活性污泥合成聚羥基脂肪酸酯工藝過(guò)程研究進(jìn)展

郭子瑞，黃　龍，陳志強(qiáng)，溫沁雪，任南琪

(城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090 哈爾濱)

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活性污泥合成聚羥基脂肪酸酯工藝過(guò)程研究進(jìn)展

郭子瑞，黃龍，陳志強(qiáng)，溫沁雪，任南琪

(城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))，150090 哈爾濱)

摘要:聚羥基脂肪酸酯(PHAs)是原核微生物在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏的情況下，作為儲(chǔ)備碳源而在細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)的聚合脂類(lèi)物質(zhì)，因其與普通塑料物理化學(xué)性質(zhì)相近且具有良好的降解性和生物相容性等特性，可節(jié)約石化資源，成為生物合成可降解材料研究的熱點(diǎn).近年來(lái)大量研究表明，利用市政污泥的混合菌群合成PHA可以大幅降低成本，有利于PHA合成產(chǎn)業(yè)化發(fā)展及廢物資源化利用.本文總結(jié)了利用活性污泥合成PHA工藝中產(chǎn)PHA混合菌群富集階段和PHA合成階段的相關(guān)研究進(jìn)展.闡明PHA菌群的篩選階段工藝(從厭氧-好氧交替模式到好氧動(dòng)態(tài)排水模式)和PHA積累的工藝過(guò)程(從批次實(shí)驗(yàn)到連續(xù)流)；重點(diǎn)闡述合成PHA的富集和積累階段給料模式的工藝優(yōu)化；并對(duì)合成PHA工藝研究的新思路及現(xiàn)有PHA合成工藝的動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行了總結(jié).基于現(xiàn)有混合菌群合成PHA方法的研究進(jìn)展，對(duì)未來(lái)PHA的研究方向提出建議和展望.

關(guān)鍵詞:聚羥基脂肪酸脂;混合菌群;PHA菌群的富集與合成

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates, 簡(jiǎn)稱(chēng)PHAs) 是由許多原核微生物在營(yíng)養(yǎng)不均衡的生長(zhǎng)條件下，存在于微生物體內(nèi)的一類(lèi)3-羥基脂肪酸組成的高分子生物聚酯.其生理功能是作為微生物體內(nèi)的碳源和能量的儲(chǔ)存物質(zhì).當(dāng)微生物生長(zhǎng)環(huán)境中有過(guò)量的碳源存在而缺乏必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，其體內(nèi)氧化還原失衡，能量和還原當(dāng)量過(guò)剩，微生物需要將過(guò)量的能量?jī)?chǔ)存一起.由于PHA是一種滲透壓惰性的物質(zhì)，在微生物體內(nèi)大量積累也不會(huì)影響到細(xì)胞的滲透壓，是一種理想的儲(chǔ)存載體;而當(dāng)碳源缺乏時(shí)，其他營(yíng)養(yǎng)元素充足，PHA又可以作為碳源被降解利用.PHA具有與傳統(tǒng)石化塑料如聚乙烯、聚丙烯等類(lèi)似的材料學(xué)性質(zhì)，可由碳水化合物、脂肪酸等可再生資源合成，并且在環(huán)境中可以完全降解進(jìn)入自然界生態(tài)循環(huán)，具有替代傳統(tǒng)不可降解塑料的潛力.可用于制造生物可降解的包裝材料、生物可降解和生物相容性醫(yī)用植入材料、可控藥物緩釋載體和各種環(huán)?；ぎa(chǎn)品，如熱熔膠、壓敏膠和水溶膠等，是一種環(huán)境友好型的綠色塑料.目前，生物合成PHA的方法主要有3類(lèi)，即細(xì)菌發(fā)酵法、基因工程法和活性污泥法.前兩種工藝運(yùn)行過(guò)程中要求滅菌消毒，保證發(fā)酵系統(tǒng)無(wú)雜菌存在，工藝成本昂貴.大規(guī)模生產(chǎn)PHA的首要目標(biāo)便是降低生產(chǎn)成本，近年來(lái)，大量研究集中于混合菌群的富集馴化工藝.由于城市污水處理廠(chǎng)的活性污泥可以作為混合菌群的良好來(lái)源，活性污泥利用廉價(jià)碳源合成PHA成為研究熱點(diǎn)[1-3].而且本課題組前期的研究結(jié)果表明，利用活性污泥混合菌群達(dá)到的PHA含量占細(xì)胞干質(zhì)量的比例甚至可超過(guò)部分純菌培養(yǎng)[4-5].通過(guò)污水中的有機(jī)物質(zhì)合成PHA，是利用生物技術(shù)實(shí)現(xiàn)變廢為寶的有效途徑.一方面，通過(guò)反應(yīng)降解了有機(jī)污染物，起到污泥間接減量、污泥資源化的功能，還具有廢水處理、有機(jī)廢物資源化回收等多重功效，從而實(shí)現(xiàn)了環(huán)境保護(hù)這個(gè)大主題.另一方面，將環(huán)境污染物質(zhì)轉(zhuǎn)化為具有良好利用價(jià)值的環(huán)境友好塑料，對(duì)于可持續(xù)發(fā)展具有重大現(xiàn)實(shí)意義.

活性污泥合成PHA的工藝研究中，普遍采用三段式方法：1) 底物準(zhǔn)備階段，制備適于PHA合成的底物，如工業(yè)與農(nóng)業(yè)廢水等含有復(fù)雜底物，需通過(guò)厭氧預(yù)處理將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸以適合微生物吸收利用；2)將活性污泥中的混合菌群進(jìn)行馴化，通常使用底物充盈和饑餓模式(feast and famine，即好氧動(dòng)態(tài)補(bǔ)料, ADF)篩選出能夠合成PHA的菌群；3) 利用第二階段富集出的混合菌群，在限制氮源的情況下實(shí)現(xiàn)PHA在混合菌群細(xì)胞內(nèi)的大量合成，見(jiàn)圖1.三段式工藝的優(yōu)點(diǎn)是混菌不需要對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌處理，不需要對(duì)發(fā)酵過(guò)程嚴(yán)格控制，節(jié)省能量[6].

