去氫丹參新酮對神經(jīng)炎癥的抑制作用及機制研究

李德川，鮑秀琦，張德武，孫　華，戴均貴，張　丹

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京　100050)

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去氫丹參新酮對神經(jīng)炎癥的抑制作用及機制研究

李德川，鮑秀琦，張德武，孫華，戴均貴，張丹

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京100050)

中國圖書分類號：R284.1；R322.8；R329.24；R364.5；R745.7；R977.3；R977.6

摘要：目的研究去氫丹參新酮對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導小膠質細胞系BV2細胞產(chǎn)生炎癥反應的抑制作用及其作用機制。方法不同濃度去氫丹參新酮預孵育BV2細胞后，用LPS刺激引起神經(jīng)炎癥相關反應。Griess試劑法檢測去氫丹參新酮對活化的BV2細胞產(chǎn)生一氧化氮(nitric oxide, NO)的影響，ELISA檢測細胞上清液中TNF-α和IL-6的釋放量，Confocal觀察小膠質細胞表面活化標志物MAC-1表達量的變化，Western blot檢測炎癥相關信號通路蛋白表達的變化。結果去氫丹參新酮可明顯抑制LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生的炎癥因子包括NO、TNF-α和IL-6的水平，同時抑制一氧化氮合酶、環(huán)氧合酶-2等炎癥相關蛋白的表達和小膠質細胞表面活化標志物MAC-1的表達。機制研究發(fā)現(xiàn)，去氫丹參新酮對PI3K/Akt的過度磷酸化以及NF-κB的過度活化都有明顯的抑制作用。結論去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥活性，其作用機制可能是通過PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB的活化而實現(xiàn)的。

關鍵詞：去氫丹參新酮；神經(jīng)炎癥；小膠質細胞；NF-κB；PI3K/Akt；脂多糖

神經(jīng)炎癥是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫應答反應，主要由腦內(nèi)免疫細胞小膠質細胞和星形膠質細胞介導。當腦組織受到各種病理因素的損傷或刺激時，小膠質細胞和星型膠質細胞可由靜息態(tài)轉變?yōu)榧せ顟B(tài)，吞噬清除變性的神經(jīng)組織碎片，因此適度激活的膠質細胞對神經(jīng)元起保護作用[1]。但是在病理條件下，膠質細胞會被過度激活，引起神經(jīng)炎癥，釋放大量的炎癥因子，如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白介素(interleukin, IL)、谷氨酸鹽和一氧化氮(nitric oxide, NO)等[2]，導致神經(jīng)元功能喪失、變性甚至死亡，進而引起神經(jīng)元的損傷。盡管神經(jīng)炎癥的機制還沒有完全研究清楚，但是普遍認為神經(jīng)炎癥與多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病密切相關[3]。如在阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)患者的大腦皮層可見β淀粉樣蛋白周圍存在有大量激活的小膠質細胞和星型膠質細胞，在帕金森疾病(Parkinson’s disease, PD)患者中腦黑質紋狀體部位有大量多巴胺能神經(jīng)元的丟失，并伴有大量炎癥因子的存在[4]。鑒于炎癥反應在神經(jīng)退行性疾病發(fā)病過程中的重要作用，控制疾病過程中的炎癥反應將有助于神經(jīng)退行性疾病的預防和治療。因此，從抗炎的角度研究和開發(fā)具有神經(jīng)保護作用的藥物已成為當下研究的熱點。丹參是我國的傳統(tǒng)中藥，臨床上用于治療心腦血管疾病如冠心病、心絞痛等已有悠久的歷史。近年來，對丹參的研究發(fā)現(xiàn)，丹參中的丹參酮類物質具有良好的神經(jīng)保護作用，表現(xiàn)在抗炎、抗氧化、抗凋亡和抑制興奮性氨基酸毒性等多個方面[5]。中國醫(yī)學科學院藥物研究所生物合成室通過生物合成的方法從丹參的細胞培養(yǎng)物中分離獲得的去氫丹參新酮(dehydromiltirone，結構見Fig 1)，經(jīng)我們實驗室的抗炎活性初篩后，發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗炎活性。因此在本實驗中，我們采用經(jīng)典致炎劑脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激小膠質細胞系BV2細胞建立體外神經(jīng)炎癥模型，進一步評價去氫丹參新酮的抗炎作用，并對其作用機制進行初步研究。

