TGF-β1抑制劑增加H460肺癌細(xì)胞的放射敏感性

黃淺漪 趙一凡 蔣友芹 王敬東 楊紅英（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院/放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123）

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TGF-β1抑制劑增加H460肺癌細(xì)胞的放射敏感性

黃淺漪 趙一凡 蔣友芹 王敬東 楊紅英
（蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院/放射醫(yī)學(xué)及交叉學(xué)科研究院 蘇州 215123）

摘要探索一種TGF-β1受體激酶的選擇性抑制劑SB431542對(duì)H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射增敏作用及對(duì)其DNA損傷應(yīng)答體系的干擾。采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SB431542對(duì)H460細(xì)胞放射敏感性的影響；用移植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證SB431542在體內(nèi)對(duì)H460細(xì)胞的放射增敏作用；采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡；用免疫熒光檢測(cè)53BP1 foci和磷酸化的DNA-PKcs foci。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SB431542可增加H460的放射敏感性。照射前用SB431542預(yù)處理H460細(xì)胞雖然快速啟動(dòng)了細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，但卻抑制了DNA雙鏈斷裂的非同源末端鏈接修復(fù)，因此，導(dǎo)致細(xì)胞殘留更多未修復(fù)的DNA雙鏈斷裂，從而產(chǎn)生更嚴(yán)重的細(xì)胞周期阻滯。研究還發(fā)現(xiàn)，這種增敏作用與細(xì)胞凋亡無關(guān)。體內(nèi)移植瘤實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)照射組相比，連續(xù)3次用SB431542聯(lián)合5 Gy的X-射線處理明顯在處理后第5～12 d之間降低了腫瘤的生長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示，在照射前用SB431542抑制腫瘤細(xì)胞的TGF-β1通路，能降低其DNA損傷修復(fù)能力，改變細(xì)胞周期分布，降低細(xì)胞克隆形成能力，延緩腫瘤的生長(zhǎng)，因此用SB431542抑制TGF-β1通路可作為一些類型肺癌病人放療的有效輔助手段。

關(guān)鍵詞H460細(xì)胞，TGF-β1，抑制劑SB431542，放射敏感性，DNA損傷應(yīng)答

校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)和蘇州大學(xué)大學(xué)生莙政學(xué)者基金（黃淺漪）資助

第一作者：黃淺漪，女，1992年出生，目前是蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院放射治療科在讀研究生，從事放射醫(yī)學(xué)研究；E-mail: qianyi.huang@qq.com

Supported by National Natural Science Foundation of China (No. 31270898 and 11335011), the Key Program of Natural Science

Foundation of Jiangsu Educational Committee (12KJA310005), the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher

Education Institution (PARD), and Junzheng Scholarship of Soochow University (to HUANG Qianyi)

First author: HUANG Qianyi, female, was born in 1992. Now she is a master candidate of Department of Radiotherapy and Oncology, Second Affiliated Hospital, Soochow University, engaging in the field of radiation medicine. E-mail: qianyi.huang@qq.com

Received 22 October 2015; accepted 30 December 2015

TGF-β1 inhibitors increasing the radiosensitivity of H460 lung cancer cells

HUANG Qianyi ZHAO Yifan JIANG Youqin WANG Jingdong YANG Hongying
(School of Radiation Medicine and Protection, Medical College/School for Radiological and Interdisciplinary Sciences (RAD-X), Soochow University, Suzhou 215123, China)