圖1　三段式工藝流程

其中厭氧酸化過(guò)程(三段式中第一段)普遍采用半連續(xù)或連續(xù)流厭氧混合反應(yīng)器對(duì)原始底物(富含碳水化合物的廢水/廢物)進(jìn)行水解、發(fā)酵，工藝較為成熟，不作為本文討論的重點(diǎn)內(nèi)容.本文對(duì)目前活性污泥合成PHA的工藝研究做一綜述，重點(diǎn)介紹利用混合菌群合成PHA工藝中PHA合成菌群篩選階段(三段式中的第二段)和PHA積累階段(三段式中的第三段)的改進(jìn)及相關(guān)新工藝的研發(fā)進(jìn)展，并簡(jiǎn)述動(dòng)力學(xué)模型在PHA合成工藝優(yōu)化中的應(yīng)用，最后對(duì)現(xiàn)有工藝合成PHA的經(jīng)濟(jì)性能進(jìn)行總結(jié).

1產(chǎn)PHA混合菌群富集階段

活性污泥是污水處理廠(chǎng)常用的污水生物凈化處理主體，是一種具有多種細(xì)菌、原生動(dòng)物、后生動(dòng)物的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng).近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)活性污泥混合菌群中存在有合成PHA能力的菌種，此類(lèi)微生物會(huì)以積累PHA作為一種抗逆機(jī)制，這為低成本合成PHA提供了充足的原材料，是污泥資源化利用的又一個(gè)渠道.在PHA生產(chǎn)過(guò)程中，菌群篩選是最關(guān)鍵的一步，通過(guò)定向的篩選策略獲得穩(wěn)定和高產(chǎn)的PHA菌群是此階段的核心問(wèn)題.

1.1厭氧-好氧工藝

厭氧-好氧活性污泥工藝最早用于上世紀(jì)70年代的污水處理工程，也是最早意識(shí)到在活性污泥中積累PHA的工藝——強(qiáng)化生物除磷(enhanced biological phosphate removal, EBPR).廢水處理工藝中的聚磷菌(PAOs)和聚糖菌(GAOs)是典型具有PHA合成能力的混合菌群，EBPR是這兩類(lèi)微生物在厭氧/好氧交替的條件下進(jìn)行.厭氧階段，以多聚磷酸鹽釋放或糖原的分解提供能量，在廢水中吸收短鏈脂肪酸等有機(jī)底物，以PHA的形式在細(xì)胞內(nèi)貯存碳源；好氧階段，微生物則分解細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)的PHA，通過(guò)氧化磷酸化獲得能量，進(jìn)行自身增殖并攝取環(huán)境中的磷.Chua等[7]提出的厭氧-好氧工藝模型以傳統(tǒng)的活性污泥處理污水為基礎(chǔ)，增加了產(chǎn)PHA馴化環(huán)節(jié)，從而實(shí)現(xiàn)了污水處理與合成PHA的雙重效果，但PHA產(chǎn)量有限，占細(xì)胞干質(zhì)量的31%左右.Serafim[8]與Takabaka等[9]的研究表明，厭氧-好氧交替模式下微生物的代謝機(jī)制也存在多樣性，其中典型的PAOs代謝包括在厭氧階段胞內(nèi)多聚磷酸鹽的分解、胞外磷的釋放、碳源基質(zhì)的攝取和PHA的積累，這種機(jī)制下微生物積累PHA能力較低；而在厭氧階段細(xì)胞處于休眠狀態(tài)，在好氧階段的初期快速吸收外部碳源并完成PHA存儲(chǔ),且在碳源用完后繼續(xù)利用PHA吸收磷的機(jī)制使微生物合成PHA占細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)40%以上.Satoh等[10]對(duì)厭氧-好氧和微氧-好氧工藝進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)前者微生物PHA占細(xì)胞干質(zhì)量的33%，而后者PHA的最大積累量可達(dá)62%.鄭裕東等[11]研究了厭氧-好氧模式下的 PHA 合成，發(fā)現(xiàn)在一般的污水處理中PHA 的含量極少，大部分有機(jī)物在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為糖原、聚磷酯等，PHA 比重較低.當(dāng)通入少量氧氣形成微氧環(huán)境時(shí)，微生物就可以通過(guò)氧化少量有機(jī)物進(jìn)行合成代謝，當(dāng)控制的氧氣量較嚴(yán)格且適當(dāng)時(shí)，微生物傾向于大量積累 PHA.

1.2好氧瞬時(shí)供料(ADF)工藝

通常ADF的運(yùn)行在SBR中進(jìn)行，此工藝是Majone等[12]在1996年首次提出，完全在好氧條件下的工藝合成PHA，稱(chēng)為好氧動(dòng)態(tài)補(bǔ)料(aerobic dynamic feeding，也是充盈饑餓模式，F(xiàn)F).通過(guò)控制反應(yīng)器內(nèi)底物濃度變化，使微生物反復(fù)處于充盈和饑餓的狀態(tài).經(jīng)過(guò)ADF工藝馴化的菌群的特點(diǎn)是微生物會(huì)立刻將底物用于合成PHA, 待碳源匱乏時(shí)分解PHA獲得能源維持細(xì)胞分裂以及生存所需能量.ADF工藝具有微生物代謝路徑明確，且SBR反應(yīng)器容易控制，可以根據(jù)不同供料方式、反應(yīng)周期等做出調(diào)整，對(duì)工藝優(yōu)化參數(shù)調(diào)控效果顯著等優(yōu)點(diǎn)[13]，在近十幾年快速發(fā)展.研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ADF工藝馴化后的混合菌群可達(dá)89%[14]，接近純菌合成PHA的產(chǎn)率，是混菌合成PHA領(lǐng)域熱門(mén)的研究工藝之一.