1材料

1.1藥品與試劑去氫丹參新酮由中國醫(yī)學科學院藥物研究所生物合成室戴均貴教授提供，純度99.5%，用DMSO配制成10-2mol·L-1儲備液，分裝后于-20℃保存；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；新生胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；LPS購自默克密理博公司；兔抗NF-κB(p65)、兔抗p-Akt(Ser473)、兔抗Akt、兔抗p-PI3K(p85)、兔抗PI3K、小鼠抗p-IκBα、兔抗IκBα等抗體購自Cell Signaling Technology公司；兔抗COX-2抗體購自Abcam公司；兔抗CD11b抗體購自ABD Serotec公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；小鼠TNF-α、IL-6 ELISA檢測試劑盒為欣博盛生物科技有限公司產(chǎn)品；胞核-胞質蛋白制備試劑盒、ECL超敏發(fā)光液等購自北京普利萊基因技術有限公司。

Fig 1　Chemical structure of dehydromiltirone

1.2儀器MQX-200酶標儀(Bio-TeK.Instruments Inc.,USA)；Sigma 2K15離心機；垂直電泳儀和電轉移系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；LAS4000化學發(fā)光系統(tǒng)(GE公司, USA)；FV1000MPE Multiphoton Laser Scanning Microscope(奧林巴斯，日本)。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)小膠質細胞系BV2細胞由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞中心提供，于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔2~3天傳代，所用消化液為0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA。

2.2MTT法檢測細胞毒性取對數(shù)生長期的BV2細胞，經(jīng)消化計數(shù)后，以5.0×103個/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)，每組設6個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，小心吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 0.5 g·L-1的MTT，繼續(xù)37℃孵育4 h后，棄去上清液，每孔中加入200 μL DMSO，振蕩5 min以使結晶充分溶解，于酶標儀540 nm波長處測定吸光度值。以對照組細胞存活率為100%，計算不同處理組細胞的存活率。

2.3NO測定采用Griess法測定亞硝酸鹽(NO2-)的含量來反映NO的濃度。取對數(shù)生長期的BV2細胞，經(jīng)消化計數(shù)后，以5×103個/孔接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預孵育1 h，然后加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集上清100 μL，加入等體積Griess試劑(以蒸餾水配制0.1%奈乙二胺，以5%磷酸配制1%對氨基苯磺酸，兩者在臨用前以1 ∶1等體積混合)，室溫靜置10 min，蒸餾水調(diào)零，在酶標儀上測定540 nm處吸光度值，同時以硝酸鈉為標準品，測定吸光度值，計算亞硝酸鹽的含量。

2.4酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)BV2細胞以5.0×104個/孔接種于24孔板，待細胞貼壁后，加入去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預孵育1 h，加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)，分別在3 h和12 h后收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，測定細胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。

2.5免疫熒光實驗24孔板內(nèi)放置無菌玻璃片，BV2細胞以合適密度接種于24孔板中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，加入去氫丹參新酮10 μmol·L-1預孵育1 h，再加入LPS(1 mg·L-1)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。細胞用4%多聚甲醛室溫下固定20 min，然后用0.5% Triton X-100室溫通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室溫下封閉2 h后，加入兔抗CD11b一抗(1 ∶250，PBS稀釋)，4℃孵育過夜。PBS洗3次，加入FITC標記的二抗，37℃避光孵育60 min。PBS洗滌后，滴加3 mg·L-1DAPI，避光孵育5 min對標本進行核染，洗去多余的DAPI，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2.6Western blot取處于對數(shù)生長期的BV2細胞，用胰酶消化后收集細胞計數(shù)，以5×107·L-1濃度接種于75 mm2培養(yǎng)瓶中，不同濃度的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預孵育1h后，加入LPS(1 mg·L-1)，于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h后，檢測PI3K/Akt信號通路蛋白變化，24 h后檢測NF-κB信號通路及iNOS和COX-2蛋白表達變化，收集細胞，并按照胞核-胞質蛋白制備試劑盒說明書提取胞質和胞核蛋白，BCA法測定蛋白濃度。制備好的蛋白質樣品經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離，然后轉移到PVDF膜上，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入抗NF-κB(p65)、p-Akt(Ser473)、Akt、p-PI3K(p85)、PI3K、p-IκBα、IκBα、iNOS、COX-2等的一抗(1 ∶1 000, TBST稀釋)，4℃過夜，TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，應用LAS4000化學發(fā)光系統(tǒng)檢測?；叶确治霾捎肣uantity One軟件，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度的比值表示目的蛋白的相對表達。

