高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中的頭孢尼西

周　昱，張　元，周一平，袁明美，馮雪松

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110013)

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高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定牛奶中的頭孢尼西

周昱，張?jiān)?，周一平，袁明美，馮雪松*

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧沈陽(yáng)110013)

摘要:建立了牛奶中頭孢尼西的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜( HPLC-MS/MS)快速測(cè)定方法．樣品采用乙腈提取，離心( 10 000 rmp，10 min)，上清液加入乙腈飽和的正己烷，振蕩，取乙腈層，進(jìn)行分析．采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱為分析柱，以5 mmol/L乙酸銨和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，流速0．8 mL/min，溫度35℃，進(jìn)樣量5 μL，采用電噴霧負(fù)離子模式進(jìn)行電離，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析．頭孢尼西在1．0～100 μg/L濃度范圍內(nèi)線性良好( r2=0．997)，檢出限( LOD)為0．04 μg/L，定量限( LOQ)為0．15 μg/L，采用低、中、高3個(gè)添加水平，平行測(cè)定6次，所得平均回收率分別為90．3%、87．4%、93．5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差( RSD)分別為4．5%、2．3%、2．1%．

關(guān)鍵詞:牛奶;頭孢尼西;高效液相色譜;質(zhì)譜

β-內(nèi)酰胺類抗生素是歷史最悠久的抗微生物藥物，同時(shí)也是使用量最大和最重要的一類抗生素［1］，主要用于抑制革蘭氏菌［2］，如葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌等．β-內(nèi)酰胺類抗生素作為奶牛飼養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常使用的一類抗生素，其在牛奶中的殘留將會(huì)對(duì)人體健康帶來(lái)重要影響［3－5］．如引起過(guò)敏反應(yīng)、造成泌尿系統(tǒng)損害和引起血液系統(tǒng)的反應(yīng)，甚至偶爾引發(fā)肝炎［6］等．為了避免消費(fèi)者受到食品中抗生素殘留的危害，保護(hù)人民的身體健康，各國(guó)都對(duì)各種抗生素制定了嚴(yán)格的最高殘留限量( MRL)［7］．如歐盟規(guī)定動(dòng)物組織和牛奶中各類頭孢菌素的MRL在20～100 μg/kg之間，其中牛奶中頭孢喹諾的MRL為20 μg/kg，而頭孢噻呋的MRL為100 μg/kg．頭孢尼西作為第二代注射用廣譜長(zhǎng)效頭孢菌素，其抗菌譜與頭孢孟多類似，主要用于敏感菌所致的下呼吸道感染、尿路感染以及敗血癥等，殘留在牛奶中的頭孢尼西可造成消費(fèi)者抽搐、頭痛、精神緊張等健康問(wèn)題．

目前，β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測(cè)方法主要有微生物法、免疫測(cè)定法、氣相色譜法、液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜法等［8－15］．液相色譜-質(zhì)譜法作為一種高靈敏度和高選擇性的檢測(cè)方法，其檢出限越來(lái)越低，提供的碎片信息越來(lái)越多，在食品獸藥殘留中的應(yīng)用也日趨廣泛［16－17］．然而由于文獻(xiàn)中所見(jiàn)報(bào)道的前處理繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，并且頭孢尼西在常溫條件下極不穩(wěn)定．預(yù)實(shí)驗(yàn)證明頭孢尼西鈉1 000μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液在室溫下放置一天將分解10%，因此關(guān)于頭孢尼西的液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道．本研究采用乙腈提取牛奶中的頭孢尼西，而后采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了牛奶中頭孢尼西含量的測(cè)定方法，該方法具有前處理簡(jiǎn)單、檢出限低、靈敏度高、準(zhǔn)確性好的優(yōu)點(diǎn)，可用于日常食品樣品中頭孢尼西含量的測(cè)定．

1　實(shí)驗(yàn)部分

1．1儀器與試劑

液相色譜儀1260 (美國(guó)Agilent公司)串聯(lián)API5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國(guó)Applied Biosystem公司) ; Avanti J-30I離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司) ; Milli-Q超純水處理系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司) ; SA-31振蕩器(日本Yamato公司) ;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)．