大量文獻(xiàn)與本課題組前期研究證明，ADF工藝中底物濃度[15-17]與有機(jī)負(fù)荷、碳氮比、充盈和饑餓的周期持續(xù)時(shí)間、污泥停留時(shí)間SRT、充盈和饑餓階段持續(xù)時(shí)間比值、溫度、pH、反應(yīng)器內(nèi)溶解氧含量等均可以作為馴化富集階段工藝優(yōu)化的控制參數(shù)[13-15].Serafim等[8]通過(guò)瞬態(tài)進(jìn)料方法獲得了占細(xì)胞干質(zhì)量達(dá) 78.5%的 PHA ；Cai等[18]使用中溫厭氧產(chǎn)酸相出水進(jìn)行 PHA 的合成試驗(yàn)，通過(guò)動(dòng)態(tài)供料方式實(shí)現(xiàn)了56.5%的 PHA 積累，其中 PHB與PHV比為88∶12，PHA 產(chǎn)率為 310 mg/(g·h). Dionisi等[19]對(duì)動(dòng)態(tài)進(jìn)料過(guò)程中的微生物群落進(jìn)行了 DGGE分析，甲基桿菌科(Methylobacteriaceae)、黃桿菌Flavobacteriumsp.、假絲酵母菌Meganemaperideroedes、陶厄氏菌Thauerasp.是混菌中的 4 種優(yōu)勢(shì)菌.Dionisi等[20]對(duì)不同周期長(zhǎng)度條件下的ADF工藝富集PHA效果進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，較長(zhǎng)周期可起到良好的產(chǎn)PHA菌富集效果，但周期不宜超過(guò)12 h.若微生物底物吸收速率較高，即在單個(gè)周期內(nèi)更小的充盈和饑餓的持續(xù)時(shí)間比值，可得到更強(qiáng)的PHA合成能力.

目前，關(guān)于利用混合菌群富集PHA的研究取得眾多突破性進(jìn)展，多處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，半工業(yè)化規(guī)模和工業(yè)化生產(chǎn)的研究少見(jiàn)報(bào)道.Tamis等[21]采用工業(yè)廢水為底物開(kāi)展了半工業(yè)化的PHA生產(chǎn)，即接種混合菌群到200 L的SBR中對(duì)PHA菌群富集，然后將富集到的菌群投入到200 L的反應(yīng)器中使其單位細(xì)胞內(nèi)的PHA含量最大化，最終其PHA產(chǎn)量為(0.70±0.05) g/g.此產(chǎn)量雖低于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模，對(duì)于實(shí)現(xiàn)利用混合菌群合成PHA的產(chǎn)業(yè)化仍非常重要.

1.3好氧動(dòng)態(tài)排水(ADD)工藝

在ADF工藝合成PHA基礎(chǔ)上，針對(duì)ADF模式在PHA富集階段表現(xiàn)不穩(wěn)定和富集時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的問(wèn)題[14,22]，本課題組開(kāi)展了PHA富集階段的優(yōu)化研究，即好氧動(dòng)態(tài)排水工藝(aerobic dynamic discharge，ADD)，見(jiàn)圖2.研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物具有PHA合成能力時(shí)，此類(lèi)菌群占優(yōu)勢(shì)的活性污泥的細(xì)胞會(huì)重于非PHA合成菌群，故沉降性會(huì)增強(qiáng)，即細(xì)胞內(nèi)存儲(chǔ)物含量與沉降性有關(guān)，此結(jié)論與Rittmann等[23]的研究一致.利用此特點(diǎn)將PHA合成菌與非PHA合成菌通過(guò)沉降性能區(qū)分，從而進(jìn)行合成PHA菌群的快速穩(wěn)定富集.Chen等[24]通過(guò)沉降性對(duì)污泥進(jìn)行篩選，稱(chēng)為“物理選擇壓”，通過(guò)長(zhǎng)期的famine階段對(duì)污泥進(jìn)行的篩選稱(chēng)為“生態(tài)選擇壓”.ADD工藝便是在原有ADF生態(tài)選擇壓的基礎(chǔ)上增加了物理選擇壓，增加了對(duì)污泥篩選的力度.反應(yīng)器運(yùn)行30 d左右達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)，與其他條件等同采用ADF工藝的反應(yīng)器相比，ADD工藝運(yùn)行模式下，污泥在充盈階段底物吸收速率更快，且其充盈和饑餓的持續(xù)時(shí)間之比更小，可實(shí)現(xiàn)30 d運(yùn)行后微生物PHA含量占細(xì)胞干質(zhì)量達(dá)74%以上，其在降低污泥混菌馴化的時(shí)間成本方面效果顯著.

圖2　ADD運(yùn)行模式工藝流程

2PHA合成階段

PHA積累階段主要利用馴化階段篩選到的PHA合成菌群進(jìn)行PHA貯存量的提升.此過(guò)程的影響因素包括底物、pH、溫度、有機(jī)負(fù)荷等已有綜述報(bào)道，本文主要針對(duì)PHA積累階段進(jìn)料方式進(jìn)行詳細(xì)探討.

2.1批次試驗(yàn)工藝

采用批次實(shí)驗(yàn)工藝進(jìn)行PHA合成是使得PHA含量最大化的最好方法.然而,細(xì)胞生長(zhǎng)和PHA積累需要保持平衡，以避免PHA積累不完全導(dǎo)致其含量偏低.由于PHA 菌群的特性是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)受限條件下會(huì)促使細(xì)胞吸收底物合成PHA，在批次試驗(yàn)中，許多研究均采取比馴化階段更高有機(jī)負(fù)荷但不含營(yíng)養(yǎng)成分的底物，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)溶解氧.當(dāng)溶解氧突然躍增即表示底物基本消耗完成，此時(shí)沉淀并去除上清液，繼續(xù)投加底物，即保證微生物始終在碳源充足的環(huán)境中生存，以令其達(dá)到細(xì)胞內(nèi)合成PHA含量的極限[19].Katrcoglu等[25]通過(guò)監(jiān)測(cè)溶解氧和限制氮源來(lái)進(jìn)行PHA合成，在生物生長(zhǎng)階段不限制氮源，監(jiān)測(cè)溶解氧變化；后續(xù)PHA合成階段限制氮源供給，其最大生物增長(zhǎng)速率可達(dá)0.265 h-1.Johnson從已穩(wěn)定運(yùn)行4年的SBR反應(yīng)器中取泥，投加比SBR反應(yīng)器中高5.5倍濃度的乙酸碳源，持續(xù)批次運(yùn)行12 h得到最大PHA產(chǎn)量為89%細(xì)胞干質(zhì)量，此項(xiàng)研究表明利用混菌合成PHA近乎接近純菌生產(chǎn)PHA的水平.

