1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

李蒙蒙，王雨晴，張麗志，婁建石，溫　克

(1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津　300070；2.天津市第一中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津　300192)

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1-磷酸鞘氨醇后適應(yīng)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用

李蒙蒙1，王雨晴1，張麗志2，婁建石1，溫克1

(1.天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，天津300070；2.天津市第一中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，天津300192)

中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R322.123；R329.24；R329.25；R845.22

摘要：目的研究1-磷酸鞘氨醇(S1P)后適應(yīng)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法建立HUVEC缺氧/復(fù)氧損傷模型，將HUVEC細(xì)胞分為5組，正常對(duì)照組、S1P低劑量組、S1P中劑量組、S1P高劑量組以及缺氧/復(fù)氧損傷(H/R)組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)分析測(cè)定細(xì)胞凋亡率；比色法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、銅鋅超氧化物歧化酶(copper/zinc superoxide dismutase，CuZn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase，Mn-SOD)活力以及一氧化氮(nitric oxide，NO)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位；Western blot測(cè)定HUVECs細(xì)胞Bcl-2/Bax、eNOS蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果與H/R組相比，S1P低、中、高劑量組可明顯增加HUVECs細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后細(xì)胞存活率；均明顯升高T-SOD活力、CuZn-SOD活力、Mn-SOD活力，降低MDA含量，明顯升高NO含量及增加eNOS蛋白表達(dá)，降低凋亡率，抑制線粒體膜電位下降。結(jié)論S1P能夠使H/R損傷的HUVECs細(xì)胞凋亡率降低，且呈一定的濃度依賴性。S1P對(duì)H/R損傷的HUVECs細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用可能與降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量，提高細(xì)胞內(nèi)SOD活力，提升線粒體膜電位，增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2/Bax的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：S1P；缺氧/復(fù)氧；HUVECs細(xì)胞；Bcl-2/Bax；eNOS；凋亡

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，I/R)過(guò)程中除心肌細(xì)胞壞死、凋亡外，血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷也發(fā)揮著重要作用。表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞屏障功能障礙、微血管通透性增加、粒細(xì)胞浸潤(rùn)、炎性介質(zhì)釋放；同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)下降、一氧化氮(nitric oxide，NO)生成減少，導(dǎo)致微血管收縮，參與無(wú)復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生，心肌損傷加重[1]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)具有心血管保護(hù)作用，可抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)下或炎癥狀態(tài)下(血小板活化因子)引起的在體大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，具有內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用。S1P后適應(yīng)抑制炎癥反應(yīng)、拮抗氧化應(yīng)激、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)功能，減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷，亦可緩解心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧(hypoxia/reoxygenation, H/R)損傷[2-3]。其他實(shí)驗(yàn)室研究亦發(fā)現(xiàn)，離體大鼠心肌缺血后適應(yīng)保護(hù)作用與內(nèi)源性S1P有關(guān)[4]。但S1P是否對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞H/R損傷具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC缺氧/復(fù)氧損傷模型，以觀察S1P對(duì)HUVEC H/R損傷是否具有保護(hù)作用，為臨床用藥提供依據(jù)。

1材料

HUVECs 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株(上海艾研生物有限公司)；S1P(美國(guó)Sigma，批號(hào)：032M4103V)；超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(批號(hào)：20130709)、BCA法蛋白定量試劑盒(批號(hào)：20140303)均購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔抗體(批號(hào)：970380)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠抗體(批號(hào)：107724)均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人Bcl-2多克隆抗體(批號(hào)：L1311)、兔抗人Bax多克隆抗體(批號(hào)：B2812)、β-actin抗體(批號(hào)：E3012)、兔抗人NOS3多克隆抗體(批號(hào)：E1413)均購(gòu)自Santa Cruz公司；Tubulin抗體(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)：AT819-1)；Annexin V-PI 雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD公司，批號(hào)：3337788)；FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD 公司)；FV1000熒光顯微鏡(NIKON公司)；ELx800吸收光酶標(biāo)儀(BioTek公司)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組HUVECs細(xì)胞常規(guī)用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的HUVECs細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×108·L-1，均勻接種于板中，24 h后細(xì)胞融合至80% 左右。將培養(yǎng)的HUVECs細(xì)胞隨機(jī)分為5組，即正常對(duì)照(Control)組、缺氧/復(fù)氧(H/R)組、S1P高、中、低劑量組。Control組換無(wú)血清的培養(yǎng)基。H/R組首先用模擬缺氧液(NaCl 139 mmol·L-1、KCl 4.7 mmol·L-1、CaCl21.0 mmol·L-1、MgCl20.5 mmol·L-1、HEPES 5 mmol·L-1、乳酸鈉 20 mmol·L-1,pH 6.2)置換正常培養(yǎng)基，放入細(xì)胞厭氧培養(yǎng)裝置密封，通入95% N2、5% CO2的混合氣15 min，密封裝置，置于37℃培養(yǎng)箱，缺氧處理16 h后，取出培養(yǎng)板，換用無(wú)血清培養(yǎng)基在95% O2+5% CO2的正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4 h，建立H/R損傷模型。S1P低、中、高劑量組于復(fù)氧前加入含S1P(終濃度為2、4、6 μmol·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基，余同H/R組。

