRNA通過(guò)阻礙STAT3磷酸化抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化

錢(qián)紅1,2, 劉理靜1, 李艷春2，謝明3，武衡3，劉雙喜4，武斌4

(1. 湖南醫(yī)藥學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，湖南 懷化418000；2. 湖南醫(yī)藥學(xué)院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化418000；3. 南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng)421001；4. 懷化市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 懷化418000)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R-332；R329.24；R392.11；R743.340.22；R977.6

摘要:目的探討表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)在腦出血后血腫周圍腦組織中的表達(dá)，及其對(duì)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響與分子機(jī)制。方法收集臨床腦出血后實(shí)施血腫清除術(shù)的血腫周圍腦組織標(biāo)本，根據(jù)腦出血距離標(biāo)本取出時(shí)間，分為<1 d組、1~5 d組、6~10 d組及>10 d組，每組20例，同時(shí)取20例手術(shù)過(guò)程中血腫遠(yuǎn)隔部位掉落的組織塊作為對(duì)照組，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色及Western blot測(cè)定EGFR表達(dá)。分離培養(yǎng)大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，分別給予培養(yǎng)液(對(duì)照組)、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF，用于活化星形膠質(zhì)細(xì)胞)、Scramble siRNA+CNTF、EGFR siRNA+CNTF處理24 h，熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)mRNA表達(dá)，并采用Western blot分析GFAP、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(STAT3)、磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白表達(dá)。結(jié)果隨著腦出血時(shí)間的延長(zhǎng)，EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)及蛋白表達(dá)水平逐漸升高，6~10 d達(dá)到高峰，10 d后仍處于較高水平，兩兩比較差異均有顯著性(P<0.01)。CNTF單獨(dú)處理明顯增加GFAP mRNA與蛋白、p-STAT3表達(dá)水平，與對(duì)照組相比，差異有顯著性(P<0.01)，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染幾乎完全逆轉(zhuǎn)CNTF誘導(dǎo)的上述變化(P<0.01)，但各組STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)區(qū)別(P>0.05)。結(jié)論 EGFR在腦出血后血腫周圍腦組織中表達(dá)升高，EGFR基因沉默有助于抑制大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，其機(jī)制可能與阻礙STAT3磷酸化有關(guān)。

關(guān)鍵詞:星形膠質(zhì)細(xì)胞；腦出血；表皮生長(zhǎng)因子受體；小干擾RNA；神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白；信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3

星形膠質(zhì)細(xì)胞活化是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后最重要的表型之一，這些活化的細(xì)胞雖然能通過(guò)釋放神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，有利于神經(jīng)損傷的修復(fù)，但同時(shí)促進(jìn)膠質(zhì)瘢痕的形成。膠質(zhì)瘢痕是軸突再生的主要物理屏障，并分泌大量細(xì)胞毒因子、炎癥因子、補(bǔ)體蛋白而損害神經(jīng)元[1]。因此，采取有效的方式抑制腦損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度活化，對(duì)于促進(jìn)腦損傷后恢復(fù)有重要意義。表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一種跨膜蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷(外傷、中風(fēng)、腫瘤)或神經(jīng)系統(tǒng)變性(阿爾茨海默病、帕金森病)等情況下，EGFR表達(dá)迅速上調(diào)，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色分析，EGFR陽(yáng)性細(xì)胞大多是反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，并長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)存在[2]。此外，我們的前期研究表明， EGFR抑制劑染料木黃酮可阻滯大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[3]。這些研究提示，EGFR可能在觸發(fā)星形膠質(zhì)細(xì)胞由靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)中起關(guān)鍵作用。然而，EGFR調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的分子機(jī)制仍不清楚。為此，本研究首先分析EGFR在腦出血后不同時(shí)期血腫周圍腦組織中的表達(dá)特征，然后以EGFR siRNA轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，探討EGFR基因沉默對(duì)細(xì)胞神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、信號(hào)傳導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活物3(signal transducers and activators of transcription 3, STAT3)、磷酸化STAT3(phosphorylated STAT3, p-STAT3)表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑出生后24 h以內(nèi)的新生Wistar大鼠[SPF級(jí)，合格證號(hào)：SYKK(湘)2010-0006]購(gòu)于南華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部。免疫組化SABC試劑盒(批號(hào)：SA1020)系武漢博士德公司產(chǎn)品。新生胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：8114057)購(gòu)于Gibco公司。睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)購(gòu)于北京盛科博源生物公司(批號(hào)：22582)。TRIzol試劑(批號(hào)：10606ES60)、PVDF膜(批號(hào)：21457)由美國(guó)Invitrogen公司提供。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：TB099)、PCR擴(kuò)增試劑盒(批號(hào)：SK2491-50)分別購(gòu)于美國(guó)Promega公司、上海生工生物工程公司。兔抗人EGFR(批號(hào)：sc-3784)、β-actin(批號(hào)：sc-1618)單克隆抗體以及兔抗大鼠GFAP(批號(hào)：sc-21364)、STAT3(批號(hào)：sc-9132)、p-STAT3(批號(hào)：sc-8059)、EGFR(批號(hào)：sc-3782)、β-actin(批號(hào)：sc-1616)單克隆抗體和山羊抗兔 IgG(批號(hào)：sc-33106)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公司。