ABSTRACT The purpose of this study was to investigate the radiosensitizing effect of SB431542, a selective inhibitor of TGF-β1 receptor, on H460 non-small-cell lung cancer cells and relative interfering effect on DNA damage response (DDR). Clonogenic assay was used to measure the radiosensitizing effects of SB431542 on H460 cells; xenograft mouse model was used to study the radiosensitization in vivo; flow cytometry was used to determine cell cycle distribution and apoptosis; immunofluorescence microscopy was used to assess 53BP1 foci and pospho-DNA-PKcs foci. The results showed that SB431542 could increase the radiosensitivity of H460 cells.Pretreatment of H460 cells with SB431542 prior to irradiation initiated fast DDR but inhibited DNA repair via non-homologous end joining pathway and thus resulting in more unrepaired DNA double strand breaks, which caused more severe cell cycle delay. However, apoptosis did not contribute to the radiosensitization. The data from xenograft model showed that compared with irradiation alone, the combination of SB431542 and 5 Gy of X-rays on three consecutive days significantly delayed the tumor growth from 5～12 d post treatment. All the above indicate that inhibition of TGF-β1 pathway using SB431542 prior to irradiation can attenuate DNA damage repair and disturb cell cycle distribution, leading to decreased clonogenic cell survival and tumor growth delay, which can be an effective adjunct in radiotherapy for certain lung cancer subtypes.

KEYWORDS H460 cells, TGF-β1, Inhibitor SB431542, Radiosensitivity, DNA damage response

CLC Q691, TL71

我國肺癌發(fā)病率逐年上升，已成為對(duì)人民健康威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌的主要類型為非小細(xì)胞肺癌。對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌的治療方式主要是手術(shù)加術(shù)后化療或放療；但對(duì)于大約25％不能進(jìn)行手術(shù)的非小細(xì)胞肺癌病人來說，立體定位放射治療被認(rèn)為是目前最合適的治療選擇[2]。但由于肺癌細(xì)胞的低放射敏感性可能導(dǎo)致放療的成功率無法得到保障[3]，因此對(duì)于增加肺癌細(xì)胞輻射敏感性的研究迫在眉睫。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)是一個(gè)在調(diào)節(jié)細(xì)胞和組織的動(dòng)態(tài)平衡包括增殖、分化、遷移、細(xì)胞存活和血管生成等信號(hào)通路中起著重要作用的細(xì)胞因子[4]。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1在腫瘤形成后期起著促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的作用[5-7]，可能作為腫瘤治療中的一個(gè)有效標(biāo)靶[8]。另外，研究還發(fā)現(xiàn)TGF-β1對(duì)細(xì)胞的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)也有著重要調(diào)控作用[9]，如抑制TGF-β1通路可以抑制上皮細(xì)胞對(duì)DNA損傷的應(yīng)答，其中包括抑制ATM和ATR的活性、減弱Chk2、Rad17和p53的磷酸化從而增加細(xì)胞的放射敏感性，這提示抑制TGF-β1通路有可能提高腫瘤放射治療的成功率[9]。實(shí)際上，有研究已證實(shí)細(xì)胞受照前用TGF-β1通路抑制劑LY364947處理，即可通過減緩DNA損傷修復(fù)和降低克隆形成率從而增加乳腺癌細(xì)胞[10]和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[11]的放射敏感性。另一種TGF-β1通路抑制劑LY2109761與電離輻射協(xié)同作用在體內(nèi)也延緩了腫瘤的生長(zhǎng)[10]。另外，體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)還顯示LY2109761可增加膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的放射敏感性[12]。

TGF-β1已被證實(shí)與癌癥患者放療后的肺損傷和纖維化有關(guān)，抑制TGF-β1可作為用于預(yù)防或減輕放療引起的正常肺組織損傷的分子療法[13]。因此如果抑制TGF-β1能在減輕肺纖維化的同時(shí)增加肺癌細(xì)胞的放射敏感性，那么TGF-β1抑制劑將成為肺癌放療的一種有效的輔助方法。已有研究顯示TGF-β1通路抑制劑LY364947可以增加A549和H1299肺癌細(xì)胞的放射敏感性[11]。因此，本研究以H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞為研究對(duì)象，研究另一種TGF-β1抑制劑SB431542是否能增加其放射敏感性，并探討SB431542對(duì)細(xì)胞受照后DNA損傷應(yīng)答和細(xì)胞周期分布的影響。

