托烷類生物堿生物合成機(jī)理及其生物工程研究進(jìn)展

雷天翔,蔡曉劍,王　環(huán),李松齡,沈建偉,周黨衛(wèi)*

(1 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,藏藥研究中心,西寧 810001;3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;4 青海省農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所,西寧 810016)

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托烷類生物堿生物合成機(jī)理及其生物工程研究進(jìn)展

雷天翔1,3,蔡曉劍4,王環(huán)2,李松齡4,沈建偉2,周黨衛(wèi)1,3*

(1 中國(guó)科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西寧 810001;2 中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所,藏藥研究中心,西寧 810001;3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049;4 青海省農(nóng)林科學(xué)院土壤肥料研究所,西寧 810016)

摘要:托烷類生物堿主要包括阿托品、莨菪堿、山莨菪堿、東莨菪堿和樟柳堿,是主要抗膽堿類藥物。解析藥用茄科植物托烷類生物堿合成的分子調(diào)控機(jī)制以及研發(fā)高產(chǎn)托烷類生物堿的植物生物反應(yīng)器一直是近幾年的研究熱點(diǎn)。該文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外有關(guān)托烷類生物堿在不同茄科植物中的合成部位、分子調(diào)控和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)高產(chǎn)托烷類生物堿的發(fā)根生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,并對(duì)可能存在的問題以及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞:托烷類生物堿;分子調(diào)控;發(fā)根;生物反應(yīng)器

植物源藥物廣泛用于治療人類的各種疾病[1]。隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展,人們不僅從植物體獲得了糖類、蛋白質(zhì)、脂類等基本能源物質(zhì),還通過對(duì)植物次生代謝途徑的深入研究,獲得了生物堿、黃酮、醌類等有重要藥用價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。在植物產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物中,生物堿是最大的化合物類群之一。許多成分都具有很強(qiáng)的藥理活性,其中托烷類生物堿是生物堿中研究最活躍的重要領(lǐng)域之一。

托烷類生物堿(tropane alkaloids,TAs)是具有8氮雜雙環(huán)[1-3]辛烷分子骨架的一類化合物(圖1),包括阿托品(atropine)、莨菪堿(hyoscyamine)、山莨菪堿(anisodamine)、東莨菪堿(scopolamine)和樟柳堿(anisodine),是主要抗膽堿類藥物,作用于副交感神經(jīng)系統(tǒng)。其中東莨菪堿的作用與阿托品相似,臨床上用作防暈藥,狂躁性精神病的鎮(zhèn)靜藥[1-2]。近年來臨床研究發(fā)現(xiàn),該化合物在治療一些運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)疾病方面有重要作用[3-4],同時(shí)也作為戒毒藥物用于治療海洛因成癮者以及具有明顯的抗抑郁、抗焦慮作用[5-7]。因此,其市場(chǎng)需求是其它托烷類生物堿的10倍[8-9]。

托品烷類生物堿(tropane alkaloids,TAs)廣泛存在于茄科(Solanaceae)顛茄屬(Atropa)、賽莨菪屬(Scopolia)、山莨菪屬(Anisodus)、天蓬子屬(Atropanthe)、馬尿泡屬(Przewalskia)、泡囊草屬(Physochlaina)和曼陀羅屬(Datura)等植物中,諸如天仙子、唐古特山莨菪、三分三、曼陀羅、顛茄和唐古特馬尿泡等[10-13]。目前,托烷類生物堿的獲取主要依賴野生的植物資源如唐古特莨菪等。盡管,植物是一個(gè)可以不斷再生的體系,但過量的開采和挖掘,常常造成一些野生種的滅絕和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重破壞。托烷類生物堿在野生植物中的含量受環(huán)境影響、資源分布有限以及缺乏對(duì)生物堿合成途徑調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)等問題,皆成為限制托烷類生物堿可持續(xù)高效開發(fā)利用的瓶頸。

在過去的幾十年,植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)被認(rèn)為是研究植物次生代謝產(chǎn)物合成途徑并有效獲得目的產(chǎn)物的主要手段[14]。因此,解析藥用茄科植物托烷類生物堿合成的分子調(diào)控機(jī)制以及在此基礎(chǔ)上研發(fā)高產(chǎn)托烷類生物堿的植物生物反應(yīng)器成為解決該問題的有效手段,目前取得不少重要進(jìn)展[15-22]。本文概述了近年來托烷類生物堿在不同茄科植物中的合成部位、分子調(diào)控和利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研發(fā)高產(chǎn)托烷類生物堿的發(fā)根生物反應(yīng)器的研究結(jié)果。

