復(fù)方曲肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚曉昆

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復(fù)方曲肽對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩，俞英欣，任 明，戚曉昆

[摘要]目的 研究復(fù)方曲肽對(duì)大鼠缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組、大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注(middle cerebral artery occlusion reperfusion，MCAO/R)組及MCAO/R+復(fù)方曲肽[MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)]組3組(每組10只)。缺血1 h再灌注23 h后，各組取6只動(dòng)物接受神經(jīng)功能評(píng)分后進(jìn)行MRI檢查，隨后處死行2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色檢測(cè)腦梗死體積；各組另4只動(dòng)物處死，免疫蛋白印跡檢測(cè)缺血半暗帶中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1 (cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8的表達(dá)。結(jié)果 MCAO/R組術(shù)后動(dòng)物均出現(xiàn)了腦梗死病灶及神經(jīng)功能的損傷，復(fù)方曲肽治療可減小腦梗死體積并改善神經(jīng)功能。MCAO/R組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達(dá)顯著高于NC組(P＜0.05)，MCAO/R+TC組Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達(dá)低于MCAO/R組(P＜0.05)。結(jié)論 復(fù)方曲肽對(duì)缺血再灌注損傷具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制與復(fù)方曲肽抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)從而達(dá)到抗凋亡作用有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]腦缺血；復(fù)方曲肽；細(xì)胞凋亡；2，3，5-三苯基氯化四氮唑

[作者單位]261053山東濰坊，濰坊醫(yī)學(xué)院(李若林，李衍芳，劉 芳，楊 文，逯冉冉，鐘珊珊，朱 喆，王小倩)；100048北京，海軍總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(俞英欣，任 明，戚曉昆)

急性缺血性卒中是臨床上常見(jiàn)病、多發(fā)病。其患病率、病死率、致殘率非常高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。盡管對(duì)其損傷機(jī)制的研究很多，但缺血再灌注性腦損傷的機(jī)制仍有爭(zhēng)議。研究表明，細(xì)胞凋亡與腦缺血再灌注損傷關(guān)系密切，是在基因調(diào)控下通過(guò)多種復(fù)雜途徑介導(dǎo)完成的[2]，且在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。復(fù)方曲肽注射液是由曲克蘆丁、活性多肽、多種氨基酸及神經(jīng)節(jié)苷脂組成的復(fù)方制劑。曲克蘆丁具有抑制紅細(xì)胞和凝血因子聚集的作用，防止血栓形成，同時(shí)能增加血中氧的含量，改善微循環(huán)[4]；多肽和氨基酸物質(zhì)能夠促進(jìn)腦內(nèi)蛋白的合成，改善神經(jīng)元物質(zhì)代謝，起到營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)的作用[5-6]。但其腦保護(hù)作用是否與其抑制腦缺血后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)鮮見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)在構(gòu)建大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞再灌注(middle cerebralarteryocclusion reperfusion，MCAO/R)模型的基礎(chǔ)上，采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、MRI、2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)染色、免疫印跡方法，觀察復(fù)方曲肽對(duì)MCAO/R大鼠神經(jīng)行為學(xué)、腦梗死體積、凋亡因子表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性清潔級(jí)SD大鼠30只[青島大任富城畜牧公司，SCXK-(魯)-2014-0007]，體質(zhì)量220～250 g，置于室溫(25±2)℃分籠飼養(yǎng)，均自由進(jìn)食、飲水，光照∶黑暗/12 h∶12 h。

1.1.2主要試劑 TTC；兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase 1，Caspase 1)、Caspase 3及Caspase 8(BBI生命科學(xué)有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶-羊抗兔二抗(武漢博士德生物有限公司)；復(fù)方曲肽注射液(吉林步長(zhǎng)制藥有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組 動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照(normal control，NC)組、MCAO/R組和MCAO/R+復(fù)方曲肽(troxerutinand cerebroprptein，TC)組3組(每組10只)。10倍生理鹽水稀釋復(fù)方曲肽注射液，模型動(dòng)物按2 mL/100 g腹腔注射稀釋復(fù)方曲肽注射液，大腦中動(dòng)脈閉塞后同時(shí)給藥。各組取6只動(dòng)物行MRI、TTC染色測(cè)量腦梗死體積，各組另4只檢測(cè)Caspase 1、Caspase 3及Caspase 8表達(dá)。

