川芎嗪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞骨架的影響

畢　蕾, 顏曉靜, 楊　燁, 陳衛(wèi)平

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 , 江蘇 南京　210023)

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川芎嗪對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲和細(xì)胞骨架的影響

畢蕾, 顏曉靜, 楊燁, 陳衛(wèi)平

(南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 , 江蘇 南京210023)

中國圖書分類號(hào)：R284.1；R329.24；R73-37；R735.702.2

摘要:目的通過研究川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力、侵襲能力和細(xì)胞骨架的影響,探討TMP抑制肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。方法以肝癌HepG2細(xì)胞為靶細(xì)胞,通過細(xì)胞遷移劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移的影響及其時(shí)效關(guān)系；采用細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，檢測TMP對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響；應(yīng)用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)(HCS)免疫熒光法檢測TMP對(duì)HepG2細(xì)胞骨架的影響。結(jié)果TMP對(duì)HepG2細(xì)胞的遷移能力有抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴性；TMP能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的侵襲(P<0.01)，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性；TMP可減少HepG2細(xì)胞微絲數(shù)量，降低細(xì)胞骨架的面積，差異有顯著性(P<0.01)，有劑量相關(guān)性。結(jié)論TMP能抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移及侵襲，具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，其機(jī)制可能與TMP能明顯降低細(xì)胞骨架微絲數(shù)量和面積，抑制骨架微絲重排相關(guān)。

關(guān)鍵詞：川芎嗪；肝癌；HepG2； 細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞骨架

川芎始載于東漢時(shí)期的《神農(nóng)本草經(jīng)》，是臨床常用活血理氣類中藥，能夠袪風(fēng)止痛、活血，前人譽(yù)其為“血中氣藥”，臨床多用于瘀血阻滯等病癥。川芎嗪(tetramethypyrazine, TMP)是有效單體，分子式為C8H12N2，化學(xué)名為四甲基吡嗪，首先從川芎的生物堿中分離得到。TMP目前在臨床上廣泛應(yīng)用,不僅用于心血管疾病、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)及代謝性疾病的治療,其抗腫瘤作用也日益受到關(guān)注[1-4]。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞、乳腺癌MCF-7細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞的增殖均有抑制作用，通過進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡及調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)的作用[5]，但其對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的作用尚未明確。結(jié)合前期研究結(jié)果，本文研究對(duì)象為肝癌HepG2細(xì)胞，通過觀察TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞侵襲和細(xì)胞骨架的影響，探討TMP抗肝癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制，為臨床腫瘤綜合治療中川芎嗪的合理應(yīng)用提供參考。

1材料

1.1藥物與試劑川芎嗪(中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)品，批號(hào)110817-200305)；紫杉醇注射液(PTX)(太陽集團(tuán)四川太極制藥有限公司，批號(hào)12100031)；DMEM(Gibco，批號(hào)：11995-065)；澳洲進(jìn)口胎牛血清(Gibco，批號(hào)：16000-044)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，批號(hào)：25200-056)；青-鏈霉素(Gibco，批號(hào)：15140-122)；細(xì)胞遷移試劑盒Cellomics Cell Motility kit(Thermo Scientific，美國，批號(hào)：OE187113)；細(xì)胞骨架分析試劑盒Cellomics Cytoskeletal Rearrangement kit(Thermo Scientific，美國，批號(hào)：OA183099)；羅丹明染色劑(Thermo Scientific，美國，批號(hào)：OB16636440)；羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色劑(Thermo Scientific，美國，批號(hào)：OC183818)；基質(zhì)膠Matrigel matrix(BD公司，美國，批號(hào)：2342761)；4%多聚甲醛(Sigma公司，美國，批號(hào)：20120421)；甲醇(Kermel公司，中國，批號(hào)：20140410)。

1.2細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)肝癌HepG2細(xì)胞株，購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)貼壁，傳代周期為2~3 d，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3主要儀器高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)(型號(hào)：Arrayscan VTI 700，Thermo Scientific，美國)；RTCA DP實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞傳感電阻儀 (型號(hào)：RTCA DP，Roche公司，瑞士)；超凈工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-1FD，蘇州凈化設(shè)備有限公司，中國)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：NU4950E， NUAIRE公司，美國)；倒置相差顯微鏡(型號(hào)：DFC-259 Leica，德國)。

