底物類型對產(chǎn)甲烷效能及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

王昊昱，陶　彧，任南琪

(城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090 哈爾濱)

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底物類型對產(chǎn)甲烷效能及微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

王昊昱，陶彧，任南琪

(城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090 哈爾濱)

摘要:為考察底物類型對厭氧消化過程的影響，以升流式厭氧膨脹床作為厭氧消化反應(yīng)器，以經(jīng)過“熱-酶聯(lián)合預(yù)水解”后的啤酒糟和豬糞作為處理對象，研究不同有機(jī)負(fù)荷率條件下反應(yīng)器的運(yùn)行效能和微生物群落結(jié)構(gòu).結(jié)果表明，當(dāng)有機(jī)底物類型從啤酒糟轉(zhuǎn)變?yōu)樨i糞后，反應(yīng)器的COD去除率降低40%，甲烷產(chǎn)量減少75%，有機(jī)物甲烷化率降低25%，且出水乙酸質(zhì)量濃度由50 mg/L躍升至3 700 mg/L.同時(shí)，F(xiàn)irmicutes細(xì)菌門的豐度提高約1倍，Bacteroidetes細(xì)菌門的相對豐度則減少約50%；產(chǎn)甲烷菌數(shù)量減少61%，產(chǎn)甲烷菌屬M(fèi)ethanobacterium替代Methanosaeta成為最占優(yōu)勢的古細(xì)菌菌屬.

關(guān)鍵詞:底物類型；有機(jī)負(fù)荷；厭氧消化；升流式厭氧膨脹床；微生物種群結(jié)構(gòu)

在眾多新能源項(xiàng)目中，生物質(zhì)能源因兼顧廢物處理與能源回收而獲得重視[1].許多農(nóng)牧業(yè)有機(jī)廢物，例如秸稈[2]、家畜糞便[3]等，均已被證實(shí)能夠通過中溫或者高溫厭氧消化的方式轉(zhuǎn)變?yōu)樯镔|(zhì)氣體.但是，直接以上述有機(jī)廢物作為底物進(jìn)行厭氧消化的效率往往較低[4]，限制了該技術(shù)的推廣.近年來，發(fā)現(xiàn)對有機(jī)廢物進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理可以大幅提高后續(xù)厭氧消化的效率[5].例如，本團(tuán)隊(duì)曾借助“熱-酶聯(lián)合預(yù)水解法”成功實(shí)現(xiàn)了對啤酒糟和豬糞的預(yù)處理，相比直接處理上述底物，該預(yù)處理方法將厭氧消化的效能提高了5~7倍[6].

對于應(yīng)用規(guī)模的厭氧消化反應(yīng)器，在實(shí)際運(yùn)行過程中往往會(huì)接納不同類型的有機(jī)物.有研究指出，底物類型的轉(zhuǎn)變對厭氧消化過程的影響較大，主要體現(xiàn)在對厭氧消化產(chǎn)甲烷效率[7]以及對微生物種群組成的的影響[8-9].目前關(guān)于底物類型對厭氧消化過程的效能及微生物種群影響方面的報(bào)道較少.本研究以經(jīng)過“熱-酶聯(lián)合預(yù)水解”后的啤酒糟(brewery spent grain hydrolysates，BSGH)和豬糞(pig manure hydrolysates，PMH)為處理對象，以升流式厭氧膨脹床(expanded granular sludge bed，EGSB)作為厭氧消化過程的載體，考察依次以BSGH和PMH作為有機(jī)底物時(shí)EGSB反應(yīng)器的厭氧消化效能，包括化學(xué)需氧量(chemical oxygen demand，COD)的去除情況、揮發(fā)性有機(jī)酸(volatile fatty acids，VFAs)的累積以及產(chǎn)甲烷的效率.此外，借助高通量測序以及定量PCR等分子生物學(xué)手段考察了反應(yīng)器內(nèi)的微生物群落對底物變化的響應(yīng).