1托烷類生物堿合成部位及在不同組織中含量的變化

1899年,Dunstan在印度莨菪的根中發(fā)現(xiàn)了莨菪堿[13]。1973年,中國(guó)學(xué)者對(duì)茄科不同種屬植物根中的生物堿含量進(jìn)行了調(diào)查,并發(fā)現(xiàn)托烷類生物堿廣泛存在于不同屬植物根組織中[1]。因此,早期人們認(rèn)為根部是茄科植物合成和積累生物堿的主要器官[13,26]。1980年,鄭光植等通過對(duì)茄科藥用植物三分三的組織培養(yǎng)研究,提出了任何藥用植物細(xì)胞或者組織在離體條件下都具有“母體”那種合成藥用活性成分的能力的觀點(diǎn),表明植物細(xì)胞具有合成托烷類生物堿的全能性[27]。同時(shí),我們課題組對(duì)高山植物馬尿泡的愈傷組織培養(yǎng)的結(jié)果也表明,馬尿泡愈傷組織具有合成托烷類生物堿的全能性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,人們先后從多種植物的不同組織器官中克隆到調(diào)控生物堿合成的關(guān)鍵酶基因。如在顛茄植物中,4個(gè)TAs上游合成途徑基因(ODC,ADC,AIH,CPA)和2個(gè)支路途徑基因(SPDS,TRⅡ) 在顛茄各器官中均有表達(dá),但在須根中高水平表達(dá);3個(gè)TAs合成途徑特異的結(jié)構(gòu)基因(PMT,CYP80F1和H6H)均只在須根中大量表達(dá),主根中其次,結(jié)果表明須根是顛茄TAs生物合成主要器官,而地上幼嫩組織是TAs主要存貯積累器官,TAs合成后存在轉(zhuǎn)運(yùn)過程[25]。對(duì)轉(zhuǎn)H6H基因的顛茄植株研究結(jié)果表明,H6H基因在根的中柱鞘細(xì)胞,花粉的絨氈層細(xì)胞和花粉母細(xì)胞中特異表達(dá)[28]。綜上所述,茄科植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子和愈傷組織都能生產(chǎn)托烷類生物堿,不同植物的相同部位產(chǎn)堿能力有差異,其中根部可能是托烷類生物堿積累的主要部位。

托烷類生物堿在茄科不同植物中的含量明顯不同。早在上世紀(jì)70年代,肖培根院士對(duì)中國(guó)茄科不同種屬植物體內(nèi)的生物堿含量進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明(表1),矮莨菪和馬尿泡的根中有較高含量的莨菪堿和東莨菪堿(3.82%和0.02%),是2種有價(jià)值的原料植物。通過對(duì)唐古特山莨菪的不同種群中所含上述5種生物堿的觀察,發(fā)現(xiàn)此類生物堿在不同植物個(gè)體中的含量存在差異,莨菪堿和山莨菪堿的含量也因產(chǎn)地不同而存在顯著的變化[1]。隨著分析技術(shù)的不斷發(fā)展,人們用高效液相色譜測(cè)定不同植物各組織中托烷類生物堿含量(表1),結(jié)果同樣表明,馬尿泡總生物堿和東莨菪堿的含量是同類植物中最高的,并且與海拔等環(huán)境因素有關(guān)[23]。而對(duì)不同發(fā)育時(shí)期唐古特山莨菪的托烷類生物堿分析結(jié)果表明,發(fā)育時(shí)期對(duì)托烷類的生物堿在植物體內(nèi)積累也產(chǎn)生影響[24]。

圖1　幾種托烷類生物堿的結(jié)構(gòu)