2方法

結(jié)合前期研究基礎(chǔ)，選用肝癌HepG2細(xì)胞為研究對(duì)象，依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)獲得TMP對(duì)HepG2細(xì)胞的IC50確定劑量[5]，進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

2.1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，用滴管吹打至單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L-1，接種于6孔板上，每孔1 mL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h至細(xì)胞基本融合。用100 μL微量移液頭在6孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS液沖洗2次后加入TMP溶液，每孔1 mL，使終濃度分別為50、100和200 mg·L-1，陰性對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板置入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h，分別用倒置相差顯微鏡觀察。每個(gè)視野內(nèi)，隨機(jī)選擇3個(gè)區(qū)域，并計(jì)算100×視野內(nèi)遷移劃痕空隙的長度。

2.2細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)在CIM-plate細(xì)胞遷移浸潤檢測板上室中加入一層Matrigel凝膠，下室加入趨化因子600 μL。然后在上室中加入細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L-1，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。設(shè)給藥組和陰性對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔，在細(xì)胞傳感電阻儀動(dòng)態(tài)檢測72 h。

2.3高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)免疫熒光法檢測細(xì)胞骨架將細(xì)胞消化懸浮于培養(yǎng)液中，吹打接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后給藥，分陰性對(duì)照組、給藥組以及陽性對(duì)照組。陰性對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，給藥組加入TMP溶液，每孔50 μL，陽性對(duì)照組加紫杉醇，終濃度均為10 mg·L-1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，加入提前預(yù)熱的多聚甲醛固定，每孔200 μL，室溫孵育30 min；去除固定液，清洗2次；加入穿透液，室溫孵育15 min；去除穿透液，加入封閉液，進(jìn)行封閉，室溫孵育15 min；去除封閉液，加入抗體探針溶液，室溫孵育1 h；去除探針溶液，清洗3次，避光室溫孵育15 min；去除Whole cell stain 溶液，清洗3次；封口96孔板，于HCS 讀板，4℃保存。

3結(jié)果

3.1TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，TMP對(duì)肝癌細(xì)胞遷移的影響如Fig 1所示，隨機(jī)選擇視野內(nèi)3個(gè)區(qū)域，并計(jì)算100×視野內(nèi)遷移劃痕空隙的長度，結(jié)果如Fig 2所示，TMP能夠明顯抑制肝癌HepG2細(xì)胞遷移，并呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。

3.2TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲的影響實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA DP)檢測TMP對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲結(jié)果如Fig 3示，與陰性對(duì)照組比較，TMP能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的侵襲，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。TMP對(duì)HepG2細(xì)胞分別作用24 h、48 h和72 h的細(xì)胞侵襲分析結(jié)果如Fig 4、Tab 1所示，與對(duì)照組比較，TMP作用48 h和72 h后對(duì)細(xì)胞侵襲均能明顯抑制(P<0.01)，呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性。

Tab 1　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

***P<0.01vscontrol

3.3TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞骨架的影響高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)免疫熒光法檢測TMP對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞骨架蛋白-肌動(dòng)蛋白F-actin的結(jié)果如Fig 5示，對(duì)照組細(xì)胞骨架蛋白-肌動(dòng)蛋白F-actin構(gòu)成的微絲面積比較大，TMP作用后，HepG2細(xì)胞中由F-actin 構(gòu)成的微絲減少。骨架面積分析結(jié)果見Fig 6、Tab 2，結(jié)果表明TMP能夠明顯降低人肝癌細(xì)胞HepG2骨架的面積(P<0.01)，且呈一定的劑量相關(guān)性。

Tab 2　Effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 ±s，n=3)

***P<0.01vscontrol

4討論

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特性之一，是惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中的危險(xiǎn)階段，其預(yù)后不良，是腫瘤患者死亡的主要原因，據(jù)統(tǒng)計(jì)，臨床腫瘤患者約有80%~90%死于腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition， EMT)是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)和必備條件，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、多步驟的過程。細(xì)胞間黏附性的喪失、腫瘤基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)的破壞以及細(xì)胞骨架的重建，導(dǎo)致細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加和細(xì)胞遷移的產(chǎn)生[6-9]。