1實(shí)驗(yàn)

1.1EGSB反應(yīng)器

EGSB反應(yīng)器主體由雙層玻璃制成(見圖1)，有效容積為3.8 L.利用水浴維持反應(yīng)器內(nèi)的溫度(35±1) ℃.蠕動(dòng)泵P1為進(jìn)水泵，P2為出水回流泵.通過P2高速運(yùn)轉(zhuǎn)實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器內(nèi)的上升流速8 m/h，從而保障反應(yīng)器內(nèi)液體的膨脹狀態(tài).借助置于反應(yīng)器頂部的pH、ORP和銨離子質(zhì)量濃度探頭實(shí)時(shí)監(jiān)測上述3個(gè)指標(biāo)的數(shù)值變化并通過數(shù)據(jù)記錄儀存儲(chǔ)數(shù)據(jù).為了防止極端pH造成反應(yīng)器的不穩(wěn)定，通過酸堿平衡裝置將pH維持在6.9~7.1.具體做法是當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)pH低于6.9時(shí)，利用微量蠕動(dòng)泵向反應(yīng)器內(nèi)滴加0.1 mmol/L的NaOH溶液，當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)pH高于7.1時(shí)，滴加0.01 mmol/L的HCl溶液.采用德國Ritter公司生產(chǎn)的MGC-1 PMMA型氣體流量計(jì)對生物質(zhì)氣體的產(chǎn)生量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測，并借助安捷倫公司生產(chǎn)的HP7890A型氣相色譜檢測生物質(zhì)氣體中甲烷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計(jì)算產(chǎn)甲烷速率.采用某土豆深加工廠污水厭氧處理設(shè)備的成熟顆粒污泥作為接種污泥.

圖1　EGSB反應(yīng)器裝置

1.2底物預(yù)處理過程

采用熱-酶聯(lián)合預(yù)水解方法對啤酒糟和豬糞分別進(jìn)行預(yù)處理，步驟見文獻(xiàn)[6].對啤酒糟的預(yù)處理過程主要包含以下步驟：首先，對啤酒糟在pH 10.7、 90 ℃條件下熱處理4 h；依次采用荷蘭DSM公司生產(chǎn)的Delvolase?蛋白酶(單獨(dú)使用)、Filtrase?NL纖維素水解酶和Bakezyme?ARA10.000半纖維素水解酶(同時(shí)使用)對底物進(jìn)行酶解，具體條件如表1所示；最后，為了排除無機(jī)顆?；螂y降解殘?jiān)鼘罄m(xù)厭氧消化的不利影響，采用瑞士Sefar公司生產(chǎn)的SEFAR TETEX?05-6-456K型聚丙烯網(wǎng)紗對水解后的混合液進(jìn)行過濾并回收濾出液(即BSGH).對豬糞的預(yù)處理過程與啤酒糟的處理過程相似，不同點(diǎn)在于將Delvolase?蛋白酶與Delvozyme?蛋白酶同時(shí)使用.BSGH和PMH底物的主要成分如表2所示.

表1　酶水解過程的最優(yōu)條件

表2　經(jīng)熱-酶預(yù)處理后啤酒糟和豬糞的成分g·kg-1

1.3常規(guī)分析項(xiàng)目與方法

采用德國MERCK公司生產(chǎn)的COD和氨氮質(zhì)量濃度測定試劑盒及TR420/NOVA60型分光光度計(jì)對上述指標(biāo)進(jìn)行檢測.溶解性COD樣品測定前，采用英國Whatman公司生產(chǎn)的Spartan 30型0.45 μm濾膜對樣品進(jìn)行過濾.揮發(fā)酸和甲烷成分的測定分別由配備FID檢測器和TCD檢測器的安捷倫HP7890型氣相色譜完成.上述指標(biāo)的測定過程采用平行樣品測定以減少儀器誤差.總COD去除率、溶解性COD去除率及有機(jī)物甲烷化率的計(jì)算公式如下：

溶解性COD去除率=

式中：COD進(jìn)水、COD出水分別為進(jìn)、出水總COD，g/L；溶解性COD進(jìn)水、溶解性COD出水分別為進(jìn)、出水溶解性COD，g/L；2.66為室溫下單位體積甲烷所對應(yīng)的化學(xué)需氧量系數(shù)；V甲烷為產(chǎn)甲烷體積，L/d；Q為反應(yīng)器的進(jìn)水流量，L/d.