2.2測(cè)定指標(biāo)

2.2.1細(xì)胞存活率細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷后，利用MTT法測(cè)定490 nm波長(zhǎng)下每孔光吸收度值(OD 值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。并按下述公式計(jì)算細(xì)胞增殖率/%=(各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/ (正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100%。

2.2.2SOD 活性、MDA 含量的檢測(cè)收集各組HUVECs細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作收集細(xì)胞裂解液3 000×g×10 min離心，取上清液，比色法測(cè)定MDA含量及SOD活性。

2.2.3細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量測(cè)定按實(shí)驗(yàn)分組，每組分別取細(xì)胞培養(yǎng)液0.1 mL，根據(jù)測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)NO含量，并按照下述公式計(jì)算：NO含量/μmol·L-1=[(測(cè)定管OD-空白管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD)]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×稀釋倍數(shù)。

2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率各組缺氧/復(fù)氧細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，采用Annexin V-PI 雙染法對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行染色，AnnexinV-FITC標(biāo)記為綠色熒光，PI標(biāo)記為紅色熒光。流式細(xì)胞儀測(cè)定熒光強(qiáng)度，計(jì)算各組凋亡率。

2.2.5熒光顯微鏡法檢測(cè)線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，加入JC-1染色工作液，充分混勻。細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 mL JC-1染色緩沖液(5×)加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次。加入2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液。熒光顯微鏡下觀察，并計(jì)算紅色熒光(激發(fā)波長(zhǎng)：525 nm，發(fā)射波長(zhǎng)：590 nm)及綠色熒光(激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)熒光強(qiáng)度。在低膜電位時(shí)，JC-1以單體形式存在，產(chǎn)生綠色熒光；高膜電位時(shí)，JC-1形成聚合物，發(fā)射紅色熒光。計(jì)算紅、綠色熒光強(qiáng)度比值可反映線粒體膜電位變化。

2.2.6Western blot檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用PBS洗滌細(xì)胞，并用適量胰酶消化、收集細(xì)胞。應(yīng)用預(yù)冷裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，收集蛋白質(zhì)樣品，經(jīng)BCA蛋白定量、電泳、轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉封閉2 h以上，加入一抗(tublin稀釋度為1 ∶2 000，Bax、Bcl-2、eNOS、β-actin稀釋度為1 ∶1 000)，4℃搖床過(guò)夜，二抗(稀釋度為1 ∶2 000)室溫孵育1~2 h，再經(jīng)顯影、定影后觀察結(jié)果并掃描，采用Quantitive軟件分析條帶的光密度值，計(jì)算Bcl-2/Bax、eNOS/tublin的比值。

3結(jié)果

3.1細(xì)胞存活率MTT數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)缺氧/復(fù)氧處理后，與正常對(duì)照組比較，H/R組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)，而S1P各個(gè)濃度組存活率比H/R組有明顯升高，其中中、高濃度組與H/R組比較差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，且隨S1P濃度增大，HUVEC細(xì)胞存活率逐漸上升，見(jiàn)Tab1。

Tab 1　Protective effect of S1P on

***P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

3.2細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性與正常對(duì)照組比較，H/R組的T-SOD、CuZn-SOD、Mn-SOD活性明顯降低(P<0.01)；與H/R組相比，S1P各個(gè)濃度組均明顯升高T-SOD活性(P<0.01)、CuZn-SOD活性(P<0.01)、Mn-SOD活性(P<0.01)，見(jiàn)Tab2。

3.3細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA含量與正常對(duì)照組比較，H/R組的MDA含量明顯升高(P<0.0l)；與H/R組相比，S1P各個(gè)濃度組均明顯降低MDA含量(P<0.05)，見(jiàn)Tab 2。

Tab 2　Effect of S1P on SOD activity, MDA content during H/R injury in HUVECs ±s,n=3)