Fig 1　Effect of TMP on migration of HepG2 cells(×100)

Fig 2　Effect of TMP on scratch length of HepG2 cells(n=3)

***P<0.01vscontrol group

Fig 3　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells

細(xì)胞骨架為經(jīng)由蛋白纖維交織而成的立體網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，充滿整個(gè)細(xì)胞質(zhì)，為了保持細(xì)胞特有的形狀，其與外側(cè)的細(xì)胞膜和內(nèi)側(cè)的核膜存在一定的結(jié)構(gòu)聯(lián)系，并與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)有關(guān)[10]。微管、微絲和中間纖維是組成細(xì)胞骨架主要結(jié)構(gòu)，而微絲在多種腫瘤細(xì)胞中被大量修飾，與腫瘤細(xì)胞異常的生長特點(diǎn)如黏附和轉(zhuǎn)移有關(guān)。肌動(dòng)蛋白F-actin是構(gòu)成微絲的主要細(xì)胞骨架蛋白，在腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變和遷移中起著非常重要的作用[11-12]。

Fig 4　Effect of TMP on invasion of HepG2 cells after

***P<0.01vscontrol group

Fig 5　Fluorography of HepG2 cells

Fig 6　Effect of TMP on HepG2 cell

***P<0.01vscontrol group

課題組通過研究發(fā)現(xiàn)TMP對(duì)HepG2細(xì)胞遷移有抑制作用，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性和劑量依賴性；TMP能夠明顯抑制HepG2細(xì)胞的侵襲，并呈現(xiàn)一定的時(shí)間依賴性；與空白對(duì)照組及陽性對(duì)照組比較，TMP能夠明顯降低人肝癌HepG2細(xì)胞微絲數(shù)量和細(xì)胞骨架的面積，且呈劑量相關(guān)性，這可能是因?yàn)門MP通過調(diào)節(jié)細(xì)胞松弛素，阻止肌動(dòng)蛋白聚合成微絲，從而減少微絲的形成，影響微絲的功能。總之，TMP可抑制肝癌HepG2細(xì)胞的遷移及侵襲，具有潛在的抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用，其作用機(jī)制可能與TMP能明顯減少細(xì)胞骨架微絲數(shù)量和降低細(xì)胞骨架面積，抑制骨架微絲重排相關(guān)。由此TMP是否可以抑制細(xì)胞獲得新的間質(zhì)表型，進(jìn)而抑制細(xì)胞發(fā)生EMT，有待于進(jìn)一步研究。

(致謝:本文實(shí)驗(yàn)在南京中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥性效研究實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室對(duì)本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)的鼎力支持！)

參考文獻(xiàn)

[1]謝東浩,劉霖,姜文靜,等.中藥治療肝癌的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展[J]. 南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2014，30(4):393-5.

[1]Xie D H, Liu L,Jiang W J, et al. Research progress on prevention and treatment of liver cancer with Chinese medicine[J].JNanjingUnivTradChinMed, 2014,30(4):393-5.

[2]王生,趙楊,陶麗，等. 川芎嗪對(duì)腫瘤介導(dǎo)的血液高凝的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào), 2012,28(5):709-15.

[2]Wang S, Zhao Y,Tao L, et al.The effect of Ligustrazine on tumor-mediated hypercoagulability [J].ChinPharmacolBull, 2012,28(5):709-15.

[3]馮全服,曾莉,李文林,等. 川芎嗪對(duì)癌癥相關(guān)細(xì)胞因子作用的研究進(jìn)展[J]. 中藥新藥與臨床藥理,2013,24(4):433-6.

[3]Feng Q F,Zeng L,Li W L,et al.Research progress on the effects of Ligustrazine on cancer cytokines[J].TradChinDrugResClinPharmacol, 2013,24(4):433-6.

[4]韓嬌艷，朱方強(qiáng)，徐祥，等．川芎嗪通過Akt信號(hào)通路影響前列腺癌PC3細(xì)胞的增殖和凋亡[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(2):105-8.

[4]Han J Y,Zhu F Q,Xu X, et al. Tetramethypyrazine hydrochloride inhibits proliferation and apoptosis in human prostate cancer PC3 cells through Akt signaling pathway[J].JThirdMilitMedUniv，2013,35(2):105-8.