1.4分子生物學(xué)分析方法

為了表征反應(yīng)器污泥中細(xì)菌和古細(xì)菌的數(shù)量及其群落結(jié)構(gòu)，對接種污泥以及第8、34、56和76天的污泥樣品進(jìn)行DNA提取和定量PCR、高通量測序分析.此外，為了考察處于反應(yīng)器不同高度的污泥中細(xì)菌和古細(xì)菌的數(shù)量，在反應(yīng)器運(yùn)行非常穩(wěn)定階段(第56天)從反應(yīng)器上、中、下3個(gè)取樣口分別取樣.

利用美國MoBio實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的MoBioUltraClean細(xì)菌DNA提取試劑盒對污泥樣品進(jìn)行DNA提取，提取后的DNA樣品一部分用于454-焦磷酸高通量測序，另一部分用于定量PCR分析.定量PCR實(shí)驗(yàn)采用美國ABI公司生產(chǎn)的ABI 7500型qPCR分析儀完成，采用的特異性引物如表3所示.引物和SYBR Premix Ex Taq Kit預(yù)混裝試劑盒購自工生物工程(上海)股份有限公司，依照預(yù)混裝試劑盒使用說明書配置反應(yīng)體系.細(xì)菌qPCR分析過程的條件為：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃循環(huán)變性15 s，53 ℃ 退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；古細(xì)菌qPCR分析過程的條件為：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃循環(huán)變性10 s，61 ℃退火復(fù)性30 s，72 ℃延伸45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán).全部定量PCR待測樣品均經(jīng)過3次重復(fù)測定取平均值.另一部分DNA樣品送美國R&T實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行454-焦磷酸測序(羅氏454 GS-FLX系統(tǒng)).選擇Universal正向引物序列U515F (‘5-GTGYCAGCMGCCGCGGTA A-3’)和反向引物序列U1071R (‘5-GAR CTGRCGRCRRCCATG CA-3’)合成Barcode引物，該引物可覆蓋90%以上的細(xì)菌和古細(xì)菌[10].測序結(jié)束后，借助微生物生態(tài)學(xué)集成軟件QIIME(1.7.0版本軟件)對原始文件進(jìn)行后續(xù)生物信息學(xué)分析[11].

表3　qPCR分析采用的特異性引物及其序列

2結(jié)果與討論

2.1底物類型變化對厭氧效能的影響

整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段共持續(xù)76 d，分為兩個(gè)階段.第一階段采用BSGH底物運(yùn)行57 d，第二階段以PMH為底物繼續(xù)運(yùn)行19 d，圖2~6及圖9中標(biāo)記出底物類型轉(zhuǎn)變的日期界限.整體看，第一階段的總COD去除率平均值為85%，溶解性COD去除率平均值為89%，第二階段上述兩個(gè)指標(biāo)的平均值分別為55%和70%，均低于第一階段.通過圖2可以看出，當(dāng)進(jìn)水有機(jī)底物從BSGH轉(zhuǎn)變?yōu)镻MH后，出水的總COD和溶解性COD均升高，即使進(jìn)水總COD由25 g/L降至10 g/L后，出水COD仍高于第一階段的水平.當(dāng)改變有機(jī)底物后，出水總COD和溶解性COD均出現(xiàn)峰值，分別為14.3和7.2 g/L.

