大鼠酒精性肝損害與FTIR光譜相關(guān)性的研究

李石磊

作者單位：　吉林市第二人民醫(yī)院　132011

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大鼠酒精性肝損害與FTIR光譜相關(guān)性的研究

李石磊

作者單位：吉林市第二人民醫(yī)院132011

【摘要】目的本研究將FTIR技術(shù)用于大鼠酒精性肝病理模型檢測，通過譜圖能反映出肝細胞酒精性損害的微小變化，F(xiàn)TIR技術(shù)快速、精確、簡便，可以在分子水平為酒精性肝病的早期診斷提供依據(jù)，為臨床研制開發(fā)酒精性肝病新藥及療效判定提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。方法本實驗通過90只雌雄性Wistar大鼠灌胃40%濃度酒精9ml/kg體重，獲取60例大鼠酒精性肝損害組織和30例正常肝組織標本，應用FTIR光譜儀進行掃描。對獲得的酒精性肝損害組織圖譜應用Spapro2軟件分析，測定參數(shù)包括組織圖譜峰強、峰位、半峰寬，并計算峰強比值。結(jié)果正常肝組織和酒精性肝損傷組織間紅外光譜有統(tǒng)計學差異，光譜技術(shù)檢測的酒精性肝組織同病理學診斷金標準的結(jié)果進行比較，此判別方法的靈敏度和特異度為96.7%。結(jié)論FTIR光譜技術(shù)可以達到快速準確的鑒別酒精性肝損害的目的。

【關(guān)鍵詞】傅里葉紅外光譜技術(shù)染色酒精性肝損害大鼠動物模型

酒精性肝病是一類非常復雜的肝臟損傷病變，它是由長期大量飲酒所引起的。酒精性肝病病理學特點是漸進性肝損害，肝組織和細胞均發(fā)生很大變化，重要的大分子物質(zhì)(包括蛋白質(zhì)、脂類、糖原及核酸等)在含量、構(gòu)型及構(gòu)象方面均出現(xiàn)很大改變，但是相應的臨床表現(xiàn)及影像學表現(xiàn)(主要為CT、磁共振及超聲)不甚明顯，故早期發(fā)現(xiàn)小分子物質(zhì)改變并確診本病是研究重點。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)可以檢出物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、成分等變化，因此可以應用該技術(shù)來檢測細胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類物質(zhì)、糖原及核酸等成分變化情況，從而早期診斷。本研究將FTIR技術(shù)用于大鼠酒精性肝病理模型檢測，通過譜圖能反映出肝細胞酒精性損害的微小變化，F(xiàn)TIR技術(shù)快速、精確、簡便，可以在分子水平為酒精性肝病的早期診斷提供依據(jù)，為臨床研制開發(fā)酒精性肝病新藥及療效判定提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1材料采用酒精灌胃方法。本實驗通過90只雌雄性Wistar大鼠灌胃40%濃度酒精9ml/kg體重，每天給酒2次。觀察大鼠表現(xiàn)及大體變化、一般情況、體重情況及病理超微結(jié)構(gòu)的變化，約8周建立成動物模型。造模組中隨機選出兩只大鼠,觀察其肝組織的病理學改變情況，發(fā)現(xiàn)大量的肝細胞出現(xiàn)小泡性脂肪變性，表明酒精性肝病模型的初步成型。造模成功后，殺鼠，采取血液及肝臟,并制作大鼠肝臟石蠟切片，HE染色分析病理變化。獲取60例大鼠酒精性肝損害組織和30例正常肝組織標本，應用FTIR光譜儀進行掃描。

1.2傅里葉變換紅外光譜(FTIR)分析應用OMNIC軟件進行光譜取。對獲得的酒精性肝損害組織圖譜應用Spapro2軟件分析，測定參數(shù)包括組織圖譜峰強、峰位、半峰寬，并計算峰強比值，1460cm-1是峰強中最穩(wěn)定的譜帶參數(shù)，因而使用此點的峰強進行相對峰強比值的計算。