1.2臨床標(biāo)本收集選擇南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2011年1月至2014年12月行開(kāi)顱經(jīng)顳葉入路血腫清除手術(shù)治療的80例基底節(jié)腦出血患者為研究對(duì)象，均經(jīng)CT或者M(jìn)RI確診，根據(jù)標(biāo)本取出距離腦出血時(shí)間分為4組：<1 d組、1~5 d組、6~10 d組及>10 d組，每組20例。在<1 d組中，男12例，女8例，年齡49~72歲，平均(62.17±10.65)歲，出血量40~81 mL，平均(59.37±11.85) mL；1~5 d組中，男11例，女9例，年齡53~76歲，平均(64.55±11.38)歲，出血量45~80 mL，平均(61.49±12.36) mL；6~10 d組中，男9例，女11例，年齡52~75歲，平均(63.18±12.54)歲，出血量42~83 mL，平均(60.59±10.33) mL；>10 d組，男13例，女7例，年齡54~78歲，平均(64.26±13.88)歲，出血量44~79 mL，平均(62.11±11.54) mL。每個(gè)病例于手術(shù)過(guò)程中取少量距血腫包膜1cm左右腦組織作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。同時(shí)，手術(shù)中將部分患者皮層“造瘺”起始處(血腫遠(yuǎn)隔部位)掉落的組織塊作為對(duì)照組標(biāo)本，共20例，其中男12例，女性8例，年齡52~78歲，平均(63.75±13.04)歲，出血量43~80 mL，平均(61.75±11.87) mL。各組性別、年齡及出血量等方面比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，而且家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.3免疫組織化學(xué)染色取腦組織標(biāo)本，10%中性甲醛固定后，石蠟包理，5 μm連續(xù)切片，采用免疫組化SABC法檢測(cè)各組腦組織中EGFR表達(dá)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)由專人進(jìn)行統(tǒng)一操作，用PBS代替一抗作為空白對(duì)照。在PIPS-2020圖像分析儀(重慶天海公司)上，每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)高倍視野, 測(cè)定一定面積內(nèi)陽(yáng)性信號(hào)面積和陽(yáng)性信號(hào)平均灰度值，計(jì)算陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)，作為EGFR表達(dá)水平。陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)/%=陽(yáng)性信號(hào)面積×陽(yáng)性信號(hào)平均灰度值/測(cè)定面積×100%。

1.4大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)取出生后24 h以內(nèi)的新生Wistar大鼠10只，消毒固定，用斷頭法取其頭部，取出大腦，剝?nèi)ボ浤X膜后，分離出大腦皮層組織。將大腦皮層剪碎，用 0.125%的胰酶消化30 min，加入新生胎牛血清終止消化，1 000 r·min-1離心5 min，將上層含酶液小心吸出，加入DMEM培養(yǎng)液，100目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，再加入適量新生胎牛血清，調(diào)整細(xì)胞懸液的密度至(3~5)×108·L-1，種植于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔3~4 d換培養(yǎng)液1次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)成致密單層后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，即得到純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞。