圖2　進(jìn)出水COD變化

由圖3可以看出，在實(shí)驗(yàn)的第一階段，施加BSGH底物的有機(jī)負(fù)荷由1.0 kg/(m3d)逐漸提升至10.9 kg/(m3d).隨著有機(jī)負(fù)荷的提高，甲烷產(chǎn)量由0.8 L/d提高至12.1 L/d.在啟動(dòng)的最初10 d左右，有機(jī)物甲烷化率處于不穩(wěn)定期，在60%~70%波動(dòng).但隨著有機(jī)負(fù)荷逐步提升，反應(yīng)器進(jìn)入穩(wěn)定運(yùn)行階段，有機(jī)物甲烷化率平均值達(dá)85%.這意味著在EGSB穩(wěn)定運(yùn)行階段，BSGH中85%的有機(jī)物最終轉(zhuǎn)變?yōu)榧淄?，其余部分則轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞物質(zhì)、CO2或作為電子供體參與其他生化過程.進(jìn)入第二階段后，反應(yīng)器運(yùn)行效果變差，將有機(jī)負(fù)荷由10.9 kg/(m3d)調(diào)低至8 kg/(m3d)，而后進(jìn)一步降低至4 kg/(m3d).在逐步降低有機(jī)負(fù)荷過程中，反應(yīng)器的效能并無恢復(fù)的趨勢，甲烷產(chǎn)量逐步降至3 L/d，有機(jī)物甲烷化率也降至60%左右.

圖3　有機(jī)負(fù)荷、甲烷產(chǎn)量和有機(jī)物甲烷化率變化

由圖4可以看出，當(dāng)轉(zhuǎn)變有機(jī)底物類型時(shí)，反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)明顯的揮發(fā)性有機(jī)酸累積情況，特別是乙酸質(zhì)量濃度從第一階段的低于50 mg/L躍升至3 700 mg/L，同時(shí)丙酸和丁酸也出現(xiàn)不同程度的積累.大幅降低有機(jī)負(fù)荷水平以后，反應(yīng)器內(nèi)的揮發(fā)酸積累情況有所緩解.由于對反應(yīng)器實(shí)施了pH監(jiān)控及平衡措施，反應(yīng)器的pH始終保持在6.9~7.0.值得注意的是，在第二階段揮發(fā)酸積累的同時(shí)，大量的顆粒污泥開始解體并隨出水流失.在第一階段反應(yīng)器內(nèi)的TSS和VSS質(zhì)量濃度為20.0 和21.5 g/L，而第二階段TSS和VSS質(zhì)量濃度下降到8.8和7.4 g/L.不難發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)酸的積累和污泥大量流失的現(xiàn)象伴隨著甲烷產(chǎn)量及有機(jī)物甲烷化率驟減現(xiàn)象同期出現(xiàn)，表明厭氧污泥的性質(zhì)和活性受底物類型轉(zhuǎn)變的影響.微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的變化可能是導(dǎo)致這一現(xiàn)象的內(nèi)因.

圖4　揮發(fā)性有機(jī)酸質(zhì)量濃度變化

2.2底物類型對微生物數(shù)量的影響

反應(yīng)器啟動(dòng)1周后，污泥中細(xì)菌和古細(xì)菌的數(shù)量相比于接種污泥(第0天樣品)均有降低(如圖5所示).隨著系統(tǒng)逐步穩(wěn)定，細(xì)菌和古細(xì)菌數(shù)量逐步升高.第56天從反應(yīng)器上、中、下3個(gè)取樣口分別獲得的樣品(圖5中第56天從左至右依次代表上、中、下取樣口樣品)的分析結(jié)果表明，細(xì)菌和古細(xì)菌的數(shù)量從上至下逐漸升高，反應(yīng)器底部的細(xì)菌和古細(xì)菌數(shù)量分別是頂部數(shù)量的7倍和10倍.當(dāng)轉(zhuǎn)變底物類型后，細(xì)菌的數(shù)量(圖5中第76天樣品)保持穩(wěn)定，但古細(xì)菌的數(shù)量減少61%.由于產(chǎn)甲烷菌占到了古細(xì)菌群落的95%以上，可以推測產(chǎn)甲烷菌數(shù)量因底物類型的轉(zhuǎn)變而大幅降低，這也與同時(shí)期揮發(fā)酸的積累(圖4)和甲烷產(chǎn)量的大幅降低現(xiàn)象(圖3)相關(guān).