植物名稱Plantspecies組織部位Tissue生物堿含量Tropanealkaloid/%阿托品Atropine莨菪堿Hyoscyamine山莨菪堿Anisodamine東莨菪堿Scopolamine樟柳堿Anisodine參考文獻(xiàn)Reference馬尿泡PrzewalskiatanguticaMaxim.根Root0.0503.8200.6800.0200.020[1]葉Leaf0.1602.1800.6000.0900地下部分Undergroundtissue0.471-0.1490.228-[23]地上部分Upgroundtissue0.131-0.0610.071-山莨菪Anisodustanguticus根Root00.19000.0800.200[1]葉Leaf0.0400.8000.4600.2700.320地下部分Undergroundtissue0.198-0.2630.2400.616[24]地上部分Upgroundtissue0.050-0.1390.0630.400天仙子HyoscyamusnigerL.種子Seed-0.120-0.010-[1]整株Thewholeplant0.018-0.0700.410-[23]顛茄AtropabelladonnaL.根Root-0.159-0.002-老莖Olderstem-0.028-0.004-嫩莖Caulicle-0.336-0.060-老葉Olderleaves-0.030-0.008-[25]嫩葉Spire-0.152-0.060-幼果Fruitlet-0.127-0.003-果萼Systellophytum-0.143-0.103-鈴鐺子Anisodusluridus葉Leaf0.0100.51000.1700[1]西藏泡囊草Physochlainapraealta根Root0.2400.46000.1600[1]葉Leaf00.9200.0700.0400茄參MandragoracaulescensC.B.Clarke根Root-0.130---[1]葉Leaf-0.070---曼陀羅DaturastramoniumLinn.種子Seed0.0720.024---莖Stem0.0130.007---[1]葉Leaf0.0290.020三分三Anisodusacutangulus根Root-++++0++[1]

注:-表示未檢測(cè)項(xiàng)目;+表示低含量;++表示一般含量;+++表示高含量。

Notes:- show undetected type of tropane alkaloids;+ show low content of tropane alkaloids;++ show higher content of tropane alkaloids;+++ show the highest content of tropane alkaloids.

托烷類生物堿在不同植物中不均一的分布規(guī)律目前有兩種假說:一、植物合成生物堿的能力來源于同一祖先,在植物進(jìn)化過程中某些植物合成生物堿的能力逐漸喪失[29];二、托烷類生物堿的合成在植物的不同種屬中有著獨(dú)立的進(jìn)化途徑。研究表明,托烷類生物堿的合成在茄科植物中有著獨(dú)立的進(jìn)化途徑。馬尿泡屬(Przewalskia)近期的研究表明它是現(xiàn)代天蓬子屬(Atropanthe)、山莨菪屬(Anisodus)、賽莨菪屬(Scopolia)、顛茄屬(Atropa)、茄參屬(Mandragora)等類群分支中的最基部類群[30],無疑是古地中海成分在青藏高原隆起后的殘遺特化類群,這表明茄科植物體內(nèi)生物堿含量的差異可能與其功能基因的進(jìn)化適應(yīng)密切相關(guān)。

2托烷類生物堿的合成途徑和分子調(diào)控

目前,對(duì)于托烷類生物堿的合成途徑已經(jīng)研究的較為清楚(圖2[31]),托品烷類生物堿的生物合成起始于鳥氨酸或者精氨酸。主要過程如下:(1)鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)的作用下脫羧生成腐胺[32],或者精氨酸在精氨酸脫羧酶(arginine decarboxylase,ADC)的作用下脫羧生成精氨,然后經(jīng)過一系列未知酶促反應(yīng)生成腐胺[33];(2)腐胺在N-甲基-腐胺轉(zhuǎn)移酶(putrescine N-methyl-transferase,PMT)的催化作用下甲基化形成 N-甲基-腐胺[34];(3)N-甲基-腐胺在二胺氧化酶(diamine oxidase,DAO)的作用下生成 4-氨基-正丁醛并自發(fā)地轉(zhuǎn)化為1-甲基-Δ-吡咯啉正離子,并經(jīng)過一系列未知酶促反應(yīng)生成TAs途徑特有的前體托品酮,這也是托烷類生物堿合成的第一個(gè)限速步驟,PMT是第一個(gè)限速酶,其分子量大小為62.1kD[35-36];(4)托品酮是托品酮還原酶Ⅰ(TRⅠ)和托品酮還原酶Ⅱ(TRⅡ)的底物,托品酮還原酶Ⅰ催化托品酮還原成托品堿,托品酮還原酶Ⅱ催化托品酮還原成假托品,也叫托品醇,假托品是打碗花精的直接前體,只有托品堿才是托烷類生物堿合成的前體。托品酮還原酶Ⅰ和托品酮還原酶Ⅱ分別由273和260個(gè)氨基酸組成,托品酮還原酶并不是托烷類生物堿合成的主要限速步驟,因?yàn)槔眠z傳轉(zhuǎn)化過表達(dá)TRⅠ的基因或者抑制TRⅡ基因的表達(dá)并沒有預(yù)期提高托烷類生物堿的含量[37-38];(5)苯基丙氨酸在一系列酶的催化下生成苯基乳酸,苯基乳酸和托品堿結(jié)合生成Littorine,Littorine在變位酶(CYP80F1)的作用下生成莨菪堿[39];(6)莨菪堿在6-β-羥化酶(H6H)的作用下羥基化形成山莨菪堿,進(jìn)而環(huán)氧化成東莨菪堿[40]。其中,PMT和H6H被認(rèn)為是該合成途徑的主要限速酶。新近研究發(fā)現(xiàn),At-AT4調(diào)控本乳酸調(diào)節(jié)托烷類堿的合成[41]。