1.5EGFR基因沉默取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞，接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板，加入DMEM培養(yǎng)液后，進(jìn)行EGFR siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。將4 μL的LipofectamineTMRNAiMAX 與5 μL 20 μmol·L-1siRNA分別加入100 μL Opti-MEM中，靜置5 min后，將上述兩種溶液混合，再靜置20 min，隨后把混合液加入培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，混勻，孵育48 h，采用Western blot檢測(cè)EGFR siRNA的干擾效率。EGFR siRNA及Scramble siRNA核苷酸序列均由上海吉瑪公司合成，其中EGFR siRNA正義鏈為：5′-CCUUAGCAGUCUUAUCUAATDT-3′，反義鏈為：5′-dTdTGGAAUCGUCAGAAUAGAUU-3′；Scramble siRNA正義鏈為：5′-UUCUCCGAACGUGUC ACGU-3′，反義鏈為：5′-ACGUGACACGUUCGGAG AA-3′。

1.6實(shí)驗(yàn)分組與處理將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照組、CNTF組、 Scramble siRNA+CNTF組及EGFR siRNA+CNTF組，對(duì)照組僅給予DMEM培養(yǎng)液處理24 h，CNTF組用加入20 μg·L-1CNTF的DMEM培養(yǎng)液培育24 h，后2組分別給予Scramble siRNA、EGFR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用含20 μg·L-1CNTF的DMEM培養(yǎng)液處理24 h。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。

1.7熒光實(shí)時(shí)定量PCR細(xì)胞處理完成后，收集足夠的細(xì)胞，利用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，并溶解于無(wú)RNase的水中，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定每個(gè)樣本總RNA 的OD260/OD280，其比值均在1.8~2.0之間，符合實(shí)驗(yàn)要求。取2 μg總RNA，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的方法合成cDNA。參照文獻(xiàn)[3]由上海生工生物工程公司合成GFAP與磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH)引物。GFAP引物序列：5′-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3′，5′-TTCGCCCTCCGCAATTT C-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度274 bp；GAPDH引物序列：5′-GGAGCCAAACGGGTCATCATCTC-3′，5′-ATGCCTGC TTCACCACCACCTTG -3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度454 bp。然后取10 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在Roach480實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，61℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，總共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min。用ΔΔCt值法，以GAPDH表達(dá)水平作為內(nèi)參照定量GFAP mRNA表達(dá)。

1.8Western blot常規(guī)制備SDS-PAGE膠，采用三去污裂解液將腦組織及處理后的細(xì)胞(細(xì)胞數(shù)量充足)勻漿，吸出上清液，將20 μg蛋白質(zhì)樣品上樣，在70 V電壓下電泳1.5 h，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，以50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉后，分別加入1 ∶500稀釋的兔抗人EGFR、β-actin或兔抗大鼠EGFR、GFAP、STAT3、p-STAT3、β-actin一抗，在低溫條件下(4℃)孵育過(guò)夜，添加1 ∶2 500稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(二抗)室溫孵育，ECL顯色，暗室曝光。利用Labwork凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)膠片掃描，分析各產(chǎn)物積分光密度值，計(jì)算EGFR、GFAP、STAT3、p-STAT3相對(duì)量。目標(biāo)蛋白表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白積分光密度值/β-actin積分光密度值.

2結(jié)果

2.1EGFR在腦出血后血腫周圍腦組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色顯示(Fig1)，EGFR陽(yáng)性顆粒呈棕黃色，以胞質(zhì)多見(jiàn)，大量分布于腦出血后血腫周圍腦組織中，主要位于膠質(zhì)細(xì)胞，少數(shù)為神經(jīng)細(xì)胞?；叶葤呙枧c半定量分析結(jié)果表明(Fig2)，5組腦組織EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)比較，差異有顯著性(F=20.15,P<0.01)，其中腦出血后不同時(shí)期血腫周圍腦組織EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.01)；與<1d組比較，1~5d組、6~10d組及>10 d組EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)明顯升高(P<0.01)；與1~5 d 組比較，6~10 d組、>10 d組EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)增加(P<0.01)；6~10 d組EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)亦高于>10 d組(P<0.01)。此外，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，5組腦組織EGFR蛋白表達(dá)水平的差異有顯著性(F=23.68,P<0.01)，其變化趨勢(shì)與陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)相似，見(jiàn)Fig 3。

