鋁脅迫對(duì)擬南芥根尖AtPIN2蛋白表達(dá)活性的影響

曹華蘋(píng)，吳道銘，甘海華，沈　宏

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州510642 )

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鋁脅迫對(duì)擬南芥根尖AtPIN2蛋白表達(dá)活性的影響

曹華蘋(píng)，吳道銘，甘海華，沈宏*

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州510642 )

摘要:鋁脅迫能影響根尖生長(zhǎng)素的運(yùn)輸，這與生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體密切相關(guān)，PIN2作為根尖生長(zhǎng)素的運(yùn)輸?shù)鞍祝洫?dú)特的組織定位可能誘導(dǎo)PIN2蛋白參與了鋁調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的運(yùn)輸過(guò)程。該研究以擬南芥PIN2缺失突變體( pin2)、PIN2□∷□GFP融合體及其野生型( WT)為材料，應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微技術(shù)，研究鋁處理對(duì)擬南芥根尖生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍譖IN2的表達(dá)活性、蛋白在組織及亞細(xì)胞水平分布及其對(duì)鋁內(nèi)置化作用的影響。結(jié)果表明:短期鋁處理或低鋁濃度能明顯增加擬南芥根尖細(xì)胞PIN2蛋白表達(dá)活性，而長(zhǎng)期鋁處理或高鋁濃度抑制其表達(dá)活性;以100 μmol·L-1AlCl3處理4 h的蛋白表達(dá)活性最高。蛋白印跡反應(yīng)發(fā)現(xiàn)，鋁處理促進(jìn)PIN2蛋白在細(xì)胞膜上累積，減少胞內(nèi)囊泡中PIN2蛋白的含量;囊泡運(yùn)輸抑制劑( BFA)能抑制鋁誘導(dǎo)PIN2蛋白的分配。鋁脅迫增加擬南芥根尖細(xì)胞H2O2累積，pin2的H2O2累積量大于WT，而相對(duì)根長(zhǎng)小于WT。Morin染色結(jié)果顯示，pin2的鋁內(nèi)置化顯著小于WT。上述研究表明，PIN2蛋白在100 μmol·L-1AlCl3處理?xiàng)l件下活性最高，細(xì)胞膜累積程度加強(qiáng)，鋁內(nèi)置化能力增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)根系的生長(zhǎng)發(fā)育。該研究結(jié)果進(jìn)一步為鋁抑制生長(zhǎng)素的運(yùn)輸機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:鋁脅迫，擬南芥，AtPIN2，表達(dá)活性

曹華蘋(píng)，吳道銘，甘海華，等．鋁脅迫對(duì)擬南芥根尖AtPIN2蛋白表達(dá)活性的影響［J］．廣西植物，2016，36( 1) : 121－126

CAO HP，WU DM，GAN HH，et al．Effects of aluminum stress on the activity of PIN2 protein in Arabidopsis thaliana apical roots［J］．Guihaia，2016，36 ( 1) : 121－126

鋁毒是酸性土壤上限制農(nóng)作物生長(zhǎng)重要的影響因子，植物響應(yīng)鋁毒害的最初反應(yīng)是根尖伸長(zhǎng)受抑制( Delhaize＆Ryan，1995; Kochian et al，2004)。然而經(jīng)過(guò)多年研究，鋁抑制根尖伸長(zhǎng)的確切機(jī)理尚未完全闡明( Ma et al，2014)。生長(zhǎng)素的合成與運(yùn)輸對(duì)根系伸長(zhǎng)起了重要作用( Teale et al，2005)。根尖生長(zhǎng)素在PIN蛋白家族(生長(zhǎng)素輸出蛋白)的作用下，通過(guò)向頂運(yùn)輸和向基運(yùn)輸?shù)摹皞阈巍边\(yùn)輸，形成根尖的生長(zhǎng)素的不對(duì)稱(chēng)分布，進(jìn)一步影響根尖生長(zhǎng)(吳道銘等，2014)。Laxmi et al( 2008)認(rèn)為光照主要是通過(guò)調(diào)控PIN蛋白的細(xì)胞間的分布進(jìn)而調(diào)控根系的生長(zhǎng)。鋁脅迫能夠改變生長(zhǎng)素的累積以及分布，并且，這個(gè)過(guò)程主要是通過(guò)生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體AUX1 和PIN2調(diào)節(jié)( Yuan et al，2013)。在擬南芥根尖，PIN2蛋白定位于表皮細(xì)胞的頂端以及皮層細(xì)胞的底端，具有向基以及向頂?shù)纳L(zhǎng)素運(yùn)輸能力( Blilou et al，2005; Feraru＆Friml，2008 )。鋁與PIN2蛋白的相互關(guān)系并不清楚。

