不同助溶劑作用下桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的作用

楊　柳，胡　彬，謝　遙，蔣　丹，朱明芳*（.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙4008；.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙40005）

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不同助溶劑作用下桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的作用

楊柳1，胡彬1，謝遙1，蔣丹1，朱明芳2*
（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南長沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南長沙410005）

〔摘要〕目的觀察不同助溶劑作用下桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的作用，為痤瘡的治療提供一定實驗參考，同時為開發(fā)利用桉葉油資源提供支撐。方法采用平板牛津杯法及試管法，觀察桉葉油在不同助溶劑作用條件下對痤瘡丙酸桿菌的抑菌環(huán)直徑及最低抑菌濃度。結果純桉葉油（80%濃度）、桉葉油乙醇溶液（40%濃度）及桉葉油丙酮溶液（40%濃度）對痤瘡丙酸桿菌能表現(xiàn)出完全抑菌作用，平板上無細菌生長，陽性對照藥（16 μg/mL紅霉素）對痤瘡丙酸桿菌平均抑菌圈直徑為29.44 mm；助溶劑95%乙醇及丙酮對痤瘡桿菌無抑菌作用；空白對照（蒸餾水）對痤瘡丙酸桿菌無抑菌作用；當以丙酮為助溶劑時，桉葉油的最低抑菌濃度為濃度0.625%；當以95%乙醇為助溶劑時，桉葉油的最低抑菌濃度為1.25%。結論桉葉油對痤瘡丙酸桿菌有較好的抑菌作用；助溶劑95%乙醇、丙酮對痤瘡丙酸桿菌無抑菌作用；助溶劑對桉葉油的最低抑菌濃度有一定的影響，丙酮為助溶劑時較95%乙醇為助溶劑時最低抑菌濃度低。

〔關鍵詞〕桉葉油；助溶劑；乙醇；丙酮；痤瘡丙酸桿菌；抑菌作用；最低抑菌濃度

Study of Eucalyptus Oil with Different Cosolvent on Propionibacterium acnes

YANG Liu1, HU Bin1, XIE Yao1, JIANG Dan1, ZHU Mingfang2*
（1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410007, China; 2. The Second Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha, Hunan 410005, China）

〔Abstract〕Objective To observe eucalyptus oil with different cosolvent on Propionibacterium acnes（P. acnes）and provide certain references for the treatment of acne, at the same time provide the support for the development and utilization of eucalyptus oil resources. Methods The eucalyptus oil with different cosolvent on bacillus bacteriostatic ring diameter and the minimum bacteriostasis concentration of acne propionic acid were observed by using tablet Oxford cup method and test tube method. Results 80%pure eucalyptus oil, 40%eucalyptus oil ethanol solution and 40%eucalyptus oil acetone solution show completely bacteriostatic action on P. acnes, there is no bacterial growth on tablet. The average bacteriostatic circle positive control medicine（16 ug/mL erythromycin）on P. acnes was 29.44 mm; Cosolvent 95%ethanol and acetone didn't show bacteriostatic action on P. acnes; Blank control（distilled water）had no bacteriostatic action on P. acnes. When acetone as cosolvent, the minimal inhibitory concentrations（MIC）of eucalyptus oil was 0.625%; When 95%ethanol as cosolvent, the MIC of eucalyptus oil was 1.25%. Conclusion Eucalyptus oil show good bacteriostasis on P. acnes. The cosolvent 95% ethanol and acetone didn't exhibit bacteriostatic action. Cosolvent has a certain influence on the MIC of eucalyptus oil, when acetone as cosolvent the minimum bacteriostasis concentration was lower than 95%ethanol as cosolvent.

〔Keywords〕eucalyptus oil；cosolvent；alcohol; acetone; Propionibacterium acnes；bacteriostatic action；minimum bacteriostasis concentration

痤瘡是一種累積毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病，目前多認為與雄激素、皮脂分泌、痤瘡丙酸桿菌增殖、毛囊皮脂腺導管的異常角化、心理及遺傳，以及IL-1、TNF-α等細胞因子、P物質有關[1-3]。紅霉素對痤瘡丙酸桿菌高度敏感，是目前臨床治療痤瘡的首選藥物[4]，但具有一定的副作用，因此迫切需要尋找安全有效的藥物。中藥具有療效確切，副作用小、價格低廉等特點，桉葉油是桉樹葉油腺細胞分泌的芳香精油，具有抗菌、抗炎、殺蟲、促滲透、抗氧化等生理活性[5]，許多美容醫(yī)院發(fā)現(xiàn)桉葉油對痤瘡患者能起到較好的治療效果。但藥用桉葉油要求高，英國藥典規(guī)定，藥用桉葉油桉葉油素的含量必須≥70%[6]。藍桉葉油為我國的主要桉葉油種類，具有產量多，桉葉油素含量高（大于或等于80%）等特點，因此我們以藍桉葉油為研究對象，通過檢測不同助溶劑（95%乙醇及丙酮）作用下藍桉葉油對痤瘡主要致病菌（痤瘡丙酸桿菌）的抑菌環(huán)直徑及最低抑菌濃度，為桉葉油對痤瘡的治療提供更多的理論依據(jù)，同時也為桉葉油資源的開發(fā)利用提供更廣闊平臺。