由于施加BSGH和PMH底物的有機(jī)負(fù)荷相同，推測最可能造成產(chǎn)甲烷菌數(shù)量驟減的原因是PMH底物中的某些成分抑制了產(chǎn)甲烷菌的活性.對比兩種底物的成分(如表2所示)，PMH中氨氮的質(zhì)量濃度為1.6 g/L，而BSGH中氨氮質(zhì)量濃度僅為0.24 g/L，在有機(jī)負(fù)荷相同的情況下，PMH中氨氮和總氮的質(zhì)量濃度分別是BSGH的16倍和2倍.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，高氨氮往往容易對厭氧消化過程，特別是產(chǎn)甲烷過程產(chǎn)生抑制[12-13].

圖5　細(xì)菌和古細(xì)菌數(shù)量變化

2.3微生物群落結(jié)構(gòu)的變化

EGSB反應(yīng)器中Firmicutes菌門和Bacteroidetes菌門是最占優(yōu)勢的兩個(gè)細(xì)菌菌門(如圖6所示).在接種污泥中，F(xiàn)irmicutes和Bacteroidetes菌門的相對豐度分別為27%和47%，引入BSGH后，F(xiàn)irmicutes菌門的相對豐度逐漸升高至60%，而Bacteroidetes菌門的豐度則降至26%.至第56天時(shí)，二者的相對豐度分別為29%和39%.從不同高度位置的污泥中菌門分布情況看，3個(gè)樣品的優(yōu)勢菌門分布較一致.底物類型的改變對細(xì)菌菌屬分布同樣產(chǎn)生較大影響.如圖7所示，在第一階段占優(yōu)勢的細(xì)菌菌屬為Cytophaga、Clostridium以及Bacillus，它們在該階段的平均相對豐度之和達(dá)35%以上.而三者在第二階段的豐度之和只有27%左右.Eubacterium成為第二階段最占優(yōu)勢的細(xì)菌菌屬，其相對豐度從第一階段的平均1%躍升至第二階段的22%.底物類型的改變同樣對產(chǎn)甲烷菌群產(chǎn)生較大影響.如圖8所示，古細(xì)菌菌屬的分布在第一階段保持相對穩(wěn)定，以Methanosaeta為最優(yōu)勢菌屬，其相對豐度平均值達(dá)77%.轉(zhuǎn)變有機(jī)底物類型后，Methanosaeta的相對豐度大幅減少至45%，同時(shí)Methanobacterium的相對豐度由8%提升至53%.

圖6　反應(yīng)器中細(xì)菌菌門分布

圖7　反應(yīng)器中細(xì)菌菌屬分布

Methanosaeta是嚴(yán)格的乙酸利用型產(chǎn)甲烷菌，而和Methanobacterium則是嚴(yán)格的氫氣利用型產(chǎn)甲烷菌.Wilson等[14]認(rèn)為，高氨氮質(zhì)量濃度對乙酸利用型產(chǎn)甲烷菌的抑制作用強(qiáng)于對氫氣利用型產(chǎn)甲烷菌的抑制作用.因此推測，當(dāng)?shù)孜镛D(zhuǎn)變?yōu)榘钡|(zhì)量濃度極高的PMH后，反應(yīng)器內(nèi)的乙酸利用型產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta受到抑制，數(shù)量也大幅減少(如圖5所示)，導(dǎo)致Methanobacterium的相對豐度提高(如圖8所示).由于乙酸利用型產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta的大量流失，反應(yīng)器內(nèi)產(chǎn)甲烷的途徑發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)菌菌群同樣發(fā)生變化，例如，主要的產(chǎn)乙酸細(xì)菌Cytophaga的豐度降低.由于作為厭氧過程重要中間代謝產(chǎn)物的乙酸分子無法及時(shí)被利用，其他產(chǎn)酸途徑同樣受到抑制，導(dǎo)致丙酸和丁酸等揮發(fā)酸的積累，因此，諸如Clostridium和Eubacterium這類對揮發(fā)酸更耐受的菌屬逐漸占優(yōu)勢(如圖7所示).