本研究以擬南芥PIN2基因缺失突變體( pin2)、對(duì)照野生型( WT)和PIN2□∷□GFP融合體為材料，研究了鋁脅迫對(duì)擬南芥根系生長(zhǎng)、根尖PIN2蛋白表達(dá)活性及組織分布和PIN2蛋白對(duì)鋁內(nèi)置化的影響，以期初步探明鋁對(duì)PIN2蛋白影響的可能機(jī)制，為遺傳改良作物耐鋁性提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1．1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試擬南芥材料包括擬南芥( Arabidopsis thaliana) PIN2缺失突變體( pin2)、野生型( WT)及PIN2□∷□GFP融合體，分別來(lái)源于俄亥俄州立大學(xué)擬南芥生物資源中心和德國(guó)波恩大學(xué)細(xì)胞與分子植物研究所。在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用滅菌牙簽將已消毒的種子均勻地播在1/4 MS培養(yǎng)基( pH 4．5，含1%葡萄糖)上，然后用Parafilm膜將培養(yǎng)皿密封。待播種完成后，將培養(yǎng)皿垂直放在光照培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)，生長(zhǎng)條件為光照14 h，22℃;黑暗10 h，18℃;光照強(qiáng)度為150 μmol·m-2·s-1。試驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照和鋁脅迫2個(gè)處理，即擬南芥種子播種在含有0或100 μmol·L-1AlCl3的1/4 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6～7 d或14 d，然后取擬南芥幼苗根系進(jìn)行顯微觀察和測(cè)定;或者先將擬南芥幼苗種在1/4 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)6 d，然后放在含有0或100 μmol·L-1AlCl3的0．2 mmol·L-1CaCl2的溶液中處理一段時(shí)間，隨后進(jìn)行顯微觀察。

1．2試驗(yàn)方法

鋁內(nèi)置化研究:將鋁處理后的擬南芥根系從培養(yǎng)基上輕輕取出，先放在0．2 mmol·L-1CaCl2溶液靜置5 min，清除根系表面的養(yǎng)分離子或其它雜物，然后放在濾紙上輕輕吸干根表水珠，隨后放在100 μmol·L-1的Morin染色液中靜置，并在減壓抽真空條件下放置10 min，以便染色液進(jìn)入根系細(xì)胞內(nèi)部，隨后將根系在0．2 mmol·L-1CaCl2清洗2次后，用于激光共聚焦顯微鏡觀察。由于Morin熒光物質(zhì)能與鋁結(jié)合，在特定條件下發(fā)射熒光，根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可判斷進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)鋁水平，即鋁的內(nèi)置化。

H2O2累積分析:利用根系細(xì)胞內(nèi)H2O2與熒光物質(zhì)H2DCF-DA結(jié)合的原理，將處理后的擬南芥根系放在50 μmol·L-1的2'，7'-二氯熒光素二乙酸鹽( 2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，H2DCF-DA)溶液中靜置處理，并在減壓抽真空條件下放置10 min，以便H2DCF-DA熒光物質(zhì)充分進(jìn)入根系細(xì)胞內(nèi)，然后在0．2 mmol·L-1CaCl2溶液清洗2次，隨后放在激光共聚焦顯微鏡下觀察，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，表明H2O2含量越高。

激光共聚焦顯微觀察:擬南芥幼苗處理完畢后，取幼苗根系放置于載玻片上，加1滴去離子水，保持幼苗根尖浸泡在水中，再蓋上蓋玻片，置于激光共聚焦顯微鏡( Eclipse 800，日本)下觀察，其中，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，Argon激光( 1．4 mW)觀察。獲取典型照片作為該文結(jié)果。