Fig 1　EGFR immunohistostaining of cerebral tissues around

A: Control group; B:<1 d group; C: 1~5 d group; D: 6~10 d group; E: >10 d group

Fig 2　Comparison of EGFR positive signal index in cerebral

***P<0.01vscontrol;##P<0.01vs<1 d;△△P<0.01vs1~5 d;▲▲P<0.01vs>10 d

Fig 3　Expression of EGFR protein in cerebral tissues

A: Control group; B: <1 d group; C: 1~5 d group; D: 6~10 d group; E: >10 d group.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vs<1 d;△△P<0.01vs1~5 d;▲▲P<0.01vs>10 d

2.2RNA干擾沉默EGFR基因后其蛋白的表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于涂有多聚賴氨酸蓋玻片的24孔板，并加入 DMEM 培養(yǎng)液進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。Western blot檢測(cè)顯示，EGFR siRNA抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平達(dá)80%(Fig 4)，表明EGFR siRNA對(duì)EGFR基因的沉默效果較好，符合本實(shí)驗(yàn)要求。

Fig 4　Expression of EGFR protein in astrocytes among groups

A: Control group; B: Scramble siRNA group; C: EGFR siRNA group

2.3EGFR siRNA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的標(biāo)記物，為了探討EGFR對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響，給予CNTF和(或)siRNA處理細(xì)胞后，通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞GFAP mRNA、蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示(Fig 5、6)，4組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平比較，差異有顯著性(F=24.37、28.69，P<0.01)，其中對(duì)照組GFAP mRNA與蛋白呈低水平表達(dá)，CNTF組、Scramble siRNA+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.01)；與CNTF組、Scramble siRNA+CNTF組比較，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.01)，但EGFR siRNA+CNTF組GFAP mRNA與蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比，無(wú)明顯改變(P>0.05)。此外，Scramble siRNA+CNTF組上述指標(biāo)與CNTF組無(wú)區(qū)別(P>0.05)，這些結(jié)果表明EGFR基因沉默可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

Fig 5　Expression of GFAP mRNA in astrocytes

A: Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

Fig 6　Expression of GFAP protein in astrocytes

A: Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

2.4EGFR siRNA對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞STAT3磷酸化的影響STAT3磷酸化(即活化形式)可以誘導(dǎo)GFAP基因轉(zhuǎn)錄，為了初步明確EGFR siRNA抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的機(jī)制，利用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞p-STAT3、STAT3蛋白表達(dá)(Fig 7)，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞p-STAT3表達(dá)水平的差異有顯著性(F=25.39,P<0.01)，其中CNTF組、Scramble siRNA+CNTF組p-STAT3表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.01)，給予EGFR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，p-STAT3表達(dá)水平明顯降低，與CNTF組、Scramble siRNA+CNTF組比較，差異有顯著性(P<0.01)，但與對(duì)照組相比，變化不明顯(P>0.05)；Scramble siRNA+CNTF組p-STAT3表達(dá)水平與CNTF組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；此外，各組STAT3蛋白表達(dá)水平無(wú)區(qū)別(F=3.24,P>0.05)，提示EGFR基因沉默對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用可能與其阻滯STAT3磷酸化有關(guān)。