頭孢尼西鈉(純度≥99%)，購(gòu)自德國(guó)Dr．Ehrenstorfer公司;乙腈、正己烷、乙酸銨為色譜純，購(gòu)自美國(guó)J＆K公司;實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水儀制備．

1．2溶液配制

乙腈飽和正己烷:取100 mL正己烷和50 mL乙腈加入250 mL分液漏斗中，振搖1 min，靜置分層后棄掉乙腈．

5 mmol/L乙酸銨:取385．4 mg乙酸銨加入1 L溶劑瓶?jī)?nèi)，去離子水定容．

1．3實(shí)驗(yàn)步驟

稱取5 g試樣(精確至0．01 g)置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈，均質(zhì)器均質(zhì)2 min，提取液使用高速冷凍離心機(jī)在10℃，10 000 r/min離心10 min，然后加入10 mL乙腈飽和正己烷，震蕩1 min，棄掉正己烷，過(guò)膜，上機(jī)．

1．4實(shí)驗(yàn)條件

液相色譜條件:色譜柱ZORBAX Eclipse XDBC18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) ;柱溫35℃;樣品室溫度4℃;進(jìn)樣體積5 μL;流動(dòng)相A為5 mmol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈．梯度洗脫程序: 0～3．0 min，5%～50% B; 3．1～4．0 min，95% B; 4．1 ～5．0 min，5% B，流速為0．8 mL/min．

質(zhì)譜條件:電噴霧電離源5 500℃，負(fù)離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)( MRM) ;實(shí)驗(yàn)中所用的氣體均為高純氮?dú)?，碰撞? CAD)壓力為7 kPa，氣簾氣( CUR)壓力為30 kPa，霧化氣( GS1)壓力為55 kPa，輔助氣( GS2)壓力為65 kPa．電噴霧電壓( IS)為－4．5 kV，去溶劑溫度( TEM)為600℃，碰撞室出口電壓( CXP)為－21 V．分析物的定性/定量離子對(duì)，去簇電壓( DP)及碰撞電壓( CE)見(jiàn)表1．

表1　頭孢尼西的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometer parameters of Cefonicid

2　結(jié)果與討論

2．1樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

多數(shù)乳制品樣品中含有大量的蛋白質(zhì)和脂肪，這會(huì)給后續(xù)的檢測(cè)帶來(lái)極大的干擾，所以在樣品前處理中需要使用酸或有機(jī)溶劑將其中大部分的蛋白成分進(jìn)行變性和沉淀．考慮到頭孢尼西含有的四元環(huán)結(jié)構(gòu)在強(qiáng)酸條件下不穩(wěn)定，因此樣品提取及沉淀蛋白應(yīng)避免強(qiáng)酸的使用．本研究對(duì)比了有機(jī)溶劑甲醇和乙腈的提取效果，發(fā)現(xiàn)乙腈的提取效率優(yōu)于甲醇的，結(jié)果見(jiàn)圖1．乙腈提取物經(jīng)過(guò)離心取上清液，用乙腈飽和的正己烷對(duì)上清液進(jìn)行液液萃取，以有效去除牛奶中的脂肪．此方法離心后可以直接上機(jī)檢測(cè)，不需采用SPE柱凈化處理，大大縮短了前處理時(shí)間，并且節(jié)省了SPE柱耗材費(fèi)用．

圖1　不同試劑的提取效率對(duì)比Fig．1 Comparison of extract efficiency of different solvent

2．2色譜條件優(yōu)化

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)用于頭孢尼西的檢測(cè)尚未見(jiàn)報(bào)道，因此本研究考察了甲醇-水和乙腈-水作為流動(dòng)相時(shí)檢測(cè)頭孢尼西的靈敏度(圖2)．采用乙腈-水作為流動(dòng)相，100 ppb頭孢尼西的響應(yīng)強(qiáng)度是甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)的2倍，并且甲醇-水作為流動(dòng)相的噪音較高，本研究選擇乙腈-水為流動(dòng)相．

圖2　不同流動(dòng)相頭孢尼西標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)圖Fig．2 Comparison of different mobile phase for cefonicid

2．3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在ESI+和ESI－離子化模式下，考察了頭孢尼西的電離效果．實(shí)驗(yàn)表明，頭孢尼西在ESI－電離方式下響應(yīng)較好，這可能與頭孢尼西呈弱酸性相關(guān)．頭孢尼西的分子結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3．頭孢尼西的定量離子對(duì)提取離子色譜圖見(jiàn)圖4．