圖1　鋁脅迫對(duì)擬南芥根系生長(zhǎng)的影響　A．?dāng)M南芥在正常生長(zhǎng)條件下照片; B．?dāng)M南芥在鋁脅迫條件下照片; C．?dāng)M南芥主根長(zhǎng); D．?dāng)M南芥相對(duì)根長(zhǎng)。數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差( n=10)，柱子上字母不同表示不同處理差異達(dá)到顯著水平( P＜0．05)。下同。Fig．1　Effects of Al stress on root growth of Arabidopsis seedlings A．The control ( CK) ; B．100 μmol·L-1AlCl3; C．Length of tap root; D．Relative root elongation．The data were means±SE ( n=10)．Different letters indicate significantly differences at P＜0．05 level．The same below．

蛋白印跡反應(yīng):先將擬南芥幼苗種在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)13～14 d，然后將其轉(zhuǎn)入分別含有0 μmol·L-1AlCl3，20 μmol·L-1BFA，100 μmol·L-1AlCl3或20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3的0．2 mmol· L-1CaCl2溶液中處理2 h，處理完畢后，收獲根尖1 cm的根段，用Phase-Partitioning方法提取根系質(zhì)膜膜蛋白和囊泡蛋白。質(zhì)膜蛋白和囊泡蛋白先溶解在SDS-loading緩沖液中，緩沖液含有0．125 mmol·L-1Tris-HCl，pH7．4，10%SDS，10%甘油及二硫蘇糖醇、溴酚蘭、苯甲磺酰氟化物。經(jīng)SDS-PAGE后，轉(zhuǎn)入去氟PVP膜片上，進(jìn)行雜交反應(yīng)。用抗玉米多克隆抗體與膜片雜交，抗血清溶液用Tris緩沖液+Tween按1∶1 000稀釋使用，二次抗體檢測(cè)用BCIP-NPT方法進(jìn)行檢測(cè)。

1．3數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均用Microsoft Excel 2003和SAS 9．2軟件分析，用Duncan法進(jìn)行檢驗(yàn)( P＜0．05)。

2　結(jié)果與分析

2．1鋁脅迫對(duì)擬南芥根系生長(zhǎng)的影響

圖1為擬南芥在正常生長(zhǎng)和鋁脅迫條件下的長(zhǎng)勢(shì)。無(wú)論正常生長(zhǎng)或鋁脅迫處理?xiàng)l件下，pin2根系均呈彎曲生長(zhǎng)，這可能與PIN2基因缺失、生長(zhǎng)素極性輸出受阻，根系向地性缺失有關(guān);而WT的根系在正常和鋁脅迫條件下均垂直向下生長(zhǎng)，具有明顯的向地性。有趣的是，pin2在鋁脅迫下向地性缺失現(xiàn)象沒(méi)有正常生長(zhǎng)條件下那么嚴(yán)重(圖1: A，B)。利用直尺測(cè)定擬南芥根長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)在鋁脅迫條件下，WT的主根根長(zhǎng)以及相對(duì)根長(zhǎng)均顯著大于pin2 (圖1: C，D)，表明pin2的耐鋁性小于WT。

2．2鋁脅迫對(duì)擬南芥根系H2O2累積的影響

植物根系在鋁脅迫下，容易遭受氧化脅迫( Yamamoto et al，2002，2003)。熒光物質(zhì)H2DCF-DA 與H2O2結(jié)合，熒光越強(qiáng)指示H2O2累積更多。圖2顯示，100 μmol·L-1Al處理可明顯增加pin2和WT根尖熒光亮度，其中pin2的熒光強(qiáng)度較強(qiáng);相對(duì)熒光強(qiáng)度的結(jié)果與上述結(jié)果一致。表明鋁處理可明顯增加H2O2的累積，且pin2的H2O2累積可能高于WT。尤其是兩材料根系維管束的熒光強(qiáng)度明顯高于其它部位，且根尖、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)的細(xì)胞熒光強(qiáng)度明顯高于根系成熟區(qū)細(xì)胞。

2．3鋁對(duì)PIN2□∷□GFP表達(dá)活性的影響

圖2　鋁脅迫處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞H2O2累積的影響　A．正常生長(zhǎng); B．鋁脅迫處理; C．H2O2相對(duì)熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)為均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差( n=3)。Fig．2 Effects of Al on H2O2accumulation in Arabidopsis roots A．CK; B．100 μmol·L-1AlCl3; C．Relative fluorescence intensity of H2O2．The data are means±SE ( n=3)．