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

Tab 3　Effect of S1P on NO content, apoptosis and mitochondrial membrane potential of HUVECs cells after H/R ±s,n=3)

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsH/R group

Fig 1　Effect of different concentrations of S1P on apoptosis of HUVECs cells

A: Control group; B: H/R group; C: S1P (L) group; D: S1P (M) group; E: S1P (H) group

3.4細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量測(cè)定H/R組細(xì)胞經(jīng)缺氧/復(fù)氧損傷后，NO含量明顯降低(P<0.01)。與H/R組相比，S1P低、中、高各個(gè)濃度組均明顯升高NO含量，且差異具有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Tab 3。

3.5流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率與正常對(duì)照組比較，H/R組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)。S1P處理的不同濃度組可降低細(xì)胞凋亡率，其中高濃度組與H/R組比較差異具有顯著性(P<0.01)，見(jiàn)Tab 3及Fig 1。

3.6熒光顯微鏡法檢測(cè)線粒體膜電位熒光顯微鏡下觀察，正常對(duì)照組正常細(xì)胞被JC-1染色后顯示紅色熒光，H/R組多數(shù)細(xì)胞呈綠色熒光，提示線粒體膜電位下降。細(xì)胞經(jīng)S1P各個(gè)濃度組處理后，隨著藥物濃度的增加，HUVECs細(xì)胞紅色熒光顆粒逐漸增強(qiáng)，綠色熒光顆粒逐漸減少，提高紅綠色熒光比值，其中，中、高濃度組與H/R比較差異具有顯著性(P<0.05，P<0.01)，見(jiàn)Tab 3及Fig 2。

3.7Western blot測(cè)定HUVECs細(xì)胞Bcl-2/Bax、eNOS的蛋白表達(dá)與正常對(duì)照組比較，H/R組Bcl-2蛋白表達(dá)較低，而B(niǎo)ax條帶密度較深，Bcl-2/Bax比值較低。S1P各個(gè)濃度組可明顯增加Bcl-2表達(dá)，降低Bax表達(dá)，提高Bcl-2/Bax，見(jiàn)Fig 3。與正常對(duì)照組比較，H/R組eNOS表達(dá)明顯降低，S1P不同濃度組與H/R組比較，eNOS表達(dá)明顯增多，見(jiàn)Fig 4。

Fig 2　Fluorescence image of HUVEC loaded with JC-1

A: Control group; B: H/R group; C: S1P (L) group; D: S1P (M) group; E: S1P (H) group

Fig 3　Effect of S1P on the expression of Bcl-2/Bax

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsH/R group

Fig 4　Effect of S1P on the expression of

**P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH/R group

4討論

心肌缺血/再灌注損傷過(guò)程中同時(shí)存在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞損傷[1]。本實(shí)驗(yàn)前期研究已通過(guò)在體大鼠心肌缺血/再灌注損傷模型以及體外心肌缺氧/復(fù)氧損傷模型證實(shí)，S1P具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用。本研究采用體外內(nèi)皮細(xì)胞模型，觀察了S1P對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用，研究證實(shí)，S1P可提高缺氧/復(fù)氧損傷細(xì)胞生存率，降低凋亡細(xì)胞數(shù)量。

eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并催化NO的生成，發(fā)揮調(diào)節(jié)血管活性、抗凝血、抗血管增殖等作用。心肌缺血/再灌注時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可導(dǎo)致eNOS水平下降、NO等擴(kuò)血管物質(zhì)減少，導(dǎo)致血管收縮、血小板黏附聚集，而進(jìn)一步加重?fù)p傷[5]。Roviezzo等[6]研究發(fā)現(xiàn)，S1P處理牛胸主動(dòng)脈后，能夠引起Akt介導(dǎo)的eNOS表達(dá)上調(diào)以及NO的大量產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，S1P處理后可上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)水平，增加內(nèi)皮細(xì)胞NO生成，減輕內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷與多種因素密切相關(guān)，其中氧化應(yīng)激是重要因素之一。細(xì)胞再給氧過(guò)程中，大量活性氧自由基(ractive oxygen species，ROS)產(chǎn)生超過(guò)了內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的清除能力，ROS可引起線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)凋亡發(fā)生[7-8]。SOD為機(jī)體內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)，可分為主要位于線粒體的Mn-SOD及位于胞質(zhì)的Cu/Zn-SOD[9]。本研究證實(shí)，S1P可提高細(xì)胞3種SOD活性，并可降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物MDA含量，提示S1P的抗內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用可能與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)。