圖3　頭孢尼西分子結(jié)構(gòu)圖Fig．3 Molecular structure of Cefonicid

圖4　定量離子對(duì)提取離子色譜圖Fig．4 Extracted ion chromatograph of Cefonicid

使用陰性牛奶提取液逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液至濃度為1、5、10、25、100 μg/L，在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下測(cè)定，根據(jù)待測(cè)物濃度和定量離子峰面積關(guān)系進(jìn)行線性回歸．對(duì)陰性空白樣品提取液進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)各定量離子3和10倍信噪比( S/N)對(duì)應(yīng)樣品中目標(biāo)化合物的濃度，得到檢出限和定量限(表2)．

表2　頭孢尼西線性關(guān)系、檢出限( LOD)和定量限( LOQ)Table 2 Quadratic relationships，limits of detection ( LOD) and limits of quantification ( LOQ) of Cefonicid

2．4回收率和精密度

在空白牛奶樣品中添加3個(gè)濃度水平( 0．15、0．3、0．6 μg/L)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3．實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本方法的回收率在87．4%～93．5%范圍內(nèi)，精密度( RSD)小于5%，這表明本方法可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的測(cè)定．

表3　頭孢尼西平均回收率和精密度Table 3 Recoveries and precisions of Cefonicid

2．5實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)30份采集自超市的牛奶樣品進(jìn)行測(cè)定，均未檢出頭孢尼西．下一步將擴(kuò)大樣品范圍、對(duì)集貿(mào)市場(chǎng)等地的樣品也進(jìn)行檢測(cè)和分析，以摸清我國(guó)目前的牛奶中頭孢尼西使用情況．

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)牛奶樣品前處理方法的優(yōu)化，建立了牛奶中頭孢尼西的LC-MS/MS檢測(cè)方法．該方法具有快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高、檢出限低的特點(diǎn)，能夠滿足牛奶中頭孢尼西的檢測(cè)需求，其儀器條件也適用于其他類基質(zhì)中頭孢尼西的檢測(cè)．

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［責(zé)任編輯:任鐵鋼］

Determination of cefonicid in milk by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHOU Yu，ZHANG Yuan，ZHOU Yiping，YUAN Mingmei，F(xiàn)ENG Xuesong*

( School of Pharmacy，China Medical University，Shenyang 110013，Liaoning，China)

Abstract:A method based on high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry ( HPLC-MS) was established for the determination of cefonicid in milk．The milk sample was extracted with acetonitrile．Then，samples were centrifuged ( 10 000 r/min，10 min) to obtain the supernatant．After that the supernatant was added into acetonitrile-saturated hexane solutions and shaken to obtain the acetonitrile-soluble substances which were directly determined by HPLC-MS．The separation was performed on an ZORBAX Eclipse XDB-C18 column ( 150 mm×4．6 mm，5 μm) with 5 mmol/L ammonium acetate and acetonitrile gradient solution as the mobile phase at a flow rate of 0．8 mL/min and 35℃．The sample injection volume was 5 μL．The electrospray source was operated in the negative ion mode，and monitored in the selective reaction monitoring ( SRM) mode．The concentration of cefonicid in the range of 1．0－100 μg/kg was linearly correlated to the peak area，with correlation coefficients 0．997．The limit of detection ( LOD) and limit of quantitation ( LOQ) were determined to be 0．04 μg/ L and 0．15 μg/L，respectively the recoveries of cefonicid were from 87．4% to 93．5% with the relative standard deviations ( RSD) of 2．1% to 4．5%( n = 6)．

Keywords:milk; cefonicid; high performance liquid chromatography; mass spectrometry

作者簡(jiǎn)介:周昱( 1989－)，女，碩士生，從事藥劑學(xué)及藥物分析研究．*通訊聯(lián)系人，E-mail: voncedar@ 126．com．

基金項(xiàng)目:遼寧省科學(xué)技術(shù)廳自然科學(xué)基金( 201202252)．

收稿日期:2015－11－09．

中圖分類號(hào):R917

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1008－1011( 2016) 01－0077－04