Toll樣受體9基因多態(tài)性與重癥肌無(wú)力相關(guān)性研究

岳耀先，洪 宇，王淑霞，王 琦，張賢軍，高 翔，張 栩，李海峰

?

Toll樣受體9基因多態(tài)性與重癥肌無(wú)力相關(guān)性研究

岳耀先，洪 宇，王淑霞，王 琦，張賢軍，高 翔，張 栩，李海峰

[摘要]目的 探討Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)基因rs352140和rs187084位點(diǎn)多態(tài)性與重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)的相關(guān)性。方法 納入109例MG患者和162例健康體檢者。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶多態(tài)性方法對(duì)TLR9基因rs352140和rs187084位點(diǎn)分型，并在MG組與對(duì)照組、MG各亞組(性別、發(fā)病年齡、胸腺情況、最嚴(yán)重時(shí)Osserman分型、Oosterhuis評(píng)分和激素近期療效)與對(duì)照組、MG各亞組之間比較兩位點(diǎn)等位基因頻率和共顯性、加性、過(guò)顯性遺傳模型下基因型頻率的差異。結(jié)果 TLR9基因rs352140和rs187084位點(diǎn)等位基因頻率和共顯性、加性、過(guò)顯性遺傳模型下的基因型頻率在MG組與對(duì)照組、MG各亞組與對(duì)照組及MG各亞組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論 TLR9基因rs352140和rs187084位點(diǎn)多態(tài)性與重癥肌無(wú)力的易感性、嚴(yán)重程度和激素療效無(wú)相關(guān)性。

[關(guān)鍵詞]重癥肌無(wú)力；Toll樣受體9；基因多態(tài)性

[作者單位]250012山東濟(jì)南，山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(岳耀先，李海峰)；266003山東青島，青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(洪宇，王 琦，張賢軍，高 翔，張 栩)；252600山東臨清，聊城市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王淑霞)

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是由乙酰膽堿受體抗體介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴的自身免疫性疾病[1]，目前認(rèn)為其發(fā)病是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。Toll樣受體9(Toll-like receptor 9，TLR9)是一種模式識(shí)別受體，可以識(shí)別細(xì)菌和病毒DNA中的非甲基化的胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸序列，激活固有免疫反應(yīng)，并通過(guò)促進(jìn)炎性介質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，激活并調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)[2]。近年研究證實(shí)，TLR9激活引起的級(jí)聯(lián)反應(yīng)可打破機(jī)體對(duì)自身抗原的免疫耐受，并促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[3]。近年來(lái)，已對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡[4]、多發(fā)性硬化[5]、克羅恩病[6]等多種自身免疫性疾病患者進(jìn)行了TLR9基因多態(tài)性研究，提示TLR9基因某些位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)與這些疾病的發(fā)病相關(guān)。本研究通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)-限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(polymerase chain reactionbased restriction fragment length polymorphism，PCRRFLP)方法比較MG患者和健康人群TLR9基因rs352140和rs187084位點(diǎn)多態(tài)性，并探索其與MG易感性、嚴(yán)重程度和糖皮質(zhì)激素近期療效的相關(guān)性。

1　資料與方法

1.1臨床資料 2007年1月—2009年6月于青島大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科診治的MG患者共109例，均符合MG的診斷標(biāo)準(zhǔn)[必備條件為典型的骨骼肌無(wú)力癥狀波動(dòng)性、病態(tài)疲勞性、疲勞試驗(yàn)陽(yáng)性和新斯的明試驗(yàn)陽(yáng)性，支持條件為乙酰膽堿受體抗體陽(yáng)性和(或)低頻重復(fù)電刺激波幅遞減＞10%]。患者來(lái)自全國(guó)16個(gè)省，無(wú)MG家族史。對(duì)照組為隨機(jī)選取健康體檢者162例，排除慢性感染疾病和自身免疫性疾病。MG組與對(duì)照組均為漢族，組間及各組內(nèi)人群均無(wú)親緣關(guān)系。入組者均知情同意，且本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。