缺氧/復(fù)氧損傷過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要包括死亡受體途徑以及線粒體途徑兩種。其中，線粒體發(fā)揮著重要的作用，細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷過(guò)程中，氧化應(yīng)激、鈣超負(fù)荷可導(dǎo)致線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開(kāi)放、線粒體膜電位下降、線粒體腫脹、線粒體外膜破裂[10]。而細(xì)胞的存活與Bcl-2家族中抗凋亡成分與促凋亡成分的比率密切相關(guān)[11]。Bax是促凋亡基因，Bcl-2是抑制凋亡基因。后者主要作用為分布于線粒體外膜，抑制細(xì)胞色素C釋放，并維持線粒體外膜完整性[12]，同時(shí)也有研究證實(shí)，Bcl-2可通過(guò)抗氧化作用抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡[13]。Bax正常情況下主要位于胞質(zhì)，在凋亡信號(hào)誘導(dǎo)后易位至線粒體，誘導(dǎo)特異性通透孔道形成，導(dǎo)致促凋亡因子(細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子等)釋放增加，誘導(dǎo)凋亡形成[14]。本研究采用JC-1熒光染色方法觀察了細(xì)胞線粒體膜電位的變化。該熒光的強(qiáng)弱或顏色變化可以反映線粒體膜電位的增高或降低[15]。研究表明，S1P可抑制缺氧/復(fù)氧損傷引起的線粒體膜電位下降。同時(shí)關(guān)于Bcl-2及Bax表達(dá)的檢測(cè)證實(shí)，S1P可增加Bcl-2的表達(dá)，降低Bax的表達(dá)，提高Bcl-2/Bax的比率。

綜上所述，S1P可能通過(guò)增強(qiáng)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)、抑制線粒體膜電位下降、抗氧化應(yīng)激作用減少內(nèi)皮細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷。

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Protective effect of sphingosine 1- phosphate postconditioning on hypoxia/reoxygenation injury in human umbilical vein endothelial cell

LI Meng-meng1, WANG Yu-qing1, ZHANG Li-zhi2, LOU Jian-shi1, WEN Ke1

(1.DeptofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China; 2.DeptofObstetricsandGynecology,TianjinFirstCentralHospital,Tianjin300192，China)

Abstract:AimTo investigate the protective effects of sphingosine 1-phosphate (S1P) postconditioning on hypoxia/reoxygenation(H/R) injury in human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and its mechanisms.MethodsHUVECs cells were divided into five groups: normal (control) group, S1P low concentration group (L), S1P medium concentration group (M), S1P high concentration group (H) and H/R group. MTT method was used to measure cell survival. Using flow cytometric analysis, the rate of cell apoptosis was determined. The activities of total superoxide dismutase (T-SOD), copper/zinc superoxide dismuta-se (CuZn-SOD), manganese superoxide dismutase (Mn-SOD) activity, nitric oxide (NO) and malondialdehyde (MDA) content in cell culture medium were measured with colorimetry. Mitochondrial membrane potential in cells was observed with fluorescence microscope. Bax/Bcl-2, eNOS protein expression levels in HUVECs cells were observed with Western blot.ResultsCompared with H/R group, S1P low, medium and high concentrations in the intervention group could significantly increase the cell survival rate after H/R injury, and increase activity of T-SOD, CuZn-SOD, Mn-SOD and decrease content of MDA. Moreover, S1P could significantly increase NO content and increase eNOS protein expression, decrease apoptosis rate and inhibit the reduction of mitochondrial membrane potential. ConclusionsS1P can decrease cell apoptosis rate of HUVECs after H/R injury with a certain concentration dependence. The protection of S1P for cell apoptosis of HUVECs after H/R injury may be related to decreasing the intracellular MDA content and improving intracellular SOD activity, increasing mitochondrial membrane potential and enhancing expression of Bcl-2, anti-apoptotic protein.

Key words:S1P; hypoxia/reoxygenation; HUVECs cells; Bcl-2/Bax; eNOS;apoptosis

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2016)02-0184-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.008

作者簡(jiǎn)介：李蒙蒙(1991-)，女，碩士生，研究方向：心血管藥理學(xué)， E-mail: limeng50005@163.com;溫克(1974-)，男，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué),通訊作者，E-mail:13820883653@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173058)；國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(No 81502419)；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 10JCZDJC20900)

收稿日期：2015-10-22，修回日期：2015-11-13

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.016.html網(wǎng)絡(luò)出版地址：2016-1-25 15:57