圖3　不同鋁處理濃度和時(shí)間對(duì)PIN2□∷□GFP表達(dá)活性的影響　A．不同鋁處理濃度(μmol·L-1，4 h) ; B．不同鋁處理時(shí)間( 100 μmol·L-1，h)。Fig．3 Effects of Al concentrations and durations on PIN2□∷□GFP activity in apical rootsA．Different Al concentrations for 4 h; B．Different Al durations ( 100 μmol·L-1AlCl3，h)．

上述結(jié)果顯示，PIN2蛋白可能參與了擬南芥的耐鋁反應(yīng)。為明確其內(nèi)在機(jī)制，利用PIN2□∷□GFP材料，進(jìn)一步研究了鋁脅迫對(duì)PIN2蛋白表達(dá)活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PIN2□∷□GFP表達(dá)活性主要在擬南芥根系的根尖細(xì)胞(如分生區(qū)、過(guò)渡區(qū)和伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞)表達(dá)，成熟區(qū)PIN2□∷□GFP表達(dá)活性明顯低于根尖細(xì)胞。在一定的鋁處理濃度內(nèi)，PIN2□∷□GFP表達(dá)活性隨著鋁處理水平增加而逐步增加。當(dāng)鋁處理濃度為100 μmol·L-1、處理時(shí)間為4 h時(shí)，PIN2□∷□GFP的活性達(dá)最高; 100 μmol·L-1鋁處理8 h，或者200 μmol·L-1鋁處理4 h，根尖PIN2□∷□GFP活性下降(圖3)。

2．4鋁對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞PIN2□∷□GFP蛋白累積的影響

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，正常生長(zhǎng)時(shí)，PIN2□∷□GFP囊泡蛋白在根尖細(xì)胞內(nèi)形成的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)數(shù)量多，但點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)的大小較少，明顯小于鋁脅迫條件下形成的點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)。鋁脅迫處理后( 100 μmol·L-1)，PIN2□∷□GFP蛋白在細(xì)胞膜水平方向上累積較強(qiáng)的熒光，表明鋁脅迫誘導(dǎo)了較多的PIN2蛋白向細(xì)胞膜水平方向累積。

2．5鋁對(duì)擬南芥PIN2蛋白在細(xì)胞膜與細(xì)胞膜內(nèi)分配的影響

蛋白印跡反應(yīng)通過(guò)蛋白質(zhì)與抗體雜交反應(yīng)，能較好指示蛋白的表達(dá)水平。利用該方法，我們研究了BFA和鋁脅迫對(duì)PIN2蛋白表達(dá)與分配的影響。圖5結(jié)果顯示:與對(duì)照( CK)相比，BFA處理以及Al +BFA處理對(duì)PIN2蛋白在細(xì)胞膜與細(xì)胞膜內(nèi)的分配沒(méi)有明顯影響，然而100 μmol·L-1AlCl3處理有增加PIN2蛋白向細(xì)胞膜分配的趨勢(shì)。上述結(jié)果表明BFA有抑制鋁誘導(dǎo)PIN2蛋白在細(xì)胞膜上累積的現(xiàn)象。結(jié)合圖4和圖5的結(jié)果可以看出，鋁脅迫處理不僅影響PIN2蛋白表達(dá)，還對(duì)PIN2囊泡蛋白的分配有調(diào)節(jié)作用。

圖4　鋁脅迫處理對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞PIN2□∷□GFP累積的影響　A．正常生長(zhǎng); B．鋁脅迫處理。Fig．4 Effects of Al stress on PIN2□∷□GFP protein accumulation in apical roots of Arabidopsis seedlings A．The control ( CK) ; B．100 μmol·L-1AlCl3．

圖5　PIN2蛋白在細(xì)胞膜和囊泡之間的分布　CK．正常生長(zhǎng)條件; BFA．20 μmol·L-1BFA; Al．100 μmol·L-1AlCl3; Al+BFA．20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3。Fig．5　Distribution of PIN2 protein in tissues between plasma membrane and endosomes of cells　CK．The control ( CK) ; BFA．20 μmol·L-1BFA; Al．100 μmol·L-1AlCl3; Al+ BFA．20 μmol·L-1BFA + 100 μmol·L-1AlCl3．