1　材料與方法

1.1材料

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460購自于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；胎牛血清購自美國Hyclone公司；RPMI1640培養(yǎng)基、丙酮酸鈉、二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、TGF-β1受體抑制劑(SB431542)購自于美國Sigma-Aldrich公司；HEPES緩沖液購自于中國南京旋光科技有限公司；青霉素-鏈霉素、胰酶消化液、Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)購自于中國碧云天生物技術(shù)研究所；抗53BP1兔多克隆抗體和抗磷酸化DNAPKcs(S2056)兔多克隆抗體購自于英國Abcam公司；化學(xué)發(fā)光劑購自于美國Bio-Rad公司。

NC-nu裸鼠，雄性，8周齡，體重(23±2) g，從蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得，飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)放射醫(yī)學(xué)與防護(hù)學(xué)院動(dòng)物中心，室溫為21～26℃，濕度為60％～70％。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和輻照

H460細(xì)胞以適當(dāng)比例接種于含有10％胎牛血清、2.5 g/L葡萄糖、1 mmol/L丙酮酸鈉、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素以及1 mmol/L HEPES (pH=7.2)的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37℃、含5％ CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后24 h，更換為含SB431542的新鮮培養(yǎng)液，并培養(yǎng)1 h后換液，采用美國RAD SOURCE RS2000 X-射線機(jī)進(jìn)行照射，能量為160 kVp，劑量率為1.16 Gy/min。

1.2.2結(jié)晶紫實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞增殖

取5000細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換為含有不同濃度SB431542(1、2、5、10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)不同時(shí)間(24、48、72 h)后吸出培養(yǎng)液，用PBS洗兩遍，加入結(jié)晶紫溶液(0.5％)，在室溫下孵育15 min后用自來水清洗干凈并晾干。然后，每孔加入100μL 0.1mol/L的檸檬酸鈉(pH=4.2)/50％無水乙醇在室溫下振搖30 min。用酶標(biāo)儀(BIO-TEK POWERWAVE XS)在540 nm處讀取光密度(Optical delnsity, OD)值。

1.2.3克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，根據(jù)不同的受照劑量，每皿接種100～1000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)3個(gè)平行樣。24 h后，去除原培養(yǎng)液，更換為含有SB431542(10μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，1 h后換新鮮培養(yǎng)液再照射。繼續(xù)培養(yǎng)14 d之后，棄培養(yǎng)液，用PBS快速洗3遍，甲醇固定15 min、亞甲基藍(lán)染色30 min，用清水將培養(yǎng)皿洗凈晾干。于顯微鏡下計(jì)數(shù)含50 個(gè)細(xì)胞以上的細(xì)胞集落?？寺⌒纬陕屎图?xì)胞克隆存活率按如下公式計(jì)算：

克隆形成率(％)=(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100％；

細(xì)胞克隆存活率=處理組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布和Sub-G1

將H460細(xì)胞接種在100 mm培養(yǎng)皿中。24 h后更換為含有SB431542(10 μmol/L)的新鮮培養(yǎng)液，再1 h后換新鮮培養(yǎng)液再照射。在照后5、24、48、72 h時(shí)，收集細(xì)胞后固定于70％的乙醇中，并儲(chǔ)存于?20℃?zhèn)溆谩ｋx心細(xì)胞懸浮液并用PBS洗兩次，再懸浮于含0.1％ NP40和500 μg/mL的RNA酶的700 μL碘化丙啶(100 μg/mL)中，用流式細(xì)胞儀(BECKMAN COULTER CYTOMICS FC500)進(jìn)行分析。采用Multicycle AV for Windows分析細(xì)胞周期，CXP analysis分析Sub-G1以評(píng)估凋亡水平。