2.2連續(xù)補(bǔ)料工藝

如2.1所述，大部分研究者認(rèn)為批次補(bǔ)料的模式加入底物可以克服底物的抑制作用，然而Albuquerque等[1]認(rèn)為，以上模式會(huì)使PHA產(chǎn)率降低，因?yàn)檫M(jìn)行批次補(bǔ)料會(huì)中斷反應(yīng)進(jìn)行，導(dǎo)致反應(yīng)過(guò)程受阻而消耗掉部分PHA，于是首先嘗試在PHA積累階段進(jìn)行批次補(bǔ)料試驗(yàn)與連續(xù)補(bǔ)料工藝對(duì)微生物合成PHA能力的對(duì)比.結(jié)果顯示，采用連續(xù)流工藝后，微生物在PHA積累階段始終處于底物濃度穩(wěn)定豐富狀態(tài)，底物比吸收速率和PHA比合成速率均比采用批次試驗(yàn)的污泥高.經(jīng)過(guò)6 h的試驗(yàn)后，采用連續(xù)流工藝的反應(yīng)器內(nèi)微生物最大PHA含量為72%，高于采用批次試驗(yàn)的65%.而且由于連續(xù)流工藝中，當(dāng)采用混合酸作為底物時(shí)，混合酸中各成分比例在PHA積累過(guò)程中保持一致，使得PHA最終產(chǎn)物中HB與HV比率僅與細(xì)胞對(duì)各組分底物吸收速率的不同有關(guān)，這為通過(guò)調(diào)控底物成分定向控制PHA產(chǎn)物成分提供了可能.然而，Serafim等[8]針對(duì)連續(xù)補(bǔ)料和分批補(bǔ)料有不同的結(jié)論.將碳濃度為180 mmol/L的乙酸分2種方式加入到反應(yīng)器中，即連續(xù)補(bǔ)料和分批次補(bǔ)料模式.當(dāng)批次補(bǔ)料時(shí)，將乙酸按碳濃度60 mmol/L分3次加入.加入控制點(diǎn)由溶解氧(DO)控制，通過(guò)對(duì)底物被耗盡時(shí)微生物進(jìn)行檢測(cè)獲得了相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.連續(xù)補(bǔ)料合成的PHA占細(xì)胞干質(zhì)量的比例為56.2%，而分批次加入的比例可達(dá)78.5%.因此，Serafim認(rèn)為通過(guò)對(duì)DO的控制、底物分批次加入消除了高濃度帶來(lái)的抑制作用，還大大提高了PHA占細(xì)胞干質(zhì)量的比例.

已有的PHA批次合成工藝在PHA含量上均取得了可觀的結(jié)果，但是工藝底物利用效率(微生物凈底物攝取量/供給反應(yīng)體系的總底物量)偏低的問(wèn)題并未引起足夠的關(guān)注.另外，產(chǎn)PHA混合菌群在利用以小分子有機(jī)酸為主要成分的底物時(shí)，會(huì)出現(xiàn)反應(yīng)液pH上升的現(xiàn)象，這是由于微生物在攝取游離酸分子時(shí)引起了反應(yīng)體系內(nèi)相應(yīng)酸水解平衡向生成氫氧根離子一側(cè)的移動(dòng).陳志強(qiáng)等[24]采用改進(jìn)的連續(xù)補(bǔ)料工藝(如圖3所示)，直接使用pH未調(diào)節(jié)(5.0)的廢糖蜜酸酵解產(chǎn)物進(jìn)行補(bǔ)料，在較低的生物量負(fù)荷(biomass loading rate，BLR)條件下，反應(yīng)體系達(dá)到了酸堿自平衡狀態(tài)，在獲得較高PHA合成量(70.4%)的同時(shí)大幅度提升了工藝的底物利用效率.該工藝在底物制備、運(yùn)行效率上均具備成本優(yōu)勢(shì)[26].

圖3　PHA合成階段主要工藝模式

3其他PHA合成菌富集工藝

與傳統(tǒng)的三段式不同，Rhu等[27]所采用PHA的合成流程是將微生物的富集馴化和PHA的合成在物理上是一體的，即使用同一種反應(yīng)器，在時(shí)間上分為富集馴化和PHA合成，其運(yùn)行方式最大可以積累PHA的量占細(xì)胞干質(zhì)量的51%，PHA 的組分主要是 PHB和PHV.兩段式 PHA 合成工藝具有操作簡(jiǎn)易及PHA產(chǎn)能可預(yù)知的優(yōu)點(diǎn)，并且能夠抗負(fù)荷波動(dòng)沖擊.將兩段式工藝與剩余污泥定向產(chǎn)酸耦合，則能夠在碳源利用和菌群富集兩個(gè)階段均實(shí)現(xiàn)污泥減量，有廣闊的應(yīng)用前景.陳瑋等[28-29]提出了一種快速馴化污泥利用小分子有機(jī)酸合成聚羥基烷酸脂PHA的工藝，同樣將PHA合成菌群的馴化與富集在一個(gè)反應(yīng)器中完成.通過(guò)逐步減少氮、磷元素和一次性削減50%氮、磷元素對(duì)馴化結(jié)果進(jìn)行考察，前者PHA的產(chǎn)率提升速度較慢，但反應(yīng)器穩(wěn)定期較長(zhǎng)，后者PHA產(chǎn)率提升很快但穩(wěn)定期較短.研究成果可以起到間接的污泥過(guò)程減量作用，同時(shí)令高濃度有機(jī)廢水得到資源回收，實(shí)現(xiàn)廢物的循環(huán)利用.課題的研究表明，試驗(yàn)提出的采用兩段式運(yùn)行,通過(guò)逐步減少營(yíng)養(yǎng)元素氮、磷的同步富集和馴化細(xì)菌合成PHA的途徑是可行的.楊雪等[30-31]也采用兩段式工藝，初步探索了污泥水解液合成 PHA 的研究，經(jīng)20多天的富集后 SBR 反應(yīng)器污泥平均 PHA 含量?jī)H為污泥干質(zhì)量的40%～50%.