1.2方法

1.2.1分組及評(píng)分 根據(jù)性別、發(fā)病年齡(＜15歲、15～40歲和＞40歲)[1]、胸腺情況、隨訪1年以上最重時(shí)Osserman分型[7](Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ+Ⅳ型)和最重時(shí)的Oosterhuis評(píng)分[8](0～2分為輕型、3～5分為重型)將患者分成MG組、MG各亞組，健康體檢者為對(duì)照組。研究發(fā)現(xiàn)70%的MG患者發(fā)病1年內(nèi)發(fā)展到最重程度[9]，故對(duì)總病程達(dá)1年以上者才進(jìn)行最嚴(yán)重時(shí)Osserman分型和Oosterhuis評(píng)分的分析。需要行免疫治療者采取統(tǒng)一治療方案，先單獨(dú)用中等劑量[相當(dāng)于按體質(zhì)量0.75～1.00 mg/(kg·d)潑尼松]激素治療，使用重癥肌無(wú)力定量評(píng)分量表于清晨未服溴吡斯的明時(shí)對(duì)患者進(jìn)行絕對(duì)評(píng)分測(cè)量。療效判斷采用相對(duì)評(píng)分，即治療前絕對(duì)評(píng)分與治療后絕對(duì)評(píng)分之差除以治療前絕對(duì)評(píng)分。激素近期療效好是指用上述劑量正規(guī)治療3個(gè)月，相對(duì)評(píng)分＞50%且能穩(wěn)定減量。納入激素療效分析的患者在激素治療前6個(gè)月未使用過(guò)免疫抑制劑和激素，3個(gè)月內(nèi)未使用過(guò)免疫球蛋白。本研究中rs352140位點(diǎn)的部分資料在前期已報(bào)道[10]，作者補(bǔ)充報(bào)道rs187084位點(diǎn)的多態(tài)性，并對(duì)2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡及單倍型分析。

1.2.2基因分型 取乙二胺四乙酸抗凝靜脈血0.5 mL，BioChain[博爾誠(chéng)(北京)科技有限公司]DNA提取試劑盒提取DNA，應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)進(jìn)行基因分型，兩位點(diǎn)引物及內(nèi)切酶信息見表1。PCR條件94℃預(yù)變性5 min、94℃變性30 s、62℃退火1 min、72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，72℃后延伸5 min，置4℃冰箱保存。酶切產(chǎn)物置8%聚丙烯酰胺凝膠以150 V電壓電泳30 min，溴化乙錠染色后進(jìn)行基因型鑒定。為確保分型結(jié)果準(zhǔn)確性，MG組和對(duì)照組中分別選取25例樣本，送上海天昊生物科技有限公司采用SNPscanTM高通量基因分型技術(shù)進(jìn)行分型驗(yàn)證。

表1　rs352140和rs187084位點(diǎn)內(nèi)切酶和引物

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用在線軟件SNPstats[11]進(jìn)行對(duì)照組哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)遺傳平衡檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS 17.0軟件，采用X2檢驗(yàn)或費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn)比較MG組與對(duì)照組、各MG亞組與對(duì)照組以及MG各亞組間最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)的差異，并計(jì)算共顯性、加性和過(guò)顯性遺傳模型下基因型頻率的差異(SNPstats)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Haploview軟件進(jìn)行連鎖不平衡和單倍型分析。激素療效賦值為因變量建立Logistic回歸模型，將可能的影響因素治療前Osserman分型、治療前Oosterhuis評(píng)分、治療前病程、性別、發(fā)病年齡、胸腺情況和基因型進(jìn)入Logistic回歸模型。用PGA軟件計(jì)算統(tǒng)計(jì)效力。

2　結(jié)果

2.1一般情況 兩位點(diǎn)均分型成功者納入分析，MG組106例，男性48例、女性58例，發(fā)病年齡1～81(33.8±19.8)歲；對(duì)照組158例，男性63例、女性95例，年齡17～75(49.9±22.1)歲(表2)。rs352140 和rs187084位點(diǎn)對(duì)照組基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P＞0.05)。質(zhì)控分型結(jié)果與酶切實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。有胸腺影像學(xué)和(或)病理資料者共98例，分為不伴胸腺瘤組和伴胸腺瘤組。隨訪達(dá)1年以上且有詳細(xì)資料的共95例，Osserman分型Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ+Ⅳ型分別為28例、59例和8例；Oosterhuis評(píng)分0～2分和3～5分組分別為55例和40例。共74例納入激素療效分析(個(gè)別病例臨床資料不全)，療效好58例，療效差16例。