3討論

腦出血具有高發(fā)病率、致死率、致殘率，目前已成為威脅人類健康與生活質(zhì)量的重大疾病之一。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，當(dāng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用。在損傷早期，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)缺血、缺氧的耐受性，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)作用，促進(jìn)其存活；但另一方面，星形膠質(zhì)細(xì)胞可釋放多種損傷因子，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，并且過(guò)度增生的星形膠質(zhì)細(xì)胞是膠質(zhì)瘢痕中的主要成分，可阻礙神經(jīng)再生及軸突的形成[4]。大量研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的毒性作用超過(guò)其對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，被認(rèn)為是導(dǎo)致腦出血后繼發(fā)性損傷的重要原因[5-6]。然而，通過(guò)白藜蘆醇、孕酮抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的異?；罨?，可明顯減少神經(jīng)元損傷[7-8]。腦損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化呈現(xiàn)出動(dòng)態(tài)變化的規(guī)律，與神經(jīng)元的受損程度基本同步，一般在腦損傷后數(shù)h~1d即可在損傷周圍出現(xiàn)胞體肥大、突起增粗的活化星形膠質(zhì)細(xì)胞，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，死亡神經(jīng)元數(shù)目增多，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目也逐漸增多，在7~15 d達(dá)到高峰[9]。EGFR廣泛表達(dá)于上皮、間質(zhì)及神經(jīng)組織，在調(diào)控細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。本研究結(jié)果表明，隨著腦出血時(shí)間的延長(zhǎng)，EGFR陽(yáng)性信號(hào)指數(shù)及蛋白表達(dá)水平逐漸升高，6~10 d處于最高值，與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化過(guò)程基本同步。另有研究表明，腦卒中后，EGFR陽(yáng)性細(xì)胞主要為反應(yīng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞[10]。這些結(jié)果提示，EGFR在腦出血后血腫周圍腦組織中表達(dá)持續(xù)升高，可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞活化密切相關(guān)。

Fig 7　Expression of STAT3 and p-STAT3 in

A:Control group; B: CNTF group; C: Scramble siRNA+CNTF group; D: EGFR siRNA+CNTF group.**P<0.01vscontrol group；##P<0.01vsCNTF group and scramble siRNA+CNTF group

GFAP 系星形膠質(zhì)細(xì)胞的中間絲細(xì)胞骨架蛋白，為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物。眾多研究顯示，腦出血后 GFAP 表達(dá)明顯上調(diào)，星形膠質(zhì)細(xì)胞呈活化狀態(tài)[11-12]。CNTF是目前公認(rèn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化劑，當(dāng)與其受體結(jié)合后導(dǎo)致STAT3磷酸化，磷酸化的STAT3隨后與 GFAP 基因的啟動(dòng)子結(jié)合，GFAP 基因大量轉(zhuǎn)錄，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期增殖，胞體變大，突起增多、變長(zhǎng)，細(xì)胞活化[13-14]。EGFR屬于受體型酪氨酸蛋白激酶，由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域3部分組成，EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域與配體表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α結(jié)合后，經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)域激活胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的酪氨酸激酶，形成磷酸化EGFR，從而激活下游多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括STAT3通路[15-16]。于曉棠等[17]報(bào)道，EGFR通過(guò)STAT3磷酸化，促進(jìn)大鼠肝癌的發(fā)生發(fā)展。siRNA是一類包含21~25個(gè)核苷酸的小RNA片段，與細(xì)胞內(nèi)同源性靶基因的mRNA特異性結(jié)合，使mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因沉默。因siRNA具有穩(wěn)定性好、特異性強(qiáng)、細(xì)胞毒性低以及作用持久、強(qiáng)大等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為基因功能研究的強(qiáng)大工具[18]。本研究將EGFR siRNA轉(zhuǎn)染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)其可抑制80%的EGFR蛋白表達(dá)，說(shuō)明EGFR siRNA能夠強(qiáng)烈干擾EGFR表達(dá)。本研究隨后以CNTF和(或)EGFR siRNA處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果顯示，CNTF單獨(dú)處理可明顯上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP 表達(dá)，EGFR siRNA轉(zhuǎn)染則完全逆轉(zhuǎn)了CNTF對(duì)GFAP表達(dá)的誘導(dǎo)作用，與EGFR抑制劑的作用相似[3]，表明EGFR基因沉默可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。為了進(jìn)一步探討其分子機(jī)制，我們采用Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞STAT3、p-STAT3表達(dá)，發(fā)現(xiàn)EGFR siRNA對(duì)STAT3整體蛋白水平無(wú)影響，但能明顯抑制CNTF介導(dǎo)的p-STAT3水平上調(diào)，提示阻礙STAT3磷酸化可能是EGFR基因沉默抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的重要機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，EGFR在腦出血后血腫周圍腦組織中呈高表達(dá)，EGFR基因沉默對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化有良好的抑制作用，其機(jī)制可能與阻礙STAT3磷酸化有關(guān)。因此，EGFR可能成為抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的一個(gè)潛在的、有價(jià)值的靶點(diǎn)，采用siRNA或抑制劑下調(diào)EGFR表達(dá)，對(duì)于腦出血等腦損傷疾病后的神經(jīng)再生和功能恢復(fù)具有重要的意義。