此外，清華大學(xué)王慧教授課題組[32]提出采用模擬污泥水解液作為碳源，在不限氮、磷條件下從活性污泥中獲取菌群，直接在充盈和饑餓模式進(jìn)一步積累得到微生物的最大PHA含量.通過(guò)控制碳源濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)充盈和饑餓的交替(碳源濃度小于0.25倍初始碳源濃度為判斷進(jìn)入饑餓的標(biāo)準(zhǔn))，每個(gè)周期人工保持饑餓時(shí)長(zhǎng)為3倍的充盈時(shí)長(zhǎng)，每個(gè)周期末通過(guò)離心機(jī)將泥水分離，去除上清液，再重復(fù)向污泥中注入碳源.直到持續(xù)3個(gè)周期的feast階段時(shí)長(zhǎng)、生物量、剩余碳源濃度保持穩(wěn)定，則完成預(yù)處理進(jìn)行批次試驗(yàn).此研究提出的不限氮實(shí)現(xiàn)微生物PHA積累工藝中，人工控制充盈和饑餓的時(shí)長(zhǎng)比例而不是整個(gè)周期長(zhǎng)度，實(shí)際使得污泥經(jīng)歷了200 h左右的famine階段(單周期288 h)，“過(guò)度饑餓”使微生物在重新獲得碳源的同時(shí)大量生長(zhǎng)與貯存PHA作為備用碳源，從而達(dá)到一步獲得62.43%的最大PHA含量的菌群.

4數(shù)值模型與參數(shù)控制

在活性污泥富集并合成PHA的過(guò)程中，往往需要通過(guò)數(shù)學(xué)模型的手段對(duì)微生物微觀代謝過(guò)程進(jìn)行定量的認(rèn)識(shí)，以及對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中難以測(cè)得的運(yùn)行參數(shù)進(jìn)行識(shí)別和評(píng)估，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)混合菌群富集過(guò)程的模擬預(yù)測(cè)，對(duì)反應(yīng)器運(yùn)行機(jī)制進(jìn)行優(yōu)化控制.

4.1代謝模型

ASM3(activated sludge model number 3)是近年來(lái)用于定量描述活性污泥代謝過(guò)程的主要模型之一，以化學(xué)需氧量(COD)為計(jì)量單位，涉及到活性污泥碳氧化過(guò)程和硝化、反硝化過(guò)程，不包括生物除磷.其側(cè)重點(diǎn)從ASM1的水解轉(zhuǎn)向?yàn)橛袡C(jī)物的貯存，因此，也可以用于模擬好氧異養(yǎng)菌吸收底物并存儲(chǔ)PHA的過(guò)程[33].基于微生物在1個(gè)充盈和饑餓交替周期內(nèi)的新陳代謝模型，最早由Aalst于1997年發(fā)表[34]，后經(jīng)不斷完善[35-38]已經(jīng)可以從底物吸收、PHA合成、生物量增殖、PHA降解、細(xì)胞呼吸作用、微生物維持生存等幾個(gè)典型過(guò)程定量分析并預(yù)測(cè)組分隨時(shí)間變化規(guī)律.其中涉及的動(dòng)力學(xué)參數(shù)一方面可體現(xiàn)出產(chǎn)PHA混合菌群的基本性質(zhì)，一方面也是調(diào)控優(yōu)化反應(yīng)器參數(shù)的重要依據(jù).2009年Johnson建立的針對(duì)ADF工藝的混合菌群模型[14]見(jiàn)表1.模型描述了微生物在一個(gè)充盈-饑餓周期內(nèi)的代謝過(guò)程：1)微生物吸收碳源，消耗ATP的同時(shí)合成乙酰輔酶A、二氧化碳和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)；2)PHB的聚合和維持；3)PHB分解過(guò)程；4)細(xì)胞的分解代謝作用；5)氧化與磷酸化作用；6)細(xì)胞生長(zhǎng)與繁殖；以及7)在缺乏底物攝入的情況下，細(xì)胞內(nèi)ATP逐漸減少，處在維持基本生命體征的狀態(tài)，直到ATP基本耗盡.Reis課題組[39]在2012年針對(duì)揮發(fā)性脂肪酸的成分和富集階段的時(shí)長(zhǎng)對(duì)于PHA存貯效率的影響，提出代謝通量分析(metabolicux analysis) 和通量平衡分析(flux balance analysis)，模型表明影響微生物菌群代謝機(jī)制結(jié)果的主要是縮短三羧酸循環(huán)的通量，使得PHA合成量最大化.