1　實驗材料與方法

1.1材料

1.1.1受試菌株痤瘡丙酸桿菌（propionibacterium acnes）標準菌株ATCC6919由廣東省微生物研究所菌種保藏中心提供。

1.1.2試驗藥物80%桉葉油（桉葉素含量≥80%）購自德信行（珠海）香精香料有限公司，批號140923 -1＃；紅霉素購自solarbio公司，批號325B034。

1.1.3儀器與試劑SW-CJ-1BU垂直流超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；DZF-6090真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；PL202-S精密電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；95%乙醇、丙酮均為分析純。

1.2實驗方法

1.2.1培養(yǎng)基制備稱取32.0 g皰肉培養(yǎng)基基礎，放入燒杯中，加入1L蒸餾水中，煮沸制成皰肉培養(yǎng)基基礎液；同時按照2.5%的比例稱取一定量的瓊脂條放入其中，加熱煮沸至完全溶解，制成固體培養(yǎng)基；取中號試管加入皰肉牛肉粒，倒入皰肉培養(yǎng)基基礎液，沒過牛肉粒2 cm，配成液體培養(yǎng)基，放入121℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min制備成固體培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)基備用。

1.2.2菌種的活化將裝有痤瘡丙酸桿菌的安瓿管尖端放在火焰上加熱；滴少量無菌水至加熱處使之破裂；用鑷子輕輕敲下安瓿管頂端；用鑷子取出小管內的脫脂棉，將小管開口處在火焰上過一遍，并保持在火焰旁操作；用無菌吸管吸取0.5 mL液體培養(yǎng)基滴入小管內；輕輕震蕩，使凍干菌體溶解呈懸浮狀，吸取全部菌體懸液移植在斜面及平板培養(yǎng)基上，并在37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h，將菌種兩次繼代培養(yǎng)后使用。

1.2.3藥液及菌懸液的制備將濃度為80%的桉葉油用95%乙醇及丙酮分別采用兩倍稀釋的方法稀釋為40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%幾個濃度；稱取一定量的紅霉素，將其用滅菌蒸餾水稀釋為16 μg/mL備用；取痤瘡丙酸桿菌菌落，采用比濁儀，使用滅菌生理鹽水將菌落調整為0.5個麥氏比濁單位（約為1.0×10 cfu/mL）菌懸液備用。

1.2.4平板的制備將培養(yǎng)基加熱溶解，待其溫度為55℃時，每個平板中倒入2/3的固體培養(yǎng)基，待其冷卻固定后備用。

1.2.5桉葉油的抑菌圈直徑檢測取制備好的平板，每組平行做3個平板，每個平板中用吸管滴入0.1 mL的菌懸液，用涂布棒將菌懸液涂布均勻，待其干燥2 min后。第一組平板中放入1個牛津杯，杯中放入濃度為80%的桉葉油；第二組平板中放入1個牛津杯，杯中放入濃度為40%桉葉油乙醇溶液；第三組平板中放入1個牛津杯，杯中放入濃度為40%桉葉油丙酮溶液；第四組平板中放入4個牛津杯，杯中分別放入濃度為16 μg/mL的紅霉素、95%乙醇、丙酮、滅菌蒸餾水，以上藥液每個牛津杯中加入200 μL，放入37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的情況。

1.2.6桉葉油的最低抑菌濃度取桉葉油乙醇及丙酮溶液20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.625%幾個濃度，將桉葉油與液體培養(yǎng)基充分混合，使最終濃度為5%、2.5%、1.25%、0.625%、0.3125%、0.15625%，分別設為1-6號管，每個試管中加入0.1 mL的菌懸液，同時設置丙酮及95%乙醇、培養(yǎng)基＋菌懸液、培養(yǎng)基對照，分別標為7-9號管，放入37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48 h觀察細菌生長情況，以完全沒有細菌生長的精油濃度為最小抑菌濃度。

2　實驗結果與分析

2.1桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈測定

由表1可知，桉葉油對痤瘡丙酸桿菌能起到較好的抑菌效果，純桉葉油（80%濃度）、桉葉油乙醇溶液（40%濃度）及桉葉油丙酮溶液（40%濃度）對痤瘡丙酸桿菌能表現(xiàn)出完全抑菌作用，平板上無細菌生長；陽性對照藥（16 μg/mL紅霉素）對痤瘡丙酸桿菌平均抑菌圈的直徑為29.44 mm；助溶劑95%乙醇及丙酮對痤瘡桿菌無抑菌作用；空白對照（蒸餾水）對痤瘡丙酸桿菌無抑菌作用。