1.3統(tǒng)計學方法比較兩組各參數(shù)，數(shù)據(jù)資料分析時使用的的軟件為SPSS 19.0，對收集到的呈正態(tài)分布的信息行t檢驗，非正態(tài)分布行Mann.Whitney U檢驗方法，用P<0.05來表示正常肝組織和酒精性肝損傷組織間紅外光譜的差異具有統(tǒng)計學意義。最后得出其敏感性及特異性，并將判別分類結(jié)果同病理金標準進行比較。

2.結(jié)果

2.1正常肝組織和酒精性肝損害組織之間的紅外光譜差異正常情況下，檢測肝組織的核酸分子中磷酸二酯基團(PO-2)的傅里葉紅外光譜，發(fā)現(xiàn)波峰處在1079cm附近，發(fā)生酒精性肝損害后波峰會向高波數(shù)移動約3cm-1，除幅度變大外，相應吸收強度也會增強，這表明發(fā)生酒精化的肝細胞的DNA數(shù)量大大增加；處在1240cm-1附近的波峰也增加波動的幅度，即向高波數(shù)移動了大約3cm-1，相應吸收強度也會增強，這表明發(fā)生酒精化的細胞內(nèi)核酸氫鍵化程度降低。獲得紅外光譜圖后，分別測量正常肝組織和酒精肝損傷組織中糖原和核酸分子的波峰，并分別計算各個組織中糖原和核酸的比值，發(fā)現(xiàn)發(fā)生酒精性損傷后該比值大大減低，這表明酒精化肝細胞中，相對于核酸來說，糖原成分的降低更加明顯。對獲得紅外光譜中蛋白質(zhì)C-O基團的圖譜進行分析，檢測到正常肝細胞的振動峰大約在1164cm-1上，發(fā)生酒精化后，其數(shù)值明顯發(fā)生變化，向高波數(shù)移動約11cm-1，這表明發(fā)生酒精肝損害的肝細胞內(nèi)大多數(shù)的分子間氫鍵均受到影響，遭到破壞。酒精性肝損害肝細胞膜中脂類成分的C-H基團的紅外吸收光譜發(fā)現(xiàn)C-H3和CH2官能團的數(shù)量比例較正常時加大，可能是表明脂質(zhì)的亞甲基鏈出現(xiàn)了結(jié)構(gòu)變化。兩組各吸收峰的峰位對比情況見表1。

表1　兩組各吸收峰的峰位對比情況

2.2判別方法的準確性選取30例FTIR光譜技術(shù)檢測的酒精性肝組織同病理學診斷金標準的結(jié)果進行比較，此判別方法的靈敏度和特異度均為96.7%(見表2)。

表2　組織標本FTIR光譜分析結(jié)果與病理學金標準的比較

3.討論

3.1傅里葉紅外光譜(FTIR)檢測酒精性肝病目前診斷酒精性肝病的輔助檢查手段包括超聲、CT及核磁振成像，其中以超聲應用最為廣泛。但是，超聲雖然操作簡單，可重復性強，但存在一定的局限性，疾病的診斷與圖像質(zhì)量、診斷醫(yī)師以及技術(shù)人員臨床經(jīng)驗密切相關(guān)。基于這一現(xiàn)狀，國內(nèi)外學者就脂肪性肝病的診斷開展了深入研究，目前的研究熱點就是傅里葉紅外光譜。有學者研究表明[1，2]，和NFLD相比，脂肪性肝病中很多的脂肪成分均表現(xiàn)為明顯增高，相應的HDL卻顯著降低。這為傅里葉紅外光譜應用于酒精性肝損害提供了依據(jù)。