表2　MG組和對(duì)照組rs352140、rs187084基因型及等位基因頻率分布[例(%)]

2.2等位基因和基因型頻率 MG組與對(duì)照組等位基因頻率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MG組與對(duì)照組在共顯性、加性和過(guò)顯性遺傳模型下基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

同性別MG組與對(duì)照組等位基因頻率和共顯性、加性、過(guò)顯性遺傳模型下基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；MG各亞組間、MG各亞組與對(duì)照組等位基因頻率和共顯性、加性、過(guò)顯性模型下基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3單倍型及連鎖不平衡分析 連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)間D′=0.83、r2=0.5。rs352140和rs187084共構(gòu)建4種單倍型(表3)，單倍型頻率在MG組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.4統(tǒng)計(jì)效力 本研究樣本量對(duì)于發(fā)現(xiàn)MG組與對(duì)照組單個(gè)等位基因頻率顯著性差異(比值比的值至少為1.5)的統(tǒng)計(jì)效力達(dá)到70%(顯著性水平0.05，雙側(cè)檢驗(yàn))。

表3　MG組與對(duì)照組單倍型頻率(rs352140-rs187084順序)

2.5激素療效影響因素 不同療效患者間等位基因頻率和共顯性、加性、過(guò)顯性遺傳模型下基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。單因素分析發(fā)現(xiàn)治療前的Osserman分型(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ+Ⅲ型)及是否伴有胸腺瘤在不同療效組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.002及P＜0.001)；但性別、發(fā)病年齡、治療前Oosterhuis評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；激素療效好組和療效差組治療前病程中位數(shù)分別為3.0個(gè)月和5.5個(gè)月，四分位數(shù)間距分別為10.3個(gè)月和11.0個(gè)月，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表4。

表4　MG患者基因型、臨床特征與激素療效關(guān)系[例(%)]

Logisitc回歸模型未發(fā)現(xiàn)激素療效與兩位點(diǎn)基因型相關(guān)(P＞0.05)，但發(fā)現(xiàn)合并胸腺瘤是激素短期療效差的危險(xiǎn)因素(P＜0.01)。

3　討論

TLR9是TLR家族的第9個(gè)成員，其受體存在于細(xì)胞內(nèi)，能夠識(shí)別細(xì)菌、病毒DNA保守的GPG結(jié)構(gòu)，激活后可以啟動(dòng)固有免疫，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，并調(diào)節(jié)特異性免疫[2]。TLR受體家族在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。TLR9受體可通過(guò)髓樣分化因子88和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6途徑激活干擾素調(diào)節(jié)因子-7，促進(jìn)α-干擾素分泌，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，激活自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞，誘發(fā)或加重自身免疫性疾病[11]。研究發(fā)現(xiàn)部分MG患者胸腺中存在病毒感染的證據(jù)[12-14]，病毒感染可能是誘發(fā)MG的重要因素[15]，而合并感染也可誘發(fā)和加重MG的臨床癥狀，因此能夠識(shí)別病毒DNA胞嘧啶鳥嘌呤二核苷酸結(jié)構(gòu)的TLR9可能在MG發(fā)病中發(fā)揮作用。人TLR9基因定位于3p21.3，長(zhǎng)度5 kb，包括2個(gè)外顯子，第2個(gè)外顯子是其主要的編碼區(qū)[16]。Tao等[17]于2007年首次發(fā)現(xiàn)亞洲人群中TLR9基因rs352139位點(diǎn)多態(tài)性同系統(tǒng)性紅斑狼瘡的易感性相關(guān)。Lee 等[4]對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡與TLR受體基因的相關(guān)性研究進(jìn)行薈萃分析，提示TLR7和TLR9基因多態(tài)性同亞洲人群的系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。Liao 等[18]發(fā)現(xiàn)rs352140和rs187084兩位點(diǎn)與男性Graves眼病的易感性相關(guān)，在男性Graves眼病患者中，攜帶rs352140 T和rs187084 C等位基因頻率顯著高于對(duì)照組。Etem等[19]發(fā)現(xiàn)rs187084 T等位基因可能是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一個(gè)危險(xiǎn)因素，病例組中攜帶TT純合子的頻率明顯高于健康對(duì)照組。在人類基因組單體型圖數(shù)據(jù)庫(kù)漢族人群數(shù)據(jù)中，rs352140和rs187084位點(diǎn)作為標(biāo)簽覆蓋了整個(gè)基因區(qū)域，因此這2個(gè)位點(diǎn)在TLR9基因的常見位點(diǎn)(MAF＞0.05)中具有一定的代表性。rs187084位于啟動(dòng)子區(qū)，rs352140位于第2個(gè)外顯子區(qū)，其多態(tài)性可能影響TLR9的功能，進(jìn)而參與自身免疫性疾病的發(fā)病過(guò)程。