( 致謝： 本實(shí)驗(yàn)在侗醫(yī)藥研究湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究所完成，感謝謝明教授和武衡博士以及各位老師的指導(dǎo)和幫助。)

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EGFR siRNA inhibits activation of astrocytes derived from rats through blockade of STAT3 phosphorylation

QIAN Hong1,2, LIU Li-jing1, LI Yan-chun2, XIE Ming3, WU Heng3, LIU Shuang-xi4, WU Bin4

(1.SchoolofClinicalMedicine,HunanUniversityofMedicine,HuaihuaHunan418000,China；2.DeptofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,HunanUniversityofMedicine,HuaihuaHunan418000,China；3.DeptofNeurology,theFirstAffiliatedHospital,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China;4.DeptofNeurology,HuaihuaFirstPeople’sHospital,HuaihuaHunan418000,China)

Abstract:AimTo observe the expression of epidermal growth factor receptor (EGFR) in cerebral tissues around hematomas after intracerebral hemorrhage, and explore the effects of EGFR on activation of astrocytes derived from rats and the involved mechanisms. MethodsThe specimens of cerebral tissues around hemotomas after intracerebral hemorrhage undergoing hemotomas removal operation were collected and then divided into 4 groups according to the time of intracerebral hemorrhage: <1 d, 1~5 d, 6~10 d and >10 d groups. Each group included 20 cases. At the same time, 20 dropped brain tissues distant to hemorrhage in the operative process were collected as control group. Immunohistostaining and Western blot were used to measure the expression of EGFR. After isolation and culturing, the astrocytes of rat cortex were treated with culture solution (control group), CNTF that was used to activate astrocytes, scramble siRNA+CNTF and EGFR siRNA+CNTF for 24h, respectively. The expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) mRNA was detected through fluorescence real-time quantitative PCR. In addition, the protein levels of GFAP, signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) and phosphorylated STAT3 (p-STAT3) were examined using Western blot. ResultsWith the extension of intracerebral hemorrhage time, positive signal index and protein expression levels of EGFR gradually elevated, reached the peak on 6~10d, and then decreased after 10 d. There was statistical difference (P<0.01). The expression levels of GFAP mRNA and protein as well as p-STAT3 were significantly increased in cells treated with CNTF alone as compared to control group (P<0.01), whereas these effects were almost completely reversed by EGFR siRNA transfection (P<0.01). Additionally, there was no statistical difference in STAT3 protein levels among groups (P>0.05). ConclusionsEGFR expression is upregulated in the cerebral tissues around hemotomas after intracerebral hemorrhage. Gene silence of EGFR contributes to suppressing the activation of astrocytes derived from rats, which may be involved in the blockade of STAT3 phosphorylation.

Key words:astrocytes; intracerebral hemorrhage; epidermal growth factor receptor; siRNA; glial fibrillary acidic protein; signal transducers and activators of transcription 3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0216-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.014

作者簡(jiǎn)介：錢(qián)紅(1977-)，女，碩士，主治醫(yī)師，講師，研究方向：腦血管疾病的防治，E-mail：tyne000@sina.com;劉理靜(1976-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：腦血管疾病及肺纖維化的防治，通訊作者，Tel：0745-2381949,E-mail：wsfyz-000@163.com

基金項(xiàng)目：湖南省教育廳科研項(xiàng)目(No 14C0906)

收稿日期：2015-09-16，修回日期：2015-10-20

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.028.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57