ArgDC.精氨酸脫羧酶;OmDC.脫羧酶;PMT.腐胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶;TR.莨菪酮還原酶;H6H.莨菪堿6-羥化酶

3產(chǎn)托烷類生物堿的植物發(fā)根培養(yǎng)體系的建立

野生植株體內(nèi)托烷類生物堿含量低(1%～4%),以莨菪堿為主要生物堿[1]。近年來,大量研究主要集中在利用植物細(xì)胞中和組織培養(yǎng)技術(shù)獲得主要次生代謝產(chǎn)物[14,42]。研究表明,植物次生代謝產(chǎn)物的含量與植物的器官建成和組織分化程度密切相關(guān),未分化的愈傷組織和懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞生產(chǎn)托烷類生物堿產(chǎn)量低,更重要的是懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞遺傳穩(wěn)定性差[43-45]。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物在受傷的地方長(zhǎng)出的不定根被稱之為毛狀根,其體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物的含量比野生植株還高[46-48]。毛狀根與植物正常根相比具有激素自養(yǎng)(由于Ri質(zhì)粒的T-DNA調(diào)節(jié)內(nèi)源激素的平衡)、生長(zhǎng)條件簡(jiǎn)單、多分支、生長(zhǎng)迅速、次生代謝產(chǎn)物含量高且穩(wěn)定以及分化程度高、不易變異等優(yōu)點(diǎn)[49-50]。藥用茄科植物發(fā)根培養(yǎng)體系的建立以及Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因藥用植物的獲得的流程圖(圖3)。

托烷類生物堿主要在藥用茄科植物的根中合成和積累,這為利用植物發(fā)根技術(shù)生產(chǎn)托烷類生物堿提供了理論依據(jù)。目前,大多數(shù)產(chǎn)托烷類生物堿的茄科藥用植物都建立了其發(fā)根誘導(dǎo)及培養(yǎng)體系,詳見表2中總結(jié)了幾種主要藥用茄科植物發(fā)根培養(yǎng)體系。影響植物發(fā)根誘導(dǎo)以及培養(yǎng)的因素主要包括發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、誘導(dǎo)培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基,還有其他條件如預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、浸染時(shí)間、浸染濃度和外源添加物質(zhì)(激素和乙酰丁香酮)[50]。

通過比較不同植物發(fā)根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)條件發(fā)現(xiàn),不同植物和發(fā)根農(nóng)桿菌相互作用具有明顯的特異性,并且對(duì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基具有選擇性。通過比較不同植物發(fā)根中莨菪堿和東莨菪堿的含量,結(jié)果表明,不同植物發(fā)根中各種生物堿的含量有差異,可能發(fā)根合成生物堿的能力依賴于種屬特異性。浸染菌株和培養(yǎng)條件也是導(dǎo)致發(fā)根產(chǎn)堿能力不同的主要原因。發(fā)根農(nóng)桿菌浸染藥用茄科植物提高托烷類生物堿的機(jī)理還不完全清楚,有待于進(jìn)一步研究。