本研究發(fā)現(xiàn)對照組磷酸二酯基團對稱性伸縮振動的吸收峰約為1079cm-1，酒精組該吸收峰出現(xiàn)藍移，幅度約3cm-1，同時吸收強度明顯增大。有外國學者稱，肝細胞核中核酸含量高低會影響相應的吸收強度，說明酒精性肝損害細胞核DNA含量大大增加；正常組磷酸二酯基團非對稱性伸縮振動的吸收峰約為1240cm-1，酒精組該吸收峰出現(xiàn)藍移，幅度約3cm-1，這主要是因為損害肝組織中官能團PO-2產(chǎn)生很多氫鍵。酒精性脂肪變后可能會引起磷酸化蛋白分子磷酸單酯中二價陰離子在紅外光譜圖像上的對稱伸縮振動出現(xiàn)改變。對于脂質(zhì)來說，本研究發(fā)現(xiàn)酒精性肝損害后肝組織的脂質(zhì)發(fā)生了巨大變化，并且變化呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，與病理結(jié)果吻合，說明對于酒精性肝病，F(xiàn)TIR光譜可以作為有效的分子診斷手段。

本研究獲得并分析大鼠酒精性肝損害光譜信息，并轉(zhuǎn)換為相應的計量數(shù)據(jù)，從而建立酒精性肝損害的校正模型。在模型確定后進入驗證階段。FTIR技術(shù)主要的操作內(nèi)容有：①測定樣品的硬件信息；②將得到的信息通過特定的軟件換算為計量數(shù)據(jù)，并建立矯正模型；③針對分析任務建立的校正模型。有學者應用顯微紅外光譜法對肝移植患者進行檢測[3]，發(fā)現(xiàn)該方法能在病理檢查顯示正常的非脂肪變性檢測出脂類物質(zhì)的不同密度變化，這說明該方法能夠更加精確地檢測出肝臟組織中細微的化學變化，降低漏診率。有學者采用無創(chuàng)、簡單的檢查方式——近紅外光譜儀來進行采集、處理數(shù)據(jù)，即將數(shù)據(jù)信息轉(zhuǎn)化為歸一化反射率。實驗預測其準確率接近90%。作為全新檢查方式，該技術(shù)具有廣泛和光明的應用前景。光譜技術(shù)可以對不同物質(zhì)進行全面、客觀的定量和定性分析，精確度高，實用性強。

3.2FTIR的優(yōu)勢FTIR的主要優(yōu)點為[4]：①相對于傳統(tǒng)技術(shù)，做到了多通道測量，大大提升信噪比(SNR)：FTIR采用的技術(shù)為對傅里葉變換對光的信號進行處理，所用的光學元件少，避免了電機驅(qū)動棱鏡和光柵光譜儀所帶來的誤差，降低了光的損耗，而且通過干涉進一步增加了光的信號，使得檢測器的輻射強度增大，重現(xiàn)性好，從而做到了高信噪比[5]；②掃描迅速，靈敏度好：傅里葉變換紅外光譜儀是按照全波段進行數(shù)據(jù)采集的，沒有入射和出射狹縫限制，光譜范圍寬，范圍約10000～10cm-1，因而光通量高，完成一次完整的數(shù)據(jù)采集只需要1秒鐘左右，大大提高運作速度及靈敏度，而色散型儀器一次只能測試很窄的頻率范圍，操作時間長，效率低[6]；③精確度高：傅里葉紅外光譜可以檢測出分子中細微訊息[7]；④分辨能力強：可以鑒定出相似度高的分子間的不同；⑤應用范圍廣：設(shè)計到的波段范圍廣，甚至能夠檢測遠紅外光譜[8]；⑥其他：重復性及錯誤率大大降低，周圍不相關(guān)光線的干擾小，應用起來方便，實現(xiàn)了自動化，經(jīng)濟實用。鑒于傅里葉變換紅外光譜儀的眾多優(yōu)勢，目前它已經(jīng)成為紅外光譜儀中應用最為廣泛的儀器，并且在脂肪性肝病的應用方面取得重大進展。