表1　桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的抑菌圈測定　（n＝3）

2.2桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度測定

由表2可知，桉葉油對痤瘡丙酸桿菌有抑菌作用，助溶劑95%乙醇及丙酮對痤瘡丙酸桿菌無抑菌作用，但是對痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌作用有一定的影響，當以丙酮為助溶劑時，桉葉油的最低抑菌濃度為0.625%，95%乙醇為助溶劑時，最低抑菌濃度為1.25%，以丙酮為助溶劑時其最低抑菌濃度較以95%乙醇為助溶劑時低。

表2　桉葉油對痤瘡丙酸桿菌的最低抑菌濃度測定（n＝3）

3　討論

痤瘡是發(fā)生于毛囊皮脂腺的慢性炎性皮膚病，具有一定的損容性，給患者的帶來一定的身體損傷和心理壓力。目前多認為與雄激素、皮脂腺分泌增加、毛囊皮脂腺開口處過度角化和痤瘡丙酸桿菌感染四大因素有關。雄激素水平增高可使皮脂腺分泌增大及皮脂腺分泌增加，皮脂為毛囊內寄生菌（痤瘡丙酸桿菌、卵圓形糠秕孢子絲菌、表皮葡萄菌等）的生長提供物質基礎，痤瘡丙酸桿菌可水解皮脂中的甘油三酯，產生的游離脂肪酸可刺激毛囊皮脂腺開口處上皮增生及角化過度，后者使皮脂腺分泌通道受阻、排泄不暢，當皮脂、角質團塊等淤積在毛囊口時即形成粉刺，富有刺激性的游離脂肪酸可刺激毛囊引起炎癥性皮損。另外由痤瘡丙酸桿菌產生的一些低分子多肽可趨化中性粒細胞，后者產生的水解酶也可使毛囊壁損傷破裂，上述各種毛囊內容物溢入真皮引起毛囊周圍程度不等的深部炎癥，引發(fā)從炎性丘疹到囊腫等一系列臨床表現(xiàn)。因此，痤瘡丙酸桿菌在痤瘡的發(fā)病及炎癥形成中起著重要作用。痤瘡的西醫(yī)治療目前多采用維生素類、激素類、抗生素及抗菌藥物，這些藥物雖然有一定的治療作用，但同時存在口唇發(fā)干，脫屑，血脂升高，致畸，影響電解質平衡等副作用，因此，尋找安全有效的治療藥物很重要[7]。

桉葉油是桉樹葉油腺細胞分泌的芳香精油，具有較強的抗菌作用，對多種細菌、真菌及霉菌等表現(xiàn)出一定的抗菌活性。近年來桉葉油的抗菌作用研究越來越多，倪木蘭等研究表明桉葉油對革蘭陽性菌有抑菌作用[8],但桉葉油的抑菌作用多集中在對金黃色葡萄球菌方面，對痤瘡的主要致病菌痤瘡丙酸桿菌的研究比較少。

本研究對桉葉油進行了痤瘡丙酸桿菌的抑菌試驗，結果顯示，桉葉油對痤瘡丙酸桿菌有較好的抑制作用，與夏靜明等的研究，桉葉油中主要含有桉葉素具有較強的抗痤瘡丙酸桿菌的作用，其抑菌圈平均直徑為20.75 mm，屬高敏范圍[9]，結果一致。同時，我們還發(fā)現(xiàn)助溶劑對痤瘡丙酸桿菌沒有作用，但是對桉葉油的最低抑菌濃度有一定的影響，當以丙酮為助溶劑時其最低抑菌濃度為0.625%，乙醇為助溶劑時其最低抑菌濃度為1.25%，丙酮為助溶劑時其最低抑菌濃度較乙醇低。

參考文獻：

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[9]夏明靜，曹煜，楊捷，等.22種抗菌消炎中藥有效成分對痤瘡丙酸桿菌的抑制作用[J].中華皮膚科雜志，2001，34（6）：435-436.

（本文編輯楊瑛）

〔通訊作者〕*朱明芳，女，教授，碩士研究生導師，E-mail:26715858@qq.com。

〔作者簡介〕楊柳，女，在讀碩士研究生，研究方向：中醫(yī)藥對皮膚病的防治與研究。

〔基金項目〕湖南省科技廳項目（2014SK4051）；湖南省教育廳基金項目（13B086）。

〔收稿日期〕2015-09-23

〔中圖分類號〕R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2016.02.012