1.2.5免疫熒光檢測(cè)53BP1和磷酸化的DNAPKcs foci

將H460細(xì)胞接種在蓋玻片上。用不同方法處理后，在不同時(shí)間點(diǎn)用3.7％的甲醛溶液將細(xì)胞在室溫下固定15 min。用PBS洗去殘留的固定液后，用冰冷的0.5％ 的Triton-100溶液(含50 mmol/L NaCl, 3 mmol/L MgCl2,200 mmol/L Sucrose, 10 mmol/L HEPES, pH=7.4)在4℃孵育15 min。用含有5％山羊血清和0.2％脫脂牛奶封閉液在室溫下封閉1 h后，用53BP1或phospho-DNA-PKcs抗體分別在室溫或37℃條件下孵育45或90 min，再用Alexa Fluor 488標(biāo)記山羊抗兔IgG (H+L)二抗在室溫下避光孵育45 min。PBS洗滌細(xì)胞后，用4', 6'-diamidimo-2- phenylindole (DAPI)(10 μg/mL時(shí))染色2 min，然后用抗淬滅劑（碧云天）封片，并在熒光顯微鏡(Leica DM2000)下觀察計(jì)數(shù)。對(duì)于53BP1 foci的計(jì)數(shù)，計(jì)100個(gè)細(xì)胞中的foci數(shù)目；而對(duì)于DNA-PKcs foci，計(jì)至少500個(gè)細(xì)胞中含有foci的陽性細(xì)胞率，以含10個(gè)或10個(gè)以上foci的細(xì)胞為陽性。

1.2.6移植瘤實(shí)驗(yàn)

裸鼠左后腿內(nèi)側(cè)皮下注射300萬個(gè)H460細(xì)胞。當(dāng)腫瘤達(dá)到約100 mm3后給予分組處理。20只荷瘤小鼠隨機(jī)被分為4組，分別是不處理組、單純加藥組、單純照射組、加藥+照射組，每組5只小鼠。加藥組小鼠接受腹腔注射SB431542(10 mg/kg)。2 h后對(duì)加藥+照射組和單純照射組的小鼠進(jìn)行腫瘤局部照射(5 Gy)。這樣的處理每隔24 h進(jìn)行一次，連續(xù)處理3次。經(jīng)過連續(xù)3 d的處理后，從第4天起開始，每天用游標(biāo)卡尺按下式測(cè)量腫瘤體積。

腫瘤體積=長(zhǎng)×寬2×0.52[10]。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)都是至少3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均，并用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤差表示(±s)。細(xì)胞存活和腫瘤體積數(shù)據(jù)采用Origin 8.0軟件的ANOVA法檢驗(yàn)分析多個(gè)樣本均數(shù)間的差異，以Turkey Post Hoc檢驗(yàn)進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)間的多重比較；其余數(shù)據(jù)兩組間的比較采用 Student's t檢驗(yàn)。p<0.05被認(rèn)為兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1SB431542對(duì)H460細(xì)胞的毒性

為驗(yàn)證SB431542自身對(duì)細(xì)胞的毒性作用，本研究分析了經(jīng)不同濃度的SB431542處理后細(xì)胞的增殖能力。如圖1所示，與未處理組相比，在所用濃度范圍內(nèi)(1～10 μmol/L)，SB431542處理細(xì)胞24 和48 h均對(duì)細(xì)胞的增殖無顯著抑制作用(p>0.05)，而只有10 μmol/L SB431542在處理細(xì)胞72 h后對(duì)其增殖有20％ 的抑制。因此，考慮到10 μmol/L SB431542在處理H460細(xì)胞48 h內(nèi)并無明顯生長(zhǎng)抑制作用，以后的實(shí)驗(yàn)中均使用10 μmol/L SB431542預(yù)處理1 h來抑制細(xì)胞的TGF-β通路。

2.2SB431542增加H460細(xì)胞的放射敏感性

在克隆形成實(shí)驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)10 μmol/L SB431542單獨(dú)處理H460細(xì)胞后使其克隆形成率降低了6％ (p<0.05)，然而在扣除了該降低后，SB431542仍然顯著增加了H460細(xì)胞的輻射敏感性。圖2所示的細(xì)胞存活曲線為用Origin 8.0軟件采用線性二次模型擬合而成。在10％的克隆存活率下，劑量增敏比(RDE)[10]按以下方法計(jì)算：