2．6鋁脅迫對(duì)擬南芥根尖細(xì)胞鋁內(nèi)置化的影響

Morin是一種能與鋁結(jié)合的熒光物質(zhì)，進(jìn)入細(xì)胞后與鋁結(jié)合，可指示細(xì)胞內(nèi)鋁的分布和累積情況。本實(shí)驗(yàn)利用Morin的這種特性，研究了鋁脅迫下pin2和WT根尖細(xì)胞的鋁內(nèi)置化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pin2根尖的Morin熒光物質(zhì)主要分布在質(zhì)外體的細(xì)胞間隙(圖6: A)，而野生型WT的根尖細(xì)胞質(zhì)中明顯存在類(lèi)似囊泡結(jié)構(gòu)的熒光物質(zhì)，但在質(zhì)外體空間的熒光亮度較低(圖6: B)。表明pin2材料累積的鋁主要分布在質(zhì)外體如細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上，而WT累積的鋁主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)。PIN2基因缺失可能減弱了鋁從細(xì)胞壁或細(xì)胞膜向細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸，說(shuō)明PIN2基因可能調(diào)節(jié)了細(xì)胞壁和細(xì)胞膜上累積的鋁向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，具體調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3　討論與結(jié)論

植物根系的生長(zhǎng)和發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。生長(zhǎng)素，細(xì)胞分裂素和赤霉素等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)植物根系的形態(tài)建成意義重大。其中生長(zhǎng)素的合成，運(yùn)輸和信號(hào)傳導(dǎo)在根系生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮了重要作用( Saini et al，2013)。根尖是植物鋁毒脅迫的主要位點(diǎn)，鋁毒能迅速抑制根尖伸長(zhǎng)。早期的研究發(fā)現(xiàn)，鋁會(huì)影響擬南芥根尖PIN2蛋白的囊泡運(yùn)輸，進(jìn)而破壞生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，最終抑制了根系生長(zhǎng)( Shen et al，2008)。本研究通過(guò)比較鋁脅迫對(duì)pin2和WT根系生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)鋁處理?xiàng)l件下pin2相對(duì)根長(zhǎng)小于WT。H2O2的熒光染色結(jié)果還表明鋁脅迫增加擬南芥根尖細(xì)胞H2O2累積，pin2的H2O2累積量大于WT。這說(shuō)明對(duì)于鋁毒害，PIN2基因缺失突變體比其對(duì)照野生型更敏感，也表明PIN2基因與鋁耐性有關(guān)。

圖6　兩個(gè)擬南芥材料根尖細(xì)胞鋁內(nèi)置化　A．pin2; B．WT。箭頭指示鋁的內(nèi)置化。Fig．6　Al internalization in apical cells of Arabidopsis seedlings A．pin2; B．WT．Arrow indicates Al internalization in the cells．

Abas et al( 2006)研究PIN2蛋白介導(dǎo)的根向地性發(fā)現(xiàn)，在重力刺激下，無(wú)論是用內(nèi)源啟動(dòng)子還是異源啟動(dòng)子，PIN2蛋白在根上、下部都會(huì)形成不平衡分布，其上部有更多的PIN2蛋白被降解，表明PIN2重新排布是由于轉(zhuǎn)錄后水平導(dǎo)致的。pin2突變體中PIN2蛋白重新分布和降解受到干擾，生長(zhǎng)素的分配被破壞，造成根向重力性表型缺失。光照能夠調(diào)節(jié)PIN2蛋白的囊泡運(yùn)輸，促進(jìn)定位于細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)而影響根系生長(zhǎng)( Laxmi et al，2008; Yokawa et al，2014)。本研究利用激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果表明，100 μmol·L-1鋁處理4 h能誘導(dǎo)最高的PIN2□∷□GPF蛋白表達(dá)活性，并且鋁脅迫誘導(dǎo)了較多的PIN2蛋白向細(xì)胞膜水平方向累積。本研究蛋白印跡反應(yīng)還進(jìn)一步表明，鋁處理促進(jìn)PIN2蛋白在細(xì)胞膜上累積，減少胞內(nèi)囊泡中PIN2蛋白的含量，而囊泡運(yùn)輸抑制劑( BFA)能抑制鋁誘導(dǎo)PIN2蛋白的分配。這暗示鋁脅迫可能通過(guò)影響PIN2蛋白的分配，從而影響根系內(nèi)部生長(zhǎng)素運(yùn)輸，最終影響根尖伸長(zhǎng)。

