馬齒莧揮發(fā)油對辣椒素誘導(dǎo)瘙癢相關(guān)胞內(nèi)通路的影響＊

胡一梅，葛一漫，王 華，鐘振東，鄢林霞

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/附屬醫(yī)院 成都 610075；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所 成都 610212；3. 成都里來生物科技有限公司 成都 610000）

馬齒莧揮發(fā)油對辣椒素誘導(dǎo)瘙癢相關(guān)胞內(nèi)通路的影響＊

胡一梅1，葛一漫1，王 華1，鐘振東2＊＊，鄢林霞3

（1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院/附屬醫(yī)院 成都 610075；2. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所 成都 610212；3. 成都里來生物科技有限公司 成都 610000）

目的：本研究通過馬齒莧揮發(fā)油干預(yù)辣椒素誘導(dǎo)角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)瘙癢模型，探究馬齒莧對抗?jié)裾铕W的作用機制。方法：采用辣椒素誘導(dǎo)的SD大鼠角質(zhì)層細(xì)胞作為胞內(nèi)瘙癢模型，模型細(xì)胞分為模型組、馬齒莧揮發(fā)油高、低劑量組，另設(shè)正常角質(zhì)層細(xì)胞作為空白對照。實驗結(jié)束后采用免疫熒光技術(shù)檢測角質(zhì)層細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，采用酶聯(lián)免疫法法測定白三烯、白細(xì)胞介素-31和H1羥色胺含量，RT-PCR測定角質(zhì)層細(xì)胞中辣椒素受體蛋白基因表達，western blot測定辣椒素受體蛋白表達。結(jié)果：與模型組相比，馬齒莧揮發(fā)油干預(yù)組的陽性角質(zhì)層細(xì)胞數(shù)量明顯減?。≒＜0.05），胞內(nèi)Ca2+濃度明顯降低（P＜0.05），白三烯、白細(xì)胞介素-31和H1羥色胺含量均有明顯減少（P＜0.05），角質(zhì)層細(xì)胞中辣椒素受體蛋白的基因和蛋白表達均明顯減少（P＜0.05）。結(jié)論：馬齒莧揮發(fā)油可能通過下調(diào)辣椒素受體蛋白表達，減少炎癥繼發(fā)反應(yīng)而產(chǎn)生止癢效應(yīng)。

馬齒莧揮發(fā)油 辣椒素 瘙癢相關(guān)胞內(nèi)通路 辣椒素受體蛋白

濕疹是常見的變態(tài)反應(yīng)性炎癥性皮膚病，其臨床特點包括：瘙癢，皮膚出現(xiàn)紅斑、丘疹或丘皰疹，甚至有水皰滲出，病程纏綿難愈，導(dǎo)致慢性濕疹[1]。濕疹的病理特點為表皮內(nèi)海綿形成，伴不同程度的棘層肥厚和淋巴細(xì)胞浸潤[2]。濕疹的病因復(fù)雜多樣，病程遷延，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。因此，深入研究濕疹的發(fā)病機制，對臨床研究有效的治療方法具有重要意義。

辣椒素受體蛋白（Transient Receptor Potential Vanilloid 1，TRPV1）是感覺傷害感受器最重要的信號整合分子，表達于皮膚，具有傳導(dǎo)疼痛信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞存活和死亡等作用。溫度、機械性刺激和酸堿度均可影響皮膚TRPV1的表達。高水平的TRPV1可促進基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）-1的表達增強，進一步激活感覺神經(jīng)元，引起瘙癢癥和炎癥的發(fā)生[3]。另外，在濕疹病理改變過程中，瘙癢癥狀可能通過降低觸覺閾值而產(chǎn)生[4，5]。TRPV1介導(dǎo)的濕疹瘙癢信號機制見圖1。

馬齒莧為馬齒莧科馬齒莧（Portulaca oleracea L.）地上的干燥部分，具有清熱解毒、涼血止血的功效，是常見的藥食兩用植物?，F(xiàn)代研究表明，馬齒莧具有抗菌消炎、降血脂、松弛肌肉、促進傷口愈合等作用[6]。課題組前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，馬齒莧對急慢性濕疹療效顯著，采用中藥現(xiàn)代分離制備和活性追蹤相結(jié)合，課題組已明確馬齒莧治療濕疹的主要活性成分為揮發(fā)油類物質(zhì)，而目前國內(nèi)外關(guān)于馬齒莧揮發(fā)油對濕疹瘙癢干預(yù)作用的關(guān)注甚少。本研究在臨床研究的基礎(chǔ)上，立足于急性濕疹瘙癢的發(fā)病機制，通過觀察鮮品馬齒莧揮發(fā)油干預(yù)辣椒素（Capsaicine，CAP）誘導(dǎo)的角質(zhì)層細(xì)胞（Keratinocyte，KC）內(nèi)瘙癢模型，探究馬齒莧治療濕疹的作用機制和靶點。