劑量增敏比=為獲得10％的克隆存活率所需的受照劑量/在加藥條件下為獲得10％的克隆存活率所需的受照劑量。

由此計(jì)算出H460的RDE為1.15±0.02 (p< 0.05)。因?yàn)镽DE顯示的是在無SB431542下獲得10％存活率所需受照劑量與在有SB431542下獲得同樣存活率所需受照劑量的比值，因此RDE如果大于1則表明在有SB431542時(shí)所需受照劑量較小，也即是SB431542具有增敏效果。RDE越大，增敏效果越好。所以這個(gè)結(jié)果表明10 μmol/L SB431542增加了H460細(xì)胞的輻射敏感性。

2.3SB431542抑制TGF-β1通路后對(duì)H460細(xì)胞受照后周期和凋亡的影響

為了確定SB431542降低H460細(xì)胞受照后克隆存活能力的增敏機(jī)制，本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期來探究SB431542是否改變了細(xì)胞受照后的周期分布，并通過檢測(cè)SubG1來評(píng)估SB431542是否增加輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。如圖3所示，SB431542單獨(dú)處理細(xì)胞并未明顯改變細(xì)胞周期分布，但在SB431542聯(lián)合5 Gy的射線處理下，與單獨(dú)照射組相比，在處理后24 h，有更多的細(xì)胞阻滯在S期，而在48 h后，細(xì)胞出現(xiàn)了更明顯的G2/M期阻滯，提示SB431542聯(lián)合輻射可能造成了更多殘留的DNA雙鏈斷裂，從而導(dǎo)致了更嚴(yán)重的細(xì)胞周期阻滯。另外，通過測(cè)定Sub-G1，本研究發(fā)現(xiàn)SB431542單獨(dú)處理細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)(5、24、48、72 h)并未導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，5和8 Gy的X-射線照射在照后直到72 h也未引起具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的凋亡增加；SB431542聯(lián)合輻照后，與5 Gy和8 Gy單獨(dú)受照組相比，SB431542聯(lián)合輻射組也未增加細(xì)胞凋亡（圖4），表明SB431542對(duì)H460細(xì)胞的輻射增敏作用不是來自于對(duì)細(xì)胞受照后發(fā)生凋亡的促進(jìn)。

2.4SB431542延緩了H460細(xì)胞受照后的DNA損傷修復(fù)

為了進(jìn)一步探討抑制TGF-β1使H460細(xì)胞放射敏感性增加的相關(guān)機(jī)制，并解釋SB435142聯(lián)合輻射組中更嚴(yán)重的細(xì)胞周期阻滯，本課題首先研究了作為DNA雙鏈斷裂標(biāo)記的53BP1 foci[14]在細(xì)胞受照后出現(xiàn)和消失的動(dòng)力學(xué)過程。結(jié)果顯示，照射前有無SB431542處理并不引起含有53BP1 foci的陽性細(xì)胞比例的變化（數(shù)據(jù)未顯示），然而當(dāng)對(duì)平均每個(gè)細(xì)胞中的53BP1 foci數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，卻發(fā)現(xiàn)與單純受照射細(xì)胞在照射后30 min達(dá)到峰值不同，SB431542預(yù)處理的細(xì)胞受照后15 min，其單個(gè)細(xì)胞中的53BP1 foci數(shù)即達(dá)到了峰值，提示SB431542加速了細(xì)胞受照后的DNA損傷應(yīng)答。并且，盡管在照射后1 h，SB431542預(yù)處理的細(xì)胞中殘留的53BP1 foci的數(shù)目小于單純受照射細(xì)胞，但照射后4 h，這個(gè)趨勢(shì)發(fā)生了逆轉(zhuǎn)，至少在照射后8 h之內(nèi)，SB431542預(yù)處理的細(xì)胞中殘留的53BP1 foci的數(shù)目大于單純受照射細(xì)胞，提示SB431542聯(lián)合輻射處理的細(xì)胞中殘留的DNA雙鏈斷裂比單純照射細(xì)胞要多（圖5）。