圖3　藥用植物發(fā)根培養(yǎng)體系以及轉(zhuǎn)基因再生植株流程示意圖

植物名稱Plantspecies最適菌株Bacterialstrain誘導(dǎo)培養(yǎng)基Mediumofinduction懸浮培養(yǎng)基Liquidmedium生物堿含量Contentoftropanealkaloids莨菪堿Hyoscyamine東莨菪堿Scopolamine參考文獻(xiàn)Reference天仙子HyoscyamusnigerL.LBA9402MS+B51/2B52.24μg·mL-13.03μg·mL-1[51]MAFF03-01724MS1/2MS12.5mg·g-11.3mg·g-1[52]山莨菪Anisodustanguticus15834LSLS0.2mg·g-11.8mg·g-1[53]A4MS1/2MS0.52mg·g-10.2mg·g-1[52]顛茄AtropabelladonnaL.15834MSMS-0.02%[54]A4MSMS5.61mg·g-12.35mg·g-1[55]曼陀羅DaturastramoniumLinn.LBA9402B5B51205nmol·g-1-[56]A4MSMS6.4mg·g-15.6mg·g-1[57]TR-105B5B50.23%0.07%[58]三分三AnisodusacutangulusC58C1MS1/2MS10.21mg·g-1-[16]日本莨菪Scopoliajaponica15834WhiteHeller13.0mg·g-15.0mg·g-1[59]賽莨菪ScopoliacarnioliaA4LSLS0.2mg·g-10.02mg·g-1[60-61]埃及莨菪HyoscyamusmuticusLBA9402B50B5012.2mg·g-11.0mg·g-1[9]澳洲毒茄DuboisiamyoporoidesHRILSLS8.62.5[62]白莨菪HyoscyamusalbusA4B5B5--[63]毛曼陀羅Daturainnoxia1855B5B55.0mg·g-1-[64-65]白花曼陀羅Daturacandida15834MSMS5.7mg·g-11.1mg·g-1[66]雜種曼陀羅BrugmansiacannidaLBA94021/2B51/2B520-23mg·g-15-10mg·g-1[67]鈴鐺子AnisodusluridusC58C1(Ri)MSMS57.2μg·g-114.7μg·g-1[68]

注:-表示未檢測(cè)項(xiàng),部分發(fā)根中生物堿含量為添加誘導(dǎo)子后獲得。

Note:- show undetected type of tropane alkaloids,moreover,production of tropane alkaloids in some hairy roots induced by elicitor.

通過表2的比較發(fā)現(xiàn),發(fā)根在一定程度上能夠提高植物的產(chǎn)堿能力,但是提高的比例不是很大,同一植物不同單克隆發(fā)根系托烷類生物堿的含量存在差異(如天仙子發(fā)根中東莨菪堿為1.3 mg·g-1,山莨菪發(fā)根中東莨菪堿為1.8 mg·g-1),并且在大多數(shù)植物發(fā)根中仍然以積累莨菪堿為主[69],不能滿足工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)東莨菪堿的要求,這為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)托烷類生物堿的植物發(fā)根培養(yǎng)體系提出了迫切的要求。外源添加物調(diào)節(jié)植物發(fā)根中托烷類生物堿的合成,如添加IAA/NAA將H.muticus發(fā)根中莨菪堿的含量提高了2倍[70-71],添加Cu2+將H.albus發(fā)根中東莨菪堿的含量提高了40%[63],同時(shí)誘導(dǎo)子刺激發(fā)根中托烷類生物堿向培養(yǎng)基中釋放[65]。