圖8　反應(yīng)器中古細(xì)菌菌屬分布

2.4種群的生物多樣性變化

底物類型的改變對微生物群落的生物多樣性影響不明顯.如圖9所示，表征α多樣性中物種豐富度指標(biāo)的Chao1和OS指數(shù)以及表征均勻度與豐富度綜合指標(biāo)的Shannon指數(shù)均比較穩(wěn)定，特別是改變底物類型后上述3個(gè)指標(biāo)未發(fā)生明顯變化.過去的研究表明，厭氧消化系統(tǒng)內(nèi)微生物群落的均勻度比較穩(wěn)定[15]，且一般微生物多樣性指標(biāo)的變化非常緩慢[16]，因而,本研究中反應(yīng)器運(yùn)行的時(shí)間尚不足以造成微生物多樣性產(chǎn)生明顯變化.

圖9　群落的α生物多樣性指標(biāo)變化

3結(jié)論

1)有機(jī)底物類型的變化對厭氧消化反應(yīng)器的運(yùn)行效能產(chǎn)生較大影響，COD去除率降低約40%，甲烷產(chǎn)量減少75%，有機(jī)物甲烷化率降低25%，且反應(yīng)器內(nèi)出現(xiàn)較嚴(yán)重的揮發(fā)酸積累情況，出水中乙酸質(zhì)量濃度由50 mg/L躍升至3 700 mg/L.

2)底物類型的轉(zhuǎn)變導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌數(shù)量大幅減少61%.由于乙酸利用型產(chǎn)甲烷菌Methanosaeta耐受高氨氮質(zhì)量濃度的能力極弱，當(dāng)?shù)孜锔鼡Q為含有較高氨氮的PMH后，Methanosaeta的活性及生長受到抑制，導(dǎo)致產(chǎn)甲烷菌數(shù)量驟減，間接導(dǎo)致產(chǎn)酸菌群紊亂，最終造成反應(yīng)器效能的降低.

3)對于實(shí)際厭氧消化工藝而言，當(dāng)不可避免變更有機(jī)底物類型時(shí)，宜降低底物的有機(jī)負(fù)荷，并嚴(yán)密監(jiān)測系統(tǒng)內(nèi)揮發(fā)酸的積累和甲烷產(chǎn)量等指標(biāo)，以避免因新底物中的某些組分對微生物種群產(chǎn)生抑制而導(dǎo)致反應(yīng)器效能的下降.

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(編輯劉彤)

Impact of organic matter type on the efficiency and microbial community structure of an anaerobic digestion process

WANG Haoyu, TAO Yu, REN Nanqi

(State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment(Harbin Institute of Technology), 150090 Harbin,China)

Abstract:In order to investigate the impact of organic matter type on the efficiency and microbial community structure during anaerobic digestion operation, an expanded granular sludge bed (EGSB) was applied to treat brewery spent grain hydrolysates (BSGH) and pig manure hydrolysates (PMH) that were pre-hydrolyzed by specific enzymes under thermophilic conditions. Results showed that after the organic matter of BSGH was altered by PMH, a series decrease of 40%, 75% and 25% was observed for the bulk COD removal, methane production and organic biomethanation rate, respectively. Meanwhile, the acetic acid concentration in the effluent increased from 50 mg/L to 3 700 mg/L. For the microbial community, the abundance of Firmicutes doubled after the substrate type changing, while Bacteroidetes decreased 50% instead. The quantity of methanogens dropped by 61% and the previously most abundant genus Methanosaeta was replaced by Methanobacterium.

Keywords:substrate type; organic loading; anaerobic digestion; EGSB; microbial community structure

中圖分類號(hào):X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0367-6234(2016)02-0009-06

通信作者:任南琪，rnq@hit.edu.cn.

作者簡介:王昊昱(1985—)，女，博士研究生；任南琪(1959—)，男，博士生導(dǎo)師，中國工程院院士.

基金項(xiàng)目:國家水專項(xiàng)(2013ZX07201007).

收稿日期:2015-06-20.

doi：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.002