為了進(jìn)一步明確SB431542預(yù)處理導(dǎo)致細(xì)胞受照后殘留的DNA損傷增多的原因，本課題又研究了SB431542預(yù)處理是否影響細(xì)胞在受照后非同源末端鏈接通路的激活。以磷酸化的DNA-PKcs foci作為非同源末端鏈接通路的標(biāo)記[15]，本研究發(fā)現(xiàn)SB431542預(yù)處理導(dǎo)致受照后含有DNA-PKcs foci的陽性細(xì)胞率至少在1 h之內(nèi)顯著低于單純受照射細(xì)胞，而這種差異在照射后6 h消失了。這提示SB431542削弱了細(xì)胞受照射后短期內(nèi)的非同源末端鏈接修復(fù)能力。

2.5SB431542在體內(nèi)對(duì)H460移植瘤有增敏作用

為了進(jìn)一步研究該抑制劑在體內(nèi)是否和輻射有協(xié)同作用，本研究進(jìn)行了裸鼠荷瘤的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，與未受任何處理的對(duì)照組相比，單純SB431542處理并未顯著降低腫瘤的生長(zhǎng)(p>0.05)，但連續(xù)3次5 Gy的局部照射包括單獨(dú)照射和加藥聯(lián)合照射均顯著地抑制了腫瘤的生長(zhǎng)(p<0.001)（圖7a）。而與單獨(dú)照射組相比，SB431542聯(lián)合照射在處理后第5天到第12天之間，腫瘤的體積甚至發(fā)生了明顯的縮小(p<0.001)（圖7b），提示SB431542在體內(nèi)也具有放射增敏作用。然而由于對(duì)腫瘤只進(jìn)行了三次處理，12 d之后腫瘤恢復(fù)生長(zhǎng)，單純照射組和加藥照射組之間的差異慢慢縮小了（圖7b）。

3　討論

肺癌放療所用的最大劑量受限于周圍肺組織的耐受性。肺損傷和肺纖維化是肺癌病人經(jīng)受放射治療后的常見副作用。研究表明肺癌細(xì)胞受照后大量釋放的TGF-β1與正常肺組織的損傷和纖維化密切相關(guān)[16]。研究還發(fā)現(xiàn)，利用患者放療后4周內(nèi)血漿TGF-β1的升高能準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌病人是否有并發(fā)放射性肺毒性的危險(xiǎn)[17]。因此，TGF-β1可能作為預(yù)防RILT的一個(gè)有效標(biāo)靶。現(xiàn)已有研究顯示大黃提取物可能通過降低TGF-β1和IL-6的水平來減少RILT，并改善肺功能[18]。