值得一提的是，本研究借助Morin染色，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)WT累積的鋁明顯比pin2的多。這表明PIN2基因缺失可能影響了鋁的內(nèi)置化。根尖過(guò)渡區(qū)是最先接觸鋁，同時(shí)又是對(duì)鋁最敏感的區(qū)域( Sivaguru＆Horst，1998; Sivaguru et al，1999)。在這個(gè)區(qū)域存在較高頻率的內(nèi)吞循環(huán)過(guò)程，并且鋁內(nèi)置化過(guò)程與內(nèi)吞運(yùn)輸相關(guān)( Illé?et al，2006)。而在擬南芥中PIN2蛋白主要定位于這個(gè)區(qū)域，通過(guò)高頻率的內(nèi)吞運(yùn)輸來(lái)完成質(zhì)膜與細(xì)胞內(nèi)部之間循環(huán)進(jìn)一步運(yùn)輸生長(zhǎng)素( Geldner et al，2003; Baluska et al，2005，2010)。這暗示生長(zhǎng)素運(yùn)輸?shù)鞍卓赡苤苯咏Y(jié)合鋁，借助生長(zhǎng)素向胞內(nèi)運(yùn)輸途徑將鋁轉(zhuǎn)運(yùn)至胞內(nèi)，這樣原本結(jié)合在細(xì)胞壁或細(xì)胞膜上的鋁可能借助囊泡的運(yùn)輸，通過(guò)“搭便車(chē)”的方式內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部( Panda et al，2009)。但具體調(diào)節(jié)機(jī)制還在進(jìn)一步研究中。總之，本研究表明，PIN2基因參與了鋁脅迫的響應(yīng)，PIN2蛋白在鋁運(yùn)輸及鋁對(duì)生長(zhǎng)素運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

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Effects of aluminum stress on the activity of PIN2 protein in Arabidopsis thaliana apical roots

CAO Hua-Ping，WU Dao-Ming，GAN Hai-Hua，SHEN Hong*

( College of Agriculture，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China )

Abstract:There is closely relationship between Al-influenced auxin transport and auxin transporter．PIN2 is an auxin efflux carrier protein，it unique localization may responses to Al-influenced auxin transport．In this study，using pin2，PIN2□∷□GFP and WT as experimental materials，the effects of Al stress on PIN2 protein activity，distribution and Al internalization were investigated with confocal laser scanning microscope．The results indicated that short-term Al treatment or low Al level increased the activity of PIN2 protein in apical cells of Arabidopsis seedlings，while long-term Al treatment or high Al levels inhibited it．The activity of PIN2 protein reached the maximal value in response to 100 μmol·L-1Al for 4 h．The results from Western-blotting analysis indicated that Al enhanced the accumulation of PIN2 protein on cell membrane，while decreased it in vesicles．Brefeldin A ( BFA)，an inhibitor of vesicle transport suppressed Al-induced allocation of PIN2 protein．On the other hand，Al stress could increase the accumulation of H2O2in apices．pin2 had a higher H2O2accumulation and a lower relative root elongation than WT．And the results from Al-Morin stai-book=122,ebook=127ning analysis indicated that pin2 had a lower Al internalization than WT．Taken together，the above results suggested that 100 μmol·L-1Al induced the highest activity of PIN2 protein，and enhanced its accumulation in horizontal direction of plasma membrane and Al internalization，thus mediated root growth．The results would provide scientific basis for elucidating Al-influenced auxin transport．

Key words:aluminum stress，Arabidopsis thaliana，AtPIN2，expression activity

*通訊作者:沈宏，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物根層調(diào)控原理與技術(shù)研究，( E-mail) hshen@ scau．edu．cn。

作者簡(jiǎn)介:曹華蘋(píng)( 1991-)，女，江西上饒人，碩士研究生，主要從事鋁毒害相關(guān)研究，( E-mail) caohuaping1991@ 163．com。

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金( 31172026，31372125)［Supported by the National Natural Science Foundation of China( 31172026，31372125)］。

收稿日期:2014-12-30修回日期: 2015-03-31

DOI:10．11931/guihaia．gxzw201412052

中圖分類(lèi)號(hào):Q945．78

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000-3142( 2016) 01-0121-06