1.2.2MCAO模型制備 10%水合氯醛(0.4 mL/ 100 g)麻醉大鼠，腹面向上，頸部備皮并消毒。取頸正中切口，鈍性分離右側(cè)頸總動(dòng)脈及頸內(nèi)外動(dòng)脈，結(jié)扎頸外動(dòng)脈，動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈，于頸總動(dòng)脈游離端剪一小口，并在小口下系一松結(jié)。將制備好的線栓經(jīng)該切口順頸總動(dòng)脈插入，使之與頸內(nèi)動(dòng)脈走行平行。將線栓順頸內(nèi)動(dòng)脈走向，輕柔緩慢推進(jìn)，感到有輕度阻力為止，進(jìn)線深度1.8～2.0 cm，系緊預(yù)先打好的松結(jié)，術(shù)中保持體溫37℃，1 h后拔出線栓，恢復(fù)灌注23 h后進(jìn)行其他評(píng)估，術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2.3神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分 缺血1 h再灌注23 h后采用盲法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。依據(jù)Garcia JH評(píng)分，從大鼠自主運(yùn)動(dòng)、體態(tài)對(duì)稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)、身體雙側(cè)觸覺(jué)、雙側(cè)胡須反射6個(gè)方面評(píng)定大鼠神經(jīng)功能損傷程度，功能正常時(shí)得分最高(18 分)，功能損傷最嚴(yán)重得分最低(3分，表1)。

1.2.4MRI 神經(jīng)功能檢查結(jié)束后，各組大鼠10%水合氯醛麻醉，將大鼠頭部固定在木板上，取仰臥位，行MRI獲得缺血1 h再灌注23 h后大鼠T2加權(quán)像、T2液體衰減反轉(zhuǎn)恢復(fù)序列(fluid attenuated inversion recovery，F(xiàn)LAIR)和表觀彌散系數(shù)(apparent diffusion coefficient，ADC)。圖像處理軟件計(jì)算梗死區(qū)與對(duì)側(cè)大腦組織的信號(hào)強(qiáng)度比值，分析各組間的參數(shù)變化，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.5腦梗死體積 MRI后，大鼠直接斷頭取腦，TTC染色。從距額極3 mm處開(kāi)始，從前往后作冠狀位連續(xù)切片，每片厚度2 mm，共6片。將大腦切片浸泡于2%的TTC溶液中，37℃恒溫避光10min，正常腦組織染為玫瑰紅色，腦梗死區(qū)不染色(白色)。將腦片浸泡于4%多聚甲醛磷酸緩沖液內(nèi)，固定30 min后，腦片按腦的前后順序整齊排列，拍照保存后輸入計(jì)算機(jī)。用圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積，6張腦片梗死體積之和視為腦梗死體積。

表1　Garcia JH大鼠神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6Western印跡法 各組大鼠隨機(jī)取4只，10%水合氯醛深度麻醉后，斷頭處死，快速取出完整大腦，將缺血半暗帶腦組織取出，正常對(duì)照組取缺血區(qū)對(duì)應(yīng)部位腦組織，分別稱重后提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定蛋白濃度，制備10%分離膠和5%濃縮膠，根據(jù)蛋白濃度確定上樣體積并電泳。把凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上并將其置于5%脫脂奶粉封閉液中，室溫下封閉1 h后再加入一抗(Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8)孵育，4℃過(guò)夜，洗膜后加入二抗(山羊抗兔抗體)于室溫下反應(yīng)2 h，洗膜后滴加電化學(xué)發(fā)光液，X線片顯影，IPP 7.0和圖像分析軟件進(jìn)行灰度分析。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為對(duì)照。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦梗死體積 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/ R組腦梗死體積顯著高于MCAO/R+TC組(P＜0.05，圖1、圖2)。

圖1　TTC染色腦梗死體積縮小的抽象圖

圖2　腦梗死體積變化

2.2MRI 缺血1 h再灌注23 h后MRI顯示，MCAO/ R組可見(jiàn)左腦出現(xiàn)高信號(hào)強(qiáng)度區(qū)，與周圍組織對(duì)比明顯；MCAO/R+TC組T2加權(quán)像、T2FLAIR信號(hào)強(qiáng)度比值降低(P＜0.05)，且ADC值升高。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3　T2加權(quán)像、T2FLAIR、ADC的MRI

2.3神經(jīng)功能評(píng)分 缺血1 h再灌注23 h后，MCAO/R組神經(jīng)功能評(píng)分低于NC組(P＜0.05)，而MCAO/R+TC組神經(jīng)功能評(píng)分則高于MCAO/R組(P＜0.05)，見(jiàn)圖5。

2.4Western印跡法 分析缺血1 h再灌注23 h后缺血半暗帶中含Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達(dá)，結(jié)果顯示MCAO/R組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8的表達(dá)高于NC組(P＜0.05)，而MCAO/R+TC組缺血半暗帶中Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達(dá)低于MCAO/R組(P＜0.05，圖6、圖7)。