表1　活性污泥富集與合成PHA過(guò)程新陳代謝模型

4.2參數(shù)控制

利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)反應(yīng)器多影響因素耦合作用下，各因素對(duì)PHA合成影響的敏感性排名，從而更有利于識(shí)別出反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中的控制參數(shù)[40].利用現(xiàn)代傳感器系統(tǒng)在反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與自動(dòng)控制，可進(jìn)一步完善對(duì)活性污泥富集、合成PHA工藝的優(yōu)化.Serafim等[8]利用Labview軟件，通過(guò)溶解氧(DO)在線(xiàn)監(jiān)測(cè)建立SBR智能補(bǔ)料系統(tǒng).即當(dāng)反應(yīng)器內(nèi)DO迅速上升時(shí)對(duì)其補(bǔ)料，通過(guò)控制補(bǔ)料次數(shù)達(dá)到控制feast持續(xù)時(shí)間，保持famine時(shí)間穩(wěn)定的目的，并在富集階段達(dá)到65%最大PHA含量；在底物消耗的過(guò)程中，隨著有機(jī)酸濃度、氨氮濃度降低(細(xì)胞不吸收氫離子H+和NH4+)，以及在細(xì)胞呼吸作用下產(chǎn)生的CO2會(huì)有一部分合成碳酸氫鹽，均導(dǎo)致反應(yīng)器運(yùn)行過(guò)程中pH的不穩(wěn)定.Tsuge等[41]成功地解決了該問(wèn)題并以pH為指標(biāo)控制微生物內(nèi)環(huán)境為適合其合成PHA的狀態(tài)；在已建立的活性污泥合成PHA模型基礎(chǔ)上，可進(jìn)行大量模擬試驗(yàn)，進(jìn)一步論證復(fù)合酸中各成分對(duì)合成PHA的影響，以及充盈和饑餓的循環(huán)過(guò)程中周期、pH、溫度等影響參數(shù)的敏感性和發(fā)展規(guī)律，并結(jié)合現(xiàn)有的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)設(shè)備實(shí)現(xiàn)反應(yīng)器的自控與優(yōu)化.尤其在更加便攜的熒光光譜設(shè)備發(fā)展的條件下[42-43]，將會(huì)實(shí)現(xiàn)污泥生物量和細(xì)胞PHA含量的在線(xiàn)監(jiān)測(cè)，使建立PHA富集過(guò)程全參數(shù)化控制與優(yōu)化系統(tǒng)成為可能.

5工藝整體經(jīng)濟(jì)性能分析

活性污泥PHA合成工藝的經(jīng)濟(jì)性能可以用工藝末端產(chǎn)品的價(jià)格來(lái)衡量.相較于純菌PHA合成工藝，關(guān)于混合菌群PHA產(chǎn)品價(jià)格分析的研究較少，這主要是由于成型的混菌工藝尚未進(jìn)入規(guī)模化運(yùn)行階段，難以獲得標(biāo)準(zhǔn)的運(yùn)行參數(shù)和條件.陳瑋[28]對(duì)PHA粗提過(guò)程進(jìn)行了經(jīng)濟(jì)性能分析，定義成本即啟動(dòng)馴化合成PHA反應(yīng)器的藥劑費(fèi)按平均的啟動(dòng)+馴化時(shí)間為25 d期間,人工配水馴化所需消耗的配水藥劑的量計(jì)算.而提取成本按馴化階段的藥劑費(fèi)用+提取階段的試劑費(fèi)用計(jì)算.得到的粗提PHA過(guò)程的經(jīng)濟(jì)成本見(jiàn)表2.

表2　提取1 kg PHA粗產(chǎn)品的成本估算

Gurieff等[44]利用食品加工廢水作為底物，使用典型的三段式工藝合成PHA，通過(guò)對(duì)過(guò)程中各碳源物質(zhì)的流向分析，核算出混菌工藝產(chǎn)出PHA產(chǎn)品的價(jià)格，并與市場(chǎng)上商用的聚乙烯以及純菌發(fā)酵PHA的價(jià)格進(jìn)行了比對(duì)(圖4).研究認(rèn)為，由于在廢棄資源利用上帶來(lái)的成本節(jié)約，混菌合成的PHA價(jià)格相較于其他兩者占優(yōu)勢(shì).

圖4混合菌群PHA產(chǎn)品與純菌發(fā)酵產(chǎn)品以及商用高密度聚乙烯的價(jià)格比對(duì)

PHA合成工藝過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性能分析有3個(gè)重要參數(shù)，一是PHA產(chǎn)量的最大化，盡可能將底物消耗完全，底物占其合成PHA成本的50%以上.二是單位體積的PHA生產(chǎn)量，決定了PHA合成的效率.三是PHA純度，即單位細(xì)胞中的PHA含量，在PHA回收過(guò)程中，需要進(jìn)行細(xì)胞破壁和純化.PHA含量直接影響后續(xù)成本，純度越低，提取成本越高.

6結(jié)果與展望

利用活性污泥生產(chǎn)PHA可實(shí)現(xiàn)利用生物可降解材料替代石化塑料從而減輕環(huán)境壓力，同時(shí)實(shí)現(xiàn)污泥減量和廢物資源化，避免其形成二次污染，具有廣闊的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)前景.綜合文獻(xiàn)報(bào)道的研究成果可知，如今基本采用好氧反應(yīng)器充盈與饑餓模式來(lái)進(jìn)行高效的產(chǎn)PHA菌群富集與PHA合成.對(duì)反應(yīng)器的基本調(diào)控參數(shù)優(yōu)化，如周期時(shí)長(zhǎng)、feast持續(xù)時(shí)間、環(huán)境溫度、pH、底物種類(lèi)與濃度、有機(jī)負(fù)荷等已做了大量工作，這些參數(shù)對(duì)微生物環(huán)境影響的認(rèn)識(shí)基本成熟，利用這些成果已經(jīng)可以成功富集出PHA最大含量占細(xì)胞干質(zhì)量90%的混合菌群.然而需要一個(gè)漫長(zhǎng)富集時(shí)間依然是很多文獻(xiàn)中沒(méi)有解決的問(wèn)題，也成為利用活性污泥大規(guī)模合成PHA的商業(yè)化運(yùn)營(yíng)的瓶頸之一.而好氧動(dòng)態(tài)排水(ADD)工藝在原有充盈與饑餓模式的基礎(chǔ)上引入物理選擇壓概念，較好地解決了快速富集的問(wèn)題.然而針對(duì)ADD模式，從運(yùn)行工藝參數(shù)到模型建立機(jī)制研究，仍然有很多需要進(jìn)一步探討的問(wèn)題.此外，通過(guò)對(duì)混合菌群數(shù)值模型的建立，日趨完善的反應(yīng)器自動(dòng)控制系統(tǒng)也將成為研究的熱點(diǎn).實(shí)現(xiàn)高效富集，降低PHA合成工藝運(yùn)行成本，將圍繞廢棄碳源資源化和PHA合成工藝的低成本展開(kāi).