另一方面，對(duì)于乳腺癌和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的研究顯示，抑制TGF-β1通路能增加這些腫瘤細(xì)胞的放射敏感性[10,12]。因此如果抑制TGF-β1通路也能增加肺癌細(xì)胞的輻射敏感性，抑制肺癌的生長(zhǎng)，那么在臨床上將會(huì)有一舉兩得的效果。最近的研究顯示，用TGF-β1受體激酶的選擇性抑制劑LY364947能增加A549和H1299等肺癌細(xì)胞的放射敏感性[11]。而本研究探索了另外一個(gè)TGF-β1受體抑制劑，SB431542對(duì)另一株肺癌細(xì)胞系，H460細(xì)胞是否具有放射增敏作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在照射前用SB431542選擇性抑制TGF-β1通路后，H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性增加（圖2）。對(duì)SB431542增加H460細(xì)胞的放射敏感性的機(jī)制進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，SB431542預(yù)處理加快了細(xì)胞受照后的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，表現(xiàn)為53BP1 foci的數(shù)目在照后15 min而不是30 min即達(dá)到峰值，顯示抑制TGF-β1通路加快了細(xì)胞受DNA損傷后招募損傷識(shí)別修復(fù)蛋白到損傷位點(diǎn)的速度。然而與單純受照射細(xì)胞相比，SB431542并沒有降低53BP1 foci的數(shù)目，提示SB431542不是通過抑制細(xì)胞受照后招募的DNA損傷識(shí)別蛋白的量來達(dá)到輻射增敏作用的。這與之前報(bào)道的在受照前抑制乳腺癌細(xì)胞的TGF-β1導(dǎo)致H2AX磷酸化的減少不同[10]。但是，盡管SB431542快速啟動(dòng)了細(xì)胞受照后的DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，然而到照射后4～8 h，SB431542聯(lián)合輻射處理的細(xì)胞中殘留53BP1 foci的數(shù)目卻顯著高于單純受照細(xì)胞（圖5），提示照射前抑制TGF-β1通路可能降低了細(xì)胞修復(fù)DNA雙鏈斷裂的能力。進(jìn)一步的研究顯示，SB431542抑制了細(xì)胞照射后至少1 h內(nèi)的磷酸化DNA-PKcs foci的形成（圖6），提示抑制TGF-β1通路降低了細(xì)胞通過非同源末端鏈接通路修復(fù)DNA損傷的能力。這可為SB431542聯(lián)合照射處理的細(xì)胞中存在更多殘留的DNA損傷提供合理的解釋。而正因?yàn)橛懈鄽埩舻腄NA損傷，才導(dǎo)致SB431542聯(lián)合放射處理的細(xì)胞與單純照射的細(xì)胞周期分布不同，存在更多的S期和G2/M阻滯。這些結(jié)果提示TGF-β1信號(hào)通路與DNA損傷應(yīng)答通路并非互獨(dú)立，而是存在相互作用的[9,19]。

本研究更多的數(shù)據(jù)表明，抑制TGF-β1通路增加H460細(xì)胞的放射增敏性與細(xì)胞凋亡無關(guān)（圖4），細(xì)胞凋亡在SB431542對(duì)細(xì)胞的增敏作用中并未有貢獻(xiàn)。這可能與非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞具有凋亡通路缺陷有關(guān)[20]，而抑制TGF-β1通路并未改善該缺陷。

體內(nèi)荷瘤實(shí)驗(yàn)證明，與空白對(duì)照組相比，單純加藥組對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)并無顯著抑制，而單純照射和加藥照射卻都能顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)。并且相對(duì)于單純照射組，加藥照射組的腫瘤在第5至12天更是顯著減小，顯示出SB431542的放射增敏作用。但本研究也觀察到照射組和加藥照射組的這種差異在后期消失了。分析其原因，可能是由于處理次數(shù)不夠（只有3次），后期腫瘤本身增殖重新加快造成的。然而，即使這樣，與對(duì)照組和單純加藥組相比，SB431542聯(lián)合輻射組和單純輻射組的腫瘤仍然小很多，表明腫瘤得到了有效的控制。

本研究證實(shí)了照射前抑制TGF-β1通路增加H460非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性，這支持了關(guān)于抑制TGF-β1信號(hào)可能提高肺癌放療療效的概念。這種放射增敏作用可能是通過改變DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)、抑制非同源末端修復(fù)DNA雙鏈斷裂的能力及改變細(xì)胞周期分布來實(shí)現(xiàn)的，與細(xì)胞凋亡無關(guān)。另外，已有研究還發(fā)現(xiàn)SB431542能夠抑制放療導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞遷移能力和侵潤能力的增加[21]。因此SB431542在非小細(xì)胞肺癌的放療中有可能有潛在的應(yīng)用前景。

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Corresponding author:Ph.D. YANG Hongying, professor, E-mail: yanghongying@suda.edu.cn

收稿日期：初稿2015-10-22；修回2015-12-30

通訊作者：楊紅英，博士，教授，E-mail: yanghongying@suda.edu.cn

DOI:10.11889/j.1000-3436.2016.rrj.34.010202

中圖分類號(hào)Q691，TL71

基金資助：國家自然科學(xué)基金(31270898, 11335011)、江蘇省教育廳省屬高校自然科學(xué)研究重大項(xiàng)目(12KJA310005)、江蘇高