1 材料

1.1 實驗藥物

馬齒莧鮮植物，采自四川省西昌市甘洛縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥鑒定教研室盧先明教授鑒定為純正藥材。馬齒莧揮發(fā)油制備方法：稱取新鮮馬齒莧全草500 g，適當(dāng)粉碎后采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油。餾出液經(jīng)NaCl飽和后用乙醚萃取3次。萃取液用無水硫酸鈉干燥24 h，減壓回收乙醚，即得。

1.2 實驗動物

實驗采用SPF級SD大鼠，體質(zhì)量220±5 g，購自成都達碩生物科技有限公司，實驗動物質(zhì)量合格證號：scxkc（111）2008-24。

1.3 儀器及試劑

PIKORed96型RT-PCR擴增儀、MK3型多功能酶標(biāo)儀、FORMA-311型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱（均為美國Thermo Fisher公司）。Trans-Blot SD型半干式轉(zhuǎn)膜儀、Power PAC 200型垂直式電泳儀（均為美國BIO-RAD公司）。引物、TRIzol（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）。RNAiso Plus Kit（批號：BK3303）、PrimeScript RT reagent Kit（批號：BK501）、SYBR Premix Ex Taq II Kit（批號：BK402）等均購自大連寶生物工程有限公司。LTA4（批號：B-1409）、HTH1（批號：B-1403）、IL-31（批號：B-1404）Elisa kit均購自Bioworld Technology公司。辣椒素（美國sigma公司，批號：DR203）。

2 方法

2.1 大鼠KC的分離培養(yǎng)

SD大鼠角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)按照Andoh方法：SD大鼠斷頸處死，迅速剪取背部皮膚，經(jīng)雙抗PBS清洗后去除皮下組織，用含0.02% EDTA的雙抗PBS液漂洗2次，皮片用0.25%胰酶消化分離表皮，加入10%FBS的無酚紅1640培養(yǎng)基獲得單個角質(zhì)形成細(xì)胞懸液，并稀釋細(xì)胞濃度至4×104個·mL-1接種到96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，置于37℃、5%CO2的孵箱中進行原代培養(yǎng)24 h。

圖1 TRPV1介導(dǎo)的濕疹瘙癢信號機制

2.2 細(xì)胞內(nèi)瘙癢模型的建立[7]及分組給藥

KC培養(yǎng)過夜后，在細(xì)胞懸液中加入濃度為100 μg·L-1的CAP-HBSS溶液進行激發(fā)，孵育60 min。取激發(fā)后的KC，用PBS 沖洗，取含5×104-6×104個·mL-1的細(xì)胞懸液150 μL接種于96孔培養(yǎng)板，分別加入10、20 μL馬齒莧揮發(fā)油，加RPM I-1640培養(yǎng)液至200 μL，分別作為藥物高、低劑量組；模型組只加CAP激發(fā)后的KC懸液150 μL，加培養(yǎng)液至200 μL，另設(shè)空白對照組，加入相同濃度和體積、未經(jīng)CAP激發(fā)的KC細(xì)胞，以上組別分別平行10孔，置于恒溫CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。取出細(xì)胞，4℃終止反應(yīng)，收集各實驗組KC細(xì)胞及上清液進行檢測。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 KC形態(tài)學(xué)觀察

實驗組KC采用免疫熒光技術(shù)進行染色，染色后的細(xì)胞形態(tài)用熒光顯微鏡進行觀察。

2.3.2 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度測定

流式細(xì)胞技術(shù)（λ=488 nm）隨機測定單個KC的熒光強度值，取各組細(xì)胞的平均熒光強度值作為每份樣品Ca2+濃度的測定值。

2.3.3 LTA4、HTH1和IL-31水平測定

吸取各實驗組KC細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于離心機中以1 500 r·min-1離心10 min，收集上清液，按ELISA試劑盒操作說明檢測各實驗組LTA4、HTH1和IL-31的蛋白表達水平。

2.3.4 TRPV1基因表達檢測

各實驗組KC總RNA采用TRIzol試劑進行提取，PCR 反應(yīng)采用兩步法進行，PCR反應(yīng)條件如下：（95℃預(yù)變性10 min，95℃預(yù)變性30 s）×40個循環(huán)，95℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s。從而得到每個樣品的Ct值，以Actb作為內(nèi)參照基因進行校準(zhǔn)，采用2-ΔΔCt法計算Trpv1基因的表達量。Trpv1和Actb基因引物信息見表1。

2.3.6 TRPV1蛋白表達檢測

KC總蛋白的提取采用細(xì)胞裂解法，蛋白定量采用Lowry法，SDS-PAGE凝膠電泳，western blot蛋白質(zhì)印跡。蛋白條帶使用凝膠成像系統(tǒng)成像后用Scion Image軟件進行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進行校準(zhǔn)，采用TRPV1蛋白條帶灰度值/ β-actin條帶灰度值的比值來表示TRPV1的相對蛋白表達量。