3結果

3.1去氫丹參新酮對BV2細胞存活率的影響在確定去氫丹參新酮的給藥濃度之前，我們首先明確去氫丹參新酮在BV2細胞上的安全劑量范圍，因此我們采用MTT法觀察去氫丹參新酮對BV2細胞存活率的影響，以確定去氫丹參新酮的無毒劑量范圍。如Fig 2所示，不同劑量的去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)與BV2細胞共孵育24 h后，細胞存活率沒有受到明顯的影響，提示去氫丹參新酮在該劑量范圍下無細胞毒性。因此，后續(xù)實驗中去氫丹參新酮的給藥濃度為1、5、10 μmol·L-1。

Fig 2　Effects of dehydromiltirone on viability of BV2 cells

3.2去氫丹參新酮對LPS刺激的BV2細胞產(chǎn)生NO的影響NO作為細胞內(nèi)重要的信使分子，參與神經(jīng)遞質的釋放和重攝取、神經(jīng)傳導和突觸可塑性等重要的生理過程，但是過量產(chǎn)生的NO也可以引起嚴重的神經(jīng)毒性[6]。Fig 3結果顯示,LPS(1 mg·L-1)與BV2細胞共同孵育24 h可激活小膠質細胞，使NO產(chǎn)生大量增加，而去氫丹參新酮在10 μmol·L-1濃度時可明顯抑制NO的產(chǎn)生，5和1 μmol·L-1濃度時有降低NO的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。

3.3去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-6的影響激活的小膠質細胞釋放過量的炎癥因子是造成神經(jīng)元損傷、導致神經(jīng)功能障礙的主要因素[7]。TNF-α和IL-6是兩類常見的炎癥因子，故本實驗中進一步檢測了去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6的影響。結果如Fig 4所示，對照組BV2細胞中TNF-α、IL-6的分泌量很低，與對照組相比，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細胞后，可使二者的釋放量明顯升高，提示LPS激活了小膠質細胞，產(chǎn)生炎癥反應。同模型組相比，去氫丹參新酮給藥可明顯降低二者的釋放，表明去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生的炎癥因子具有抑制作用。

Fig 3　Effects of dehydromiltirone on nitric

3.4去氫丹參新酮對BV2細胞表面活化標志物的影響巨噬細胞抗原復合體-1(macrophage 1 antigen, MAC-1)是表達于小膠質細胞上的補體受體，由CD11b和CD18兩個亞基組成。MAC-1在活化的小膠質細胞中表達量增加，常作為小膠質細胞活化的標志分子[8]。如Fig 5所示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細胞24 h后，MAC-1蛋白表達明顯增加，表現(xiàn)為綠色熒光明顯增強。提前加入去氫丹參新酮預孵育1 h，能夠明顯抑制MAC-1的表達，鏡下可見綠色熒光強度減弱。該結果表明去氫丹參新酮對LPS引起的小膠質細胞的活化具有一定的抑制作用。

3.5去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞表達iNOS、COX-2蛋白的影響小膠質細胞上表達的多種蛋白均參與小膠質細胞活化后引起的炎癥反應。誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)可由多種炎癥刺激物如LPS和細胞因子等誘導產(chǎn)生，其活性增強和表達增多常作為炎癥反應的標志[9]。環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在炎癥刺激下誘導表達，其催化產(chǎn)生的前列腺素E2也是神經(jīng)炎癥反應過程中的重要因素。實驗結果顯示，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細胞24 h后，iNOS和COX-2蛋白表達明顯增加，提示LPS刺激可引起炎癥蛋白的高表達，而提前加入去氫丹參新酮預孵育，可分別劑量依賴性地抑制LPS引起的iNOS、COX-2表達增加，表現(xiàn)出良好的抑制神經(jīng)炎癥的作用(Fig 6)。

Fig 4　Effects of dehydromiltirone on secretion of cytokines in BV2 cells stimulated by LPS

Fig 5　Effects of dehydromiltirone on

Cells were pretreated with dehydromiltirone for 1 h followed by LPS stimulation for 24 h. CD11b was probed by anti-CD11b antibody and FITC-conjugated secondary antibody. The nuclei were stained by DAPI and the images were captured by confocal microscopy. Bar=20 μm.