4利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育高產(chǎn)東莨菪堿的發(fā)根系

隨著托烷類生物堿合成途徑的不斷深入研究和RACE等分子生物學(xué)基因克隆技術(shù)的不斷發(fā)展,目前該途徑中多個(gè)重要功能基因,包括PMT、TRⅠ、TRⅡ、CYP80F1和H6H等關(guān)鍵酶的基因都已經(jīng)從多種茄科植物中克隆鑒定,表3總結(jié)了托烷類生物堿合成通路主要關(guān)鍵酶基因在不用植物中的克隆情況。1992年,Yun等用葉盤法成功地將H6H基因轉(zhuǎn)入到顛茄中,并獲得轉(zhuǎn)基因植株,后代植株生長(zhǎng)健壯,3個(gè)月后測(cè)得轉(zhuǎn)基因植株內(nèi)東莨菪堿的含量有明顯提高,葉片中東莨菪堿的含量高達(dá)0.6%～1.2%(鮮重),較野生型提高1.5～3倍[78]。利用轉(zhuǎn)基因手段提高東莨菪堿的含量不僅被用于獲得轉(zhuǎn)基因植株,更廣泛地用于轉(zhuǎn)基因發(fā)根中[9]。單個(gè)基因的轉(zhuǎn)化對(duì)提高發(fā)根中東莨菪堿的含量很有限,2004年,唐克軒教授課題組在國(guó)際上首次利用雙基因轉(zhuǎn)化技術(shù)獲得的高產(chǎn)東莨菪堿的的共轉(zhuǎn)基因(PMT基因 和H6H基因)莨菪發(fā)根中東莨菪堿量最高是單轉(zhuǎn)H6H基因發(fā)根中的2倍,而其量高達(dá) 411 mg/L,是當(dāng)前發(fā)根培養(yǎng)體系中托烷類生物堿含量最高的發(fā)根系[15]。轉(zhuǎn)基因發(fā)根高產(chǎn)托烷類生物堿的能力以及高效的生物堿轉(zhuǎn)化能力激起了克隆和鑒定托烷類生物堿合成關(guān)鍵酶基因的研究熱潮。通過對(duì)多種藥用茄科植物托烷類生物堿合成途徑關(guān)鍵酶基因的克隆和功能鑒定發(fā)現(xiàn):(1)不同物種同一基因在氨基酸水平上具有高度相似性,如三分三H6H在氨基酸水平上,與莨菪、顛茄和曼陀羅H6H的相似性分別為 95%、95%和 93%[17,57];(2)同一基因在不同物種之間表達(dá)方式存在差異,如莨菪以及顛茄等其他茄科植物H6H基因只在根部表達(dá)的特征不同,三分三H6H基因在根、莖、葉中均有表達(dá)[17];(3)某些功能基因的表達(dá)水平受外源物質(zhì)的誘導(dǎo),如MeJA可誘導(dǎo)三分三植物轉(zhuǎn)TRⅠ和TRⅡ基因的轉(zhuǎn)基因發(fā)狀根中TRⅠ和TRⅡ的高效表達(dá)[82]。

表3　不同植物托烷類生物堿合成通路關(guān)鍵酶基因的克隆及轉(zhuǎn)基因植物發(fā)根培養(yǎng)體系比較

注:-表示未檢測(cè)項(xiàng)。

Notes:- show undetected type of tropane alkaloids.

托烷類生物堿合成通路關(guān)鍵酶基因的克隆和功能鑒定為研發(fā)高產(chǎn)堿的植物轉(zhuǎn)基因發(fā)根生物反應(yīng)器奠定了基礎(chǔ)。本文總結(jié)了常見產(chǎn)托烷類生物堿的藥用茄科植物轉(zhuǎn)基因發(fā)根生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展(表3)。通過比較不同植物轉(zhuǎn)基因發(fā)根中生物堿的含量發(fā)現(xiàn):(1)托烷類生物堿合成通路關(guān)鍵酶基因在植物轉(zhuǎn)基因發(fā)根中的表達(dá)具有協(xié)同性,如莨菪雙轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東莨菪堿量最高是單轉(zhuǎn)H6H基因發(fā)根中的2倍,比單轉(zhuǎn)基因發(fā)根中東莨菪堿的含量有明顯的提高;(2)同一基因在不同植物的轉(zhuǎn)基因發(fā)根中對(duì)合成托烷類生物堿的影響不同,如在埃及莨菪(HyoscyamusmuticusL.)中過量表達(dá)PMT基因使莨菪堿量提高近5倍[73];而在顛茄中過量表達(dá)PMT基因,莨菪堿量沒有顯著性變化[77],這表明不同植物轉(zhuǎn)基因策略或許不同。

5問題與展望

近年來,托烷類生物堿的合成與分子調(diào)控一直是植物次生代謝領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一[15,68,83,87-89]。經(jīng)過十多年研究,盡管人們已經(jīng)初步了解托烷類生物堿合成的過程,克隆了合成通路的關(guān)鍵酶基因,利用Ri質(zhì)粒介導(dǎo)的共轉(zhuǎn)化技術(shù)建立了生物發(fā)根反應(yīng)器。有效提高了東莨菪堿的含量,并取得了一定的成果[15,18,22,90-92]。但必須看到,目前人們對(duì)于托烷類生物堿的合成通路的了解還相當(dāng)有限,對(duì)底物競(jìng)爭(zhēng)的相關(guān)通路基因還不清楚。近年來,組學(xué)(蛋白質(zhì)組學(xué),轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué))技術(shù)的迅猛發(fā)展可能為托烷類代謝工程的研究帶來新的曙光[88]。結(jié)合功能基因組學(xué)對(duì)托烷類生物堿關(guān)鍵調(diào)控因子和限速酶的解析,可能為發(fā)根基因工程反應(yīng)器的研究提供更好的分子調(diào)控基礎(chǔ)。