[5]馮全服,畢蕾,顏曉靜,等.川芎嗪調(diào)控肝癌HepG2細(xì)胞凋亡及對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,31(3):246-9.

[5]Feng Q F, Bi L, Yan X J,et al. Effect of tetramethypyrazine on the apoptosis of HepG2 cells by modulating p53 signaling and Bcl-2/Bax protein ratioinvitro[J].JNanjingUnivTraditChinMed, 2015,31(3):246-9.

[6]Christiansen J J, Rajasekaran A K. Reassessing epithelial to mesenchymal transition as a prerequisite for carcinoma invasion and metastasis[J].CancerRes, 2006, 66(17):8319-26.

[7]Klymkowsky M W, Savagner P. Epithelial-mesenchymal transition: a cancer researcher's conceptual friend and foe[J].AmJPathol, 2009, 174(5):1588-93.

[8]Thiery J P. Epithelial-mesenchymal transition in tumor progression[J].NatRevCancer, 2002, 2(6):442-54.

[9]Wells A, Yates C, Shepard C R. E-cadherin as an indicator of mesenvhymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas[J].ClinExpMetastasis, 2008, 25(6):621-8.

[10] 顏曉靜, 楊燁, 畢蕾,等.丹參-人參組分配伍對(duì)肺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡和骨架的影響[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(22):4436-41.

[10] Yan X J, Yang Y, Bi L, et al. Effects of the component formula of Salvia Miltiorrhiza and Panax Ginseng on cell proliferation, apoptosis and skeleton in lung cancer A549 cells[J].ChinJChinMaterMed，2014, 39(22):4436-41.

[11] Rao J, Li N. Microfilament actin remodeling as a potential target for cancer drug development [J].CurrCancerDrugTargets, 2004, 4(4): 345-54.

[12] Pawlak G, Helfman D M. Cytoskeletal changes in cell transformation and tumorigenesis [J].CurrOpinGenetDev, 2001, 11(1): 41-7.

Effect of tetramethypyrazine on cell migration, cell invasion and cytoskeleton in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2

BI Lei, YAN Xiao-jing , YANG Ye, CHEN Wei-ping

(DeptofPreclinicalMedicine,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

Abstract:AimTo explore the mechanism of tetramethypyrazine (TMP) in the inhibition of cancer cell invasion and metastasis, by investigating the effect of TMP on cell migration, cell invasion and cytoskeleton of HepG2 cells. MethodsUsing HepG2 cells as target cells, cell migration of different concentrations of TMP on HepG2 cells was assayed by the scratch wound healing assay. Matrigel cell invasion assay was used to detect the effect of TMP on the invasion of HepG2 cells. The effect of TMP on cytoskeleton of HepG2 cells was detected by high content screening (HCS).ResultsTMP inhibited the migration of HepG2 cells, and showed a time-dependent and dose-dependent manner. Moreover, TMP significantly inhibited the invasion of HepG2 cells (P<0.01), and showed a certain time-dependence. Furthermore, compared with control group, a significant decrease in HepG2 cytoskeleton area was found in a dose-dependent manner (P<0.01). ConclusionTMP can inhibit the migration and invasion of HepG2 cells, and it has the potential to resist tumor metastasis, and the mechanism may be associated with TMP significantly decreasing the number and area of cytoskeleton, and inhibiting the rearrangement of cytoskeleton.

Key words:tetramethypyrazine; liver cancer;HepG2;cell migration; cell invasion; cytoskeleton

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0194-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.010

作者簡介:畢蕾(1984-),女,博士,講師,主治醫(yī)師,研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤, Tel:025-85811941，E-mail:bellajssz@163.com；陳衛(wèi)平(1959-),女,博士,教授,博士生導(dǎo)師， 研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤，通訊作者，Tel/Fax: 025-85811923，E-mail: wp2002123@163.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81273638, 81503486);江蘇省高校自然科學(xué)研究項(xiàng)目(No 14KJD360004); 江蘇省中醫(yī)藥局科技重點(diǎn)項(xiàng)目(No ZD201502);江蘇省普通高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(No KYLX15_0997)

收稿日期：2015-11-24，修回日期：2015-12-16

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.020.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57