3.6去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞NF-κB信號通路激活的影響核轉錄因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信號通路是介導炎癥反應的重要信號通路[10]。為了闡明去氫丹參新酮的抗炎作用機制，我們檢測了去氫丹參新酮對該信號通路的影響。Western blot結果顯示，未經(jīng)LPS處理的BV2細胞內(nèi)IκBα磷酸化水平較低，而LPS(1 mg·L-1)可引起IκBα磷酸化水平明顯增加，胞質中IκBα蛋白的表達水平則無明顯改變，提前1h用去氫丹參新酮(1、5、10 μmol·L-1)預孵育BV2細胞，可以抑制LPS誘導的IκBα的磷酸化水平升高，其中5、10 μmol·L-1的去氫丹參新酮作用較為明顯。對NF-κB p65亞基的研究發(fā)現(xiàn)，LPS(1 mg·L-1)刺激BV2細胞24 h后，胞質中NF-κB p65水平明顯降低，而胞核中NF-κB p65水平明顯提高，表明LPS可引起NF-κB信號通路的活化，使NF-κB p65亞基向核內(nèi)轉移，而去氫丹參新酮可以劑量依賴性地抑制NF-κB p65亞基的核轉位，表明去氫丹參新酮抗炎作用的發(fā)揮與抑制NF-κB信號通路有關(Fig 7)。

3.7去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞PI3K/Akt信號通路的影響NF-κB作為多條炎癥信號通路的共同作用靶點，可被多種上游信號分子激活，其中磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)-絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路不僅在促進細胞增殖、抑制凋亡的過程中發(fā)揮著重要作用，在炎癥反應中也發(fā)揮著重要的作用。已有大量文獻報道PI3K/Akt可以調(diào)控NF-κB信號通路[11]，進而調(diào)控神經(jīng)炎癥，因此我們也檢測了去氫丹參新酮對該信號通路的影響。Fig 8結果顯示,與對照組相比，模型組PI3K和Akt的磷酸化水平明顯升高，表明PI3K/Akt信號通路在LPS的刺激下激活。同模型組相比，去氫丹參新酮可以明顯抑制PI3K和Akt的磷酸化，該結果表明去氫丹參新酮可以通過抑制PI3K/Akt信號通路而減少LPS刺激對核轉錄因子NF-κB的激活，從而減輕炎癥反應。

Fig 6　Effects of dehydromiltirone on LPS-induced

Fig 7　Effects of dehydromiltirone on phosphorylation

Fig 8　Effects of dehydromiltirone on phosphorylation

4討論

本研究表明， 去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生的炎癥因子NO、TNF-α和IL-6具有明顯的抑制作用，對小膠質細胞表面活化標志物MAC-1及炎癥因子蛋白合成酶iNOS和COX-2的表達具有明顯的抑制作用，去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥的活性，其作用機制可能是通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路抑制IκB的磷酸化，進而抑制NF-κB的核轉位而實現(xiàn)的。

丹參在活血化瘀、改善微循環(huán)和抑制血小板聚集等方面有著明確的療效，復方丹參片和復方丹參滴丸等由丹參制成的藥物現(xiàn)廣泛應用于臨床。大量的研究已表明丹參中的丹酚酸類物質是其發(fā)揮心腦血管保護作用的主要成分[12]，但是丹參藥材中代表成分多達幾十種，對丹參中其他活性成分的藥理作用研究具有重要的意義。已有文獻報道，丹參中的丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I等均具有較好的抗炎活性[13]，具有保護神經(jīng)元的作用。去氫丹參新酮在結構上與其他丹參酮類物質相似，但尚未見有關其對神經(jīng)炎癥作用的報道。在本實驗中，我們觀察到去氫丹參新酮對LPS刺激BV2細胞產(chǎn)生的炎癥因子的釋放和炎癥蛋白的表達具有明顯的抑制作用，表明去氫丹參新酮具有很好的抑制神經(jīng)炎癥的作用。