參考文獻(xiàn)

[1] ALBUQUERQUE M G,MARTINO V,POLLET E, et al. Mixed culture polyhydroxyalkanoate (PHA) production from volatile fatty acid (VFA)-rich streams: effect of substrate composition and feeding regime on PHA productivity, composition and properties[J]. Journal of Biotechnol, 2011, 151(1): 66-76.

[2] CHEN H,MENG H, NIE Z, et al. Polyhydroxyalkanoate production from fermented volatile fatty acids: effect of pH and feeding regimes[J]. Bioresource Technology, 2013, 128: 533-538.

[3] CHUAA S M,TAKABATAKE H, SATOH H, et al. Production of polyhydroxyalkanoates (PHA) by activated sludge treating municipal wastewater: effect of pH, sludge retention time (SRT), and acetate concentration in influent[J]. Water Research, 2003, 37(15): 3602-3611.

[4] 陳志強(qiáng), 李云蓓,溫沁雪.利用丁酸合成PHA高效菌株的篩選及搖瓶發(fā)酵特性研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2010,31(3): 828-832.

[5] CHEN Z, LI Y, WEN Q, et al., Biosynthesis of polyhydroxyalkanoate by Gamma proteobacterium WD-3 from volatile fatty acids[J]. Chemosphere, 2011, 82(8):1209-1213.

[6] JIANG Y, MARANG L, KLEEREBEZEM R, et al. Polyhydroxybutyrate production from lactate using a mixed microbial culture[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2011, 108(9): 2022-2035.

[7] CHUA H, YU P, HO L. Coupling of waste water treatment with storage polymer production[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1997, 63(1): 627-635.

[8] SERAFIM L S, LEMOS P C, OLIVEIRA R, et al. Optimization of polyhydroxybutyrate production by mixed cultures submitted to aerobic dynamic feeding conditions[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 87(2): 145-160.

[9] TAKABATAKE H, SATOH H, MINO T, et al. PHA (polyhydroxyalkanoate) production potential of activated sludge treating wastewater[J]. Water Science & Technology, 2002, 45(12):119-126.

[10] SATOH H,IWAMOTO Y, MINO T, et al. Activated sludge as a possible source of biodegradable plastic[J]. Water Science and Technology，1998，38(2)：103-109.

[11]鄭裕東,鐘青華. 厭氧—好氧馴化活性污泥生物合成 PHA 的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2001,14(2): 41-44.

[12]MAJONE M, MASSANISSO P, CARUCCI A, et al. Influence of storage on kinetic selection to control aerobic filamentous bulking[J]. Water Science and Technology, 1996, 34(5/6): 223-232.

[13]陳瑋,陳志強(qiáng),溫沁雪,等. SBR啟動(dòng)方式對(duì)活性污泥合成PHA的影響[J]. 中國(guó)給水排水, 2012,15:85-88.

[14]JOHNSON K, JIANG Y, KLEEREBEZEM R, et al. Enrichment of a mixed bacterial culture with a high polyhydroxyalkanoate storage capacity[J]. Biomacromolecules, 2009,10(4):670-676.

[15]陳志強(qiáng), 鄧毅,黃龍, 等.進(jìn)水底物濃度對(duì)蔗糖廢水產(chǎn)酸合成PHA影響研究[J]. 環(huán)境科學(xué), 2013,34(6):2295-2301.

[16]陳瑋,陳志強(qiáng),溫沁雪,等. COD濃度對(duì)活性污泥合成聚羥基烷酸酯的影響[J]. 中國(guó)給水排水, 2010,21:148-151.

[17]JOHNSON K, KLEEREBEZEM R, LOOSDRECHT VAN M C. Influence of the C/N ratio on the performance of polyhydroxybutyrate (PHB) producing sequencing batch reactors at short SRTs[J]. Water Research, 2010, 44(7): 2141-2152.

[18]CAI M, CHUA H,ZHAO Q, et al. Optimal production of polyhydroxyalkanoates (PHA) in activated sludge fed by volatile fatty acids (VFAs) generated from alkaline excess sludge fermentation[J]. Bioresource Technology, 2009,100(3):1399-1405.

[19]DIONISI D, MAJONE M, VALLINI G, et al. Effect of the length of the cycle on biodegradable polymer production and microbial community selection in a sequencing batch reactor[J]. Biotechnology Progress, 2007, 23(5): 1064-1073.

[20]DIONISI D, MAJONE M, VALLINI G,et al. Effect of the applied organic load rate on biodegradable polymer production by mixed microbial cultures in a sequencing batch reactor[J]. Biotechnology Bioengineering, 2006, 93(1) 76-88.

[22]WEN Q, CHEN Z, WANG C, et al. Bulking sludge for PHA production: energy saving and comparative storage capacity with well-settled sludge[J]. Journal of Environmental Sciences, 2012, 24: 1744-1752.

[23]MCCARTY R B. Environmental biotechnology [M]. New York： Mc Graw Hill, 2001.

[24]CHEN Z, GUO Z, WEN Q, et al. A new method for polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulating bacteria selection under physical selective pressure[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2015, 72: 1329-1334.

[26]CHEN Z, HUANG L, WEN Q, et al. Efficient polyhydroxyalkanoate (PHA) accumulation by a new continuous feeding mode in three-stage mixed microbial culture (MMC) PHA production process[J]. Journal of Biotechnology, 2015,209:68-75.

[27]RHU D H, LEE W H, KIM J Y, et al. Polyhydroxyalkanoate (PHA) production from waste[J]. Water Science & Technology, 2003, 48(8): 221-228.

[28]陳瑋. 利用活性污泥混合菌群合成聚羥基烷酸脂的研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2010.