本研究對(duì)照組中兩位點(diǎn)的基因型和等位基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡。兩位點(diǎn)基因型頻率與PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接的基因圖數(shù)據(jù)中的中國(guó)漢族人群數(shù)據(jù)相近。連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)兩位點(diǎn)間(D′= 0.83、r2=0.50)具有較強(qiáng)連鎖不平衡，也與人類基因組單體型圖數(shù)據(jù)庫(kù)一致。MG組與對(duì)照組等位基因頻率和基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，單倍型的頻率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。MG各亞組與對(duì)照組以及MG各亞組間等位基因頻率和基因型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，提示2個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性可能與MG的易感性及嚴(yán)重程度無(wú)關(guān)。單因素分析中未發(fā)現(xiàn)rs352140和rs187084與激素近期療效相關(guān)，但發(fā)現(xiàn)伴胸腺瘤及治療前Osserman分型與療效存在相關(guān)性。進(jìn)一步行Logistic回歸發(fā)現(xiàn)伴胸腺瘤為激素近期療效差的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與臨床所見[1]相符。

綜上，本研究未發(fā)現(xiàn)TLR9基因rs352140和rs187084位點(diǎn)多態(tài)性與MG的易感性、嚴(yán)重程度和激素短期療效存在相關(guān)性。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Meriggioli MN，Sanders DB.Autoimmune myasthenia gravis:emerging clinical and biological heterogeneity[J].Lancet Neurol，2009，8(5):475-490.

[2]Iwasaki A，Medzhitov R.Toll-like receptor control of the adaptive immune responses[J].Nat Immunol，2004，5(10): 987-995.

[3]Ichikawa HT，Williams LP，Segal BM.Activation of APCs through CD40 or Toll-like receptor 9 overcomes tolerance and precipitates autoimmune disease[J].J Immunol，2002，169(5):2781-2787.

[4]Lee YH，Lee HS，Choi SJ，et al.Associations between TLR polymorphisms and systemic lupus erythematosus:asystematic review and meta-analysis[J].Clin Exp Rheumatol，2012，30(2):262-265.

[5]Ji X，Wang Y，Huang G，et al.TLR3c.1377，TLR9-1486，and TLR9 2848 gene polymorphisms and multiple sclerosis[J].Zhong Nan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2010，35 (2):116-122.

[6]Hong J，Leung E，F(xiàn)raser AG，et al.TLR2，TLR4 and TLR9 polymorphisms and Crohn's disease in a New Zealand Caucasian cohort[J].JGastroenterol Hepatol，2007，22(11): 1760-1766.

[7]Osserman KE，Genkins G.Studies inmyasthenia gravis:review of a twenty-year experience in over 1200 patients [J].Mt Sinai JMed，1971，38(6):497-537.

[8]Skeie GO，Pandey JP，Aarli JA，et al.TNFA and TNFB polymorphisms in myasthenia gravis[J].Arch Neurol，1999，56(4):457-461.

[9]Grob D，Brunner N，Namba T，et al.Lifetime course ofmyasthenia gravis[J].Muscle Nerve，2008，37(2):141-149.

[10]王淑霞，李海峰，孫亮，等.TLR9基因rs352140位點(diǎn)多態(tài)性與重癥肌無(wú)力的關(guān)系[J].中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2010，17(3):183-187.