3.3FTIR的局限性與展望雖然FTIR有很大的應用優(yōu)勢,但仍有目前無法突破的不足。傅里葉紅外光譜所得結(jié)果的穩(wěn)定性受到分析儀器、樣本選擇以及操作者的影響。此外，分散性物質(zhì)使用FTIR技術(shù)的效果欠佳。該技術(shù)操作過程中需要耗費很大的精力來建立一個精確的矯正模型，因此操作相對繁瑣，不能得到廣泛應用，僅能作為間接的分析技術(shù)，對于需要經(jīng)常操作的分析也是既經(jīng)濟又方便的方式，但對于偶爾進行的分析或是分散性樣品不太適用。該技術(shù)不適用于痕量分析。測試的靈敏度還是需要提高，要求被測物質(zhì)分子的含量在0.001以上[9]。我國雖然在傅里葉紅外光譜儀的換算方法研究、關(guān)鍵軟件開發(fā)以及在脂肪性肝病的應用研究方面取得了很大的成績,但和國外的先進技術(shù)水平相比，還有很大差距。目前在FTIR最新研究包括FTIR技術(shù)來定量分析微生物二元混合體系的成分，F(xiàn)TIR光譜的一種新的應用CMIA，光纖系統(tǒng)等。雖然目前在傅里葉紅外光譜技術(shù)已經(jīng)取得很大進步，并得到廣泛應用，尤其是在醫(yī)學研究中取得重大成就，但還有很大的探討研究空間。不過，筆者相信，隨著我國技術(shù)的發(fā)展以及學者對于紅外光譜的深入研究,傅里葉紅外光譜分析技術(shù)作為一種經(jīng)濟、實用、方便、快速、有效的分析技術(shù)，在脂肪性肝病的應用上還有很大進步空間。

總之,傅里葉紅外光譜不同于傳統(tǒng)的分析方式，避免了繁瑣的操作,做到了快速自動化，而且方便實用，經(jīng)濟有效,分辨率及信噪比高。相信在學者不懈的努力下，積累經(jīng)驗，接受教訓，提高信息換算方式,FTIR分析技術(shù)運用于醫(yī)學方面，尤其是在酒精性肝損害診斷的深度和廣度上將不斷向前發(fā)展。

參考文獻

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Research Correlation in Rats with Alcoholic Liver Damage and the FTIR Spectrum

(LIShilei.Thesecondpeople’shospitalofjilincity,Jilin132002,China.)

【Abstract】ObjectivesThis research will FTIR technology used in rats with alcoholic liver disease model checking, through the spectrum diagram can reflect the subtle change of alcoholic liver cell damage, FTIR technology is fast, accurate, convenient, can at the molecular level to provide the basis for early diagnosis of ALD, for clinical research and development of ALD drugs provide theory basis. MethodsUsing the ethanol lavage method. This experiment through 90 female male Wistar rats by gastric 40% concentration alcohol 9 ml/Kg weight,for 60 cases of alcoholic liver injury in rats and 30 cases of normal liver tissue samples, using an FTIR spectrometer. For the organization of alcoholic liver damage map application Spapro2 software analysis, determination of parameters including atlas peak, peak, half peak width, and calculate the peak intensity ratio. ResultsCompare two groups of various parameters, to test for normal distribution and non-normal distribution line Mann. Calculate sensitivity and specificity96.7%,discriminant classification results with the pathological gold standard for comparison FTIR. ConclusionsFTIR spectroscopy can achieve rapid, accurate identification of the purpose of the alcoholic liver damage.

【Key words】FTIR, Dye, Alcohol liver disease(ALD)，Animal model, Rats

收稿日期：2016-1-12

作者簡介：李石磊，本科學歷，主要從事腫瘤診斷工作10年，擅長各種腫瘤的診療及防治。

doi:10.3969/j.issn.1672-4860.2016.01.002