NF-κB是與炎癥及凋亡有關的重要轉錄因子，靜息狀態(tài)下與其抑制子(inhibitor of κB, IκB)結合，以二聚體形式存在于細胞質內(nèi)，激活后，IκB降解，NF-κB從胞質轉移到核內(nèi)，引起相關炎癥因子基因的轉錄和表達，是介導炎癥反應的重要信號通路。已有大量研究表明，核內(nèi)NF-κB的增多和iNOS、IL-1β及TNF-α的表達密切相關[14]。在本實驗中，我們觀察到去氫丹參新酮能抑制LPS誘導的NF-κB p65亞基轉位入核，其變化情況與炎癥因子NO、TNF-α和IL-6及炎癥相關蛋白iNOS和COX-2的變化趨勢基本一致，提示去氫丹參新酮對LPS誘導的炎癥反應的抑制作用至少部分是通過抑制NF-κB的活化來實現(xiàn)的。NF-κB作為多條炎癥信號通路的共同作用靶點，受多種上游信號分子的調(diào)控。PI3K的活化導致磷脂酰激醇的磷酸化，進而激活下游分子Akt，活化的Akt可以激活IκB激酶，從而使NF-κB從細胞質中釋放出來，進行核轉位，激活其靶基因，進而促進多種炎癥因子的表達。PI3K和Akt的磷酸化在LPS刺激后明顯增加，而去氫丹參新酮可以抑制PI3K和Akt的磷酸化，表明去氫丹參新酮可以通過PI3K/Akt信號通路抑制NF-κB的激活，發(fā)揮抗炎作用。

綜上所述，去氫丹參新酮具有很好的抗炎作用，有望成為新型的神經(jīng)保護劑，但其成藥性和作用機制尚需進行更加深入的研究。

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The anti-neuroinflammatory effects of dehydromiltirone and related mechanisms

LI De-chuan, BAO Xiu-qi, ZHANG De-wu, SUN Hua, DAI Jun-gui, ZHANG Dan

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Abstract:AimTo investigate the anti-neuroinflammatory activities of dehydromiltirone and the underlying mechanisms in LPS- stimulated microglial cell line BV2 cells.MethodsBV2 cells were pre-treated with dehydromiltirone, then stimulated by LPS. The levels of nitric oxide(NO) were measured by Griess assay, and the concentrations of pro-inflammatory cytokines were measured by ELISA assay. Confocal fluorescence microscopy was used to measure the expression of MAC-1, the biomarker of activated BV2 cells. The levels ofinducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2), NF-κB and PI3K/Akt were determined by Western blot analysis.ResultsThe treatment of dehydromiltirone significantly inhibited the production of NO, TNF-α and IL-6, attenuated the expression of iNOS and COX-2 protein, and dampened the microglial activation in LPS-stimulated BV2 cells.The mechanistic study revealed that dehydromiltirone inhibited the phosphorylation of PI3K and Akt in LPS-stimulated BV2 cells,and decreased NF-κB activation by suppressing the degradation of IκB.Conclusiondehydromiltirone shows significant anti-neuroinflammatory effects through inhibiting PI3K/Akt phosphorylation and then inhibiting NF-κB signaling pathway.

Key words:dehydromiltirone;neuroinflammation; microglia; NF-κB; PI3K/Akt;lipopolysaccharide

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2016)02-0177-07

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2016.02.007

作者簡介：李德川(1988-)，男，碩士生，研究方向：神經(jīng)炎癥相關的藥物篩選及作用機制，E-mail:lidechuan@imm.ac.cn;張丹(1978-)，女，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向：小膠質細胞和星形膠質細胞所介導的神經(jīng)炎癥在多種疾病發(fā)病以及治療中的作用,通訊作者，E-mail: danzhang@imm.ac.cn

基金項目：國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃)資助項目(No 2011CB504105)；教育部新世紀優(yōu)秀人才(No 3332013128)；北京市科技新星項目(No 2011109)；北京市優(yōu)秀人才(No 2012D0009008000005)

收稿日期:2015-11-12,修回日期:2015-12-11

網(wǎng)絡出版時間：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160125.1557.014.html網(wǎng)絡出版地址：2016-1-25 15:57

◇論著◇