2.4 統(tǒng)計方法

用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以 表示，組間采用單因素方差分析，方差齊者組間進行LSD-t檢驗，方差不齊者進行Tamhane’s T2檢驗。P＜0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧揮發(fā)油對KC形態(tài)的影響

馬齒莧干預(yù)后，KC陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞核體積縮小，核固縮，無核仁。各實驗組KC形態(tài)見圖2。

3.2 馬齒莧揮發(fā)油對KC內(nèi)Ca2+濃度的影響

表2顯示，與空白組相比，模型組KC內(nèi)Ca2+濃度明顯提高（P＜0.05）；與模型組相比，馬齒莧高、低劑量組KC內(nèi)Ca2+濃度均有明顯降低（P＜0.01）。

3.3 馬齒莧揮發(fā)油對LTA4、IL-31和HT H1水平的影響

由圖3可知，與空白組相比，模型組KC中LTA4、IL-31和HT H1蛋白含量均明顯增加（P＜0.05）。與模型組相比，馬齒莧揮發(fā)油高、低劑量組KC中LTA4、IL-31和HT H1蛋白含量均明顯減少（P＜0.05）。

表1 TRPV1和β-action的基因引物序列

圖2 各實驗組KC熒光圖片(×100 μm)

3.4 馬齒莧揮發(fā)油對TRPV1mRNA表達的影響

3.4.1 RT-PCR溶解曲線分析

各實驗組TRPV1和β-actin熔解曲線中均有單一的主峰，TRPV1 Tm值均為86.12℃，β-actin的Tm值均為85.24℃，相同擴增條件下重復(fù)多次，得到TRPV1和β-actin熔解溫度上下浮動不超過1℃，融解曲線單一峰無非特異性熒光，說明產(chǎn)物特異性強，無引物二聚體，定量準(zhǔn)確，見圖4、圖5。

3.4.2 RT-PCR擴增曲線分析

從圖6可知，β-actin和TRPV1的Ct值均在20-35范圍內(nèi)，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序設(shè)置合理。

3.4.3 各實驗組Trpv1基因表達量

表3顯示，與空白組相比，模型組KC中TRPV1基因表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組相比，馬齒莧高、低劑量組KC中Trpv1基因表達明顯減少（P＜0.05）。

3.5 馬齒莧揮發(fā)油對TRPV1蛋白表達的影響

圖7顯示，與正常組比較，模型組KC中TRPV1蛋白表達明顯增加（P＜0.01）；與模型組比較，馬齒莧揮發(fā)油高、低劑量組KC中TRPV1蛋白表達均明顯減少（P＜0.05）。

表2 各實驗組角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(±s，n=10)

表2 各實驗組角質(zhì)層細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(±s，n=10)

注：與空白組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

組別Ca2+濃度/μmol·L-1空白組0.75±0.13模型組3.49±0.41**低劑量組1.85±0.24#高劑量組1.16±0.15#

圖3 各實驗組KC 中LTA4、SP和HT H1蛋白含量

圖4 TRPV1的RT-PCR溶解曲線分析

圖5 β-action的RT-PCR溶解曲線分析

圖6 TRPV1的RT-PCR擴增曲線分析

圖7 β-action的RT-PCR擴增曲線分析

4 討論

濕疹瘙癢的發(fā)生是多種內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)參與的多信號轉(zhuǎn)到途徑共同作用的結(jié)果。在這其中，TRPV1起著至關(guān)重要的作用。TRPV1是一種Ca2+可滲透的非選擇性陽離子通道受體，可被CAP、炎性介質(zhì)（如花生四烯酸代謝物）、組織損傷刺激物、熱、酸等激活引起疼痛或瘙癢[8]。TRPV1在皮膚感覺神經(jīng)纖維、肥大細(xì)胞及角質(zhì)層細(xì)胞上均有表達，參與皮膚的正常功能和疾病的發(fā)生。目前已經(jīng)明確TRPV1通道蛋白激活時主要引起Ca2+內(nèi)流，以胞內(nèi)Ca2+濃度增高的形式調(diào)節(jié)著相應(yīng)的生理功能或病理機制的發(fā)生。

Veronesi等[9]研究表明，CAP及神經(jīng)肽類物質(zhì)可協(xié)同作用引起KC上TRPV1通道活化，導(dǎo)致質(zhì)膜滲透性增加和去極化，Ca2+內(nèi)流增加。同時，該通道被激活后促進炎性介質(zhì)（IL、LT、TNF等）釋放，后者進一步激活或敏化分布于皮膚表皮的感覺神經(jīng)上TRPV1通道，最后以P物質(zhì)和HT H1釋放的形式通過神經(jīng)傳導(dǎo)介導(dǎo)了濕疹及其瘙癢病理的發(fā)生。

研究顯示，辣椒堿注射到正