[29]WEN, Q, CHEN Z Q, TIAN T, et al. Effects of phosphorus and nitrogen limitation on PHA production in activated sludge[J]. Journal of Environmental Sciences, 2010,22(10):1602-1607.

[30]YANG X,DU M, LEE D, et al. Enriching polyhydroxyalkanoates (PHA) producing microorganisms by complex organics from quickly alkaline fermentation liquor[J]. Journal of the Taiwan Institute of Chemical Engineers, 2012, 43(6): 953-957.

[31]YANG X, DU M, LEE D, et al. Enhanced production of volatile fatty acids (VFAs) from sewage sludge by b-cyclodextrin[J]. Bioresource Technology, 2012, 110: 688-691.

[32]JIA Q, WANG H, WANG X. Dynamic synthesis of polyhydroxyalkanoates by bacterial consortium from simulated excess sludge fermentation liquid[J]. Bioresource Technology, 2013, 140: 328-336.

[33]ZHOU M, GONG J, YANG C, et al. Simulation of the performance of aerobic granular sludge SBR using modified ASM3 model[J]. Bioresource Technology, 2013, 127: 473-481.

[34]AALST VAN M A, POT M A, LOOSDRECHT M V, et al. Kinetic modeling of poly (-hydroxybutyrate) production and consumption by paracoccus pantotrophus under dynamic substrate supply[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1997, 55: 773-782.

[35]BEUN J J,VERHOEF E V, LOOSDRECHT VAN M,et al. Stoichiometry and kinetics of poly-beta-hydroxybutyrate metabolism in aerobic, slow growing, activated sludge cultures[J]. Biotechnology Bioengineering, 2000, 67(4): 379-389.

[36]KATJA J, KLEEREBEZEM R, LOOSDRECHT M V. Model-based data evaluation of polyhydroxybutyrate producing mixed microbial cultures in aerobic sequencing batch and fed-batch reactors[J]. Biotechnology Bioengineering, 2009, 104(1): 50-67.

[37]TAMIS J, MARANG L, JIANG Y, et al. Modeling PHA-producing microbial enrichment cultures-towards a generalized model with predictive power[J]. New Biotechnology, 2014, 31(4): 324-334.

[38]FILIPA P. Dynamic metabolic modelling of volatile fatty acids conversion to polyhydroxyalkanoates by a mixed microbial culture[J]. New Biotechnology, 2014, 31(4): 335-344.

[39]PARDELHA F, ALBUQUERQUE M G E, REIS M A M, et al. Flux balance analysis of mixed microbial cultures: application to the production of polyhydroxyalkanoates from complex mixtures of volatile fatty acids[J]. Journal of Biotechnology, 2012, 162(2/3): 336-345.

[40]陳志強(qiáng),郭子瑞,竇克忠,等.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的污泥水解液合成PHA的多參數(shù)敏感性分析[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào), 2013,12:3244-3250.

[41]TSUGE T, TANAKA K, ISHIZAKI A. Development of a novel method for feeding a mixture of L-lactic acid and acetic acid in fed-batch culture of Ralstonia eutropha for poly-D-3-hydroxybutyrate production[J]. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2001, 91(6): 545-550.

[42]TAKAHASHI M B, LEME J, CARICATI C P, et al. Artificial neural network associated to UV/Vis spectroscopy for monitoring bioreactions in biopharmaceutical processes[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering, 2015(1):1-10.

[43]CALVET A, LI B, RYDER A G.A rapid fluorescence based method for the quantitative analysis of cell culture media photo-degradation[J]. Analyticachimicaacta, 2014, 807: 111-119.

[44]GURIEFF N, LANT P. Comparative life cycle assessment and financial analysis of mixed culture polyhydroxyalkanoate production[J]. Bioresource Technology, 2007, 98(17): 3393-3403.

(編輯劉彤)

Advances in polyhydroxyalkanoates synthesis by activated sludge

GUO Zirui, HUANG Long, CHEN Zhiqiang, WEN Qinxue, REN Nanqi

(State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment(Harbin Institute of Technology), 150090 Harbin, China)

Abstract:Polyhydroxyalkanoates (PHA) are biopolymers which can be accumulated by prokaryotic microorganism as intracellular reserve carbon source in the absence of nutrients resource. PHA, being the potential substitute of the conventional plastics due to their similar physical and chemical properties as those petroleum-based traditional plastic as well as good degradability and biocompatibility, would save fossil resources and hence became a hotspot in the biosynthesis of degradable materials research field. Numerous studies in recent years proved that the activated sludge with mixed microbial culture can significantly reduce the costs of PHA synthesis, and further beneficial to the industrialization of PHA synthesis and wastes reclamation. This paper systematically summarized the research progress of activated sludge-based PHA synthesis in the enrichment and accumulation phase, illustrated the PHA enrichment bacteria selection process (from AN/AE mode to aerobic dynamic discharge mode) and accumulation phase (from fed-batch to continuous feeding mode), and emphasized the feeding mode optimization on the PHA enrichment and accumulation phase. Meanwhile, new ideas of research on PHA synthesis and the dynamic model of PHA synthesis were summarized. The paper also proposed some suggestions for the future research focus on the PHA production based on recent research progress on PHA synthesis with mix culture method.

Keywords:polyhydroxyalkanoateds (PHA); mixed cultures; PHA-producing microorganisms′ enrichment and accumulation

中圖分類(lèi)號(hào):X172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):0367-6234(2016)02-0001-08

通信作者:陳志強(qiáng)(1974—)，czqhit@163.com.

作者簡(jiǎn)介:郭子瑞(1985—)，女，博士研究生；陳志強(qiáng)(1974—)，男，教授，博士生導(dǎo)師;任南琪(1959—)，男，博士生導(dǎo)師，中國(guó)工程院院士.

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(51378142);教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(NCET-12-0156);城市水資源與水環(huán)境國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(2015DX10).

收稿日期:2015-06-12.

doi：10.11918/j.issn.0367-6234.2016.02.001