[11]SoléX，GuinóE，Valls J，et al.SNPStats:a web tool for the analysis of association studies[J].Bioinformatics，2006，22 (15):1928-1929.

[12]Marshak-Rothstein A.Toll-like receptors in systemic autoimmune disease[J].Nat Rev Immunol，2006，6(11):823-835.

[13]Cavalcante P，Maggi L，Colleoni L，et al.Inflammation and epstein-barr virus infection are common features ofmyasthenia gravis thymus:possible roles in pathogenesis[J]. Autoimmune Dis，2011，2011:213092.

[14]Cavalcante P，Barberis M，Cannone M，et al.Detection of poliovirus-infected macrophages in thymus of patientswith myasthenia gravis[J].Neurology，2010，74(14):1118-1126.

[15]Deitiker P，Ashizawa T，AtassiMZ.Antigenmimicry in autoimmune disease.Can immune responses tomicrobial antigens thatmimic acetylcholine receptor act as initial triggers of Myasthenia gravis?[J].Hum Immunol，2000，61 (3):255-265.

[16]Du X，Poltorak A，Wei Y，et al.Three novel mammalian toll-like receptors:gene structure，expression，and evolution[J].Eur Cytokine Netw，2000，11(3):362-371.

[17]Tao K，F(xiàn)ujii M，Tsukumo S，et al.Genetic variations of Toll-like receptor 9 predispose to systemic lupus erythematosus in Japanese population[J].Ann Rheum Dis，2007，66 (7):905-909.

[18]LiaoWL，Chen RH，Lin HJ，et al.Toll-like receptor gene polymorphisms are associated with susceptibility to Graves' ophthalmopathy in Taiwan males[J].BMC Med Genet，2010，11:154.

[19]Etem EO，Elyas H，Ozgocmen S，et al.The investigation of toll-like receptor 3，9 and 10 gene polymorphisms in Turkish rheumatoid arthritis patients[J].Rheumatol Int，2011，31(10):1369-1374.

·資 訊·

Correlation between Toll-like receptor 9 gene polymorphism and m yasthenia gravis

YUE Yaoxian1，HONG Yu2，WANG Shuxia3，WANG Qi2，ZHANG Xianjun2，GAO Xiang2，ZHANG Xu2，LIHaifeng1
(1.Department of Neurology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan Shandong 250012，China；
2.Department of Neurology，Affiliated Hospital of Qingdao University，Qingdao Shandong 266003，China；3.Department of Neurology，the Second People's Hospital of Liaocheng，Linqing Shandong 252600，China)

[Abstract]Objective To investigate the correlation between Toll-like receptor 9(TLR9) polymorphism and the susceptibility，severity and short-term effect of glucocorticoid in myasthenia gravis(MG)patients.M ethods One hundred and nine MG patients and 162 healthy controls in Han Chinese population were enrolled.Subgroupswere divided by gender，onset age，thymoma status，Osserman type，Oosterhuis score and short-term effect of glucocorticoid.Rs352140 and rs187084 were genotyped by polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method.Allele frequencies and genotype frequencies(under codominant，logadditive and over-dominantmode of inheritance)were compared between MG/control group，MG subgroups/control group and each pairs of MG subgroups.Results In rs352140 and rs187084，there were no significant differences in allele frequencies and genotype frequencies(under codominant，log-additive and over-dominant mode of inheritance)among MG/control group，MG subgroups/control group and MG subgroups(P＞0.05).Conclusion No correlation was found between rs352140 and rs187084 polymorphisms and the susceptibility，severity and short-term effectof glucocorticoid in myasthenia gravis patients.

[Key words]Myasthenia gravis；Toll like receptor 9(TLR9)；Gene polymorphism

(收稿日期:2015-12-18 本文編輯:徐海琴)

[通訊作者]李海峰，E-mail:drlhf@163.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81070963)；山東省自然科學(xué)基金資助(ZR2010HM019)

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.005

[中圖分類號(hào)]R746.1；Q343.1

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]B

[文章編號(hào)]2095-3097(2016)01-0019-05