圖6　大鼠腦梗死部位組織Western印跡法分析

圖7　缺血半暗帶Caspase 1、Caspase 3、Caspase 8表達(dá)的半定量分析

3　討論

本研究采用SD大鼠腦缺血再灌注模型，通過(guò)神經(jīng)功能評(píng)分、MRI技術(shù)、TTC染色手段，發(fā)現(xiàn)復(fù)方曲肽能減少腦梗死體積、改善大鼠神經(jīng)功能評(píng)分以及抑制腦缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的改善及梗死體積的減少，可能與曲克蘆丁改善神經(jīng)元代謝，影響其呼吸鏈，激活腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和酶的活性，改善腦細(xì)胞缺血狀態(tài)有關(guān)[7-8]。但本研究顯示，該藥的神經(jīng)保護(hù)作用與其對(duì)缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞1 h再灌注23 h后，缺血腦組織Caspase 3、Caspase 8水平顯著升高，提示腦缺血再灌注損傷可強(qiáng)烈誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。已經(jīng)有研究報(bào)道，腦缺血損傷所致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡由Caspases激活所決定，腦缺血損傷可誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子促凋亡因子，破壞電子傳遞、氧化磷酸化和ATP，激活Caspase 8，繼而激活Caspase 3，引起“瀑布式”連鎖反應(yīng)，最終引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡[9]。已有證據(jù)表明[10]，抑制Caspase 3的活化可以減輕以細(xì)胞凋亡為主要機(jī)制的缺血后細(xì)胞損害，增加存活神經(jīng)元數(shù)量，縮小腦梗死體積，并最終改善神經(jīng)功能。

另外，在神經(jīng)細(xì)胞中，Caspase 1可以通過(guò)激活Caspase 6引起細(xì)胞凋亡[11]；Caspase 1還可參與白介素(interleukin，IL)-1β及IL-18的活化，繼而誘導(dǎo)IL-6、IL-8的發(fā)生，從而引起細(xì)胞因子的釋放，促進(jìn)組織破壞。

本實(shí)驗(yàn)中，MCAO/R+TC組腦組織Caspase 1的表達(dá)較MCAO/R降低，從而證實(shí)復(fù)方曲肽注射液能夠減少缺血再灌注損傷所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。其機(jī)制可能與曲克蘆丁消除炎癥反應(yīng)，減少炎癥介質(zhì)的釋放，從而降低凋亡因子的表達(dá)有關(guān)。這與先前研究報(bào)道[12]的曲克蘆丁可用于治療梗死及腦血管疾病，其機(jī)制可能與其消除局部炎癥反應(yīng)有關(guān)相一致。并且已有研究證實(shí)，曲克蘆丁顯著抑制血小板黏附到紅細(xì)胞，抑制血小板激活因子，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞而起到抗血栓的作用[13]。

本研究證實(shí)，復(fù)方曲肽注射液對(duì)腦缺血損傷所致凋亡相關(guān)基因表達(dá)有較明顯的干預(yù)作用，由于促凋亡基因活性下降，細(xì)胞凋亡受到抑制，是這種藥物發(fā)揮腦缺血損傷保護(hù)作用的途徑之一。復(fù)方曲肽注射液通過(guò)對(duì)凋亡因子的下調(diào)作用進(jìn)而有效緩解腦缺血損傷所致的神經(jīng)元凋亡，該發(fā)現(xiàn)為腦缺血的臨床用藥治療提供了一定的理論依據(jù)。

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Neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischem ia

LIRuolin1，LIYanfang1，LIU Fang1，YANGWen1，LU Ranran1，ZHONG Shanshan1，ZHU Zhe1，WANG Xiaoqian1，YU Yingxin2，REN Ming2，QIXiaokun2
(1.Weifang Medical University，Weifang Shandong 261053，China；2.Department of Neurology，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

[Abstract]Objective To investigate the neuroprotective effects of troxerutin and cerebroprotein against neuronal damage induced by cerebral ischmia injury.M ethods Male SD rats were divided into 3 groups(n=10):normal control group(NC)，middle cerebral artery occlusion reperfusion(MCAO/R)group，MCAO/R+(troxerutin and cerebroprotein，TC)group(MCAO/R+TC). One hour after ischemia and 23 hours after reperfusion，6 rats in each group were evaluated by neural function test and magnetic resonance imaging(MRI)，and then sacrificed for determining the cerebral infarction volumewith 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride(TTC)staining；the remaining 4 rats in each group were sacrificed，and the protein levels of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in the ischemia penumbrawere determined byWestern Blotting.Results After MCAO/R，cerebral infarction and neurological deficitweremanifested.Troxerutin and cerebroprotein was proved to be effective in improving neurological functions and decreasing infarction on MCAO/R animals.Compared with MCAO/R groups，the expression of Caspase 1，Caspase 3，Caspase 8 in NC groupswere decreased significantly(P＜0.05).Conclusion Troxerutin and cerebroprotein has protective effect against injury induced by cerebral ischemia reperfusion，which is related to their role in inhibiting the neuronal apoptosis.

[Key words]Cerebral ischemia；Troxerutin and cerebroprotein；Cell apoptosis；2，3，5-triphenyltetrazolium chloride

(收稿日期:2015-12-26 本文編輯:馮 博)

[通訊作者]戚曉昆，E-mail:bjqxk@sina.com

doi:10.3969/j.issn.2095-3097.2016.01.003

[中圖分類號(hào)]R743.31

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]2095-3097(2016)01-0009-05