植物合成托烷類生物堿的能力受多種因素的影響,主要因素包括關(guān)鍵酶基因的表達(dá)、細(xì)胞的分化、器官建成、物種、地域、生理周期以及非生物脅迫(如冷,干旱脅迫等)。此外,不同物種有著特定的生長(zhǎng)條件,限制了植物資源的馴化種植和資源的研究開發(fā)。目前,藥用茄科植物的少數(shù)種(如天仙子)的組織培養(yǎng)和發(fā)根培養(yǎng)建立了研究器官建成和環(huán)境因子調(diào)控生物堿合成機(jī)理的有效系統(tǒng),為結(jié)合基因工程發(fā)根生物反應(yīng)器提高托烷類生物堿(如東莨菪堿)的含量奠定了一定的基礎(chǔ)。但應(yīng)該看到不同種屬茄科植物的發(fā)根系對(duì)農(nóng)桿菌的敏感性存在差異[93],侵染產(chǎn)生的發(fā)根合成生物堿的能力具有明顯的不同,這可能與不同物種的基因組的進(jìn)化適應(yīng)有關(guān)。因此,探索和開發(fā)高產(chǎn)堿的茄科物種的組培和發(fā)根基因工程體系也是今后托烷類代謝研究的重要方向。

此外,在目前研究中還存在一些問題,如高產(chǎn)堿的發(fā)根系篩選復(fù)雜、現(xiàn)存的細(xì)胞生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)時(shí)剪切力強(qiáng)、發(fā)根易形成愈傷組織等,這些問題均嚴(yán)重阻礙了植物發(fā)根的持續(xù)培養(yǎng)和利用。且復(fù)雜的環(huán)境脅迫無疑會(huì)增加工業(yè)化生產(chǎn)的投入,降低經(jīng)濟(jì)效益。因此,探尋影響托烷類生物堿合成代謝的主要環(huán)境因子,和篩選適宜的懸浮發(fā)根培養(yǎng)體系可能對(duì)解決該問題有一定的幫助。

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(編輯:潘新社)

Progress on Molecular Mechanism of Tropane Alkaloids Synthesis and Plant Bioengineering Research

LEI Tianxiang1,3,CAI Xiaojian4,WANG Huan2,LI Songling4,SHEN Jianwei2,ZHOU Dangwei1,3*

(1 Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota (AEPB),Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001,China;2 Tibetan Medicine Center,Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810001 China;3 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049 China;4 Institute of Soil and Fertilizer,Qinghai Academy of Agriculture and Froestry Sciences,Xining 810016,China)

Abstract:Tropane alkaloids,including atropine,hyoscyamine,anisodamine and scopolamine are important anticholinergic drugs.Insight into molecular regulation mechanism of biosynthesis on tropane alkaloids in some Solanaceae herb and developing plant bioreactor to improve tropane alkaloids producing,especially scopolamine is becoming a hot pot in recent years.In this review,we summarized progress on tropane alkaloids biosynthesis tissues,molecular regulation and bioreactor technology.In addition,we discussed some problems in this field and looked forward its development in the future.

Key words:tropane alkaloids;molecular regulation;hairy root;bioreactor

中圖分類號(hào):Q946.88

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:雷天翔(1990-),男,在讀碩士研究生,主要從事生態(tài)學(xué)方面的研究。E-mail:15297090302@163.com*通信作者:周黨衛(wèi),副研究員,主要從事植物分子生物學(xué)研究。E-mail:dangweizhou@sina.com

基金項(xiàng)目:中國(guó)科學(xué)院“西部之光”人才培養(yǎng)計(jì)劃(Y229151211,Y129331211);國(guó)家自然科學(xué)基金(31070208);中國(guó)科學(xué)院重點(diǎn)創(chuàng)新計(jì)劃((KSCX2-EW-J-26)

收稿日期:2015-10-27;修改稿收到日期:2015-12-29

文章編號(hào):1000-4025(2016)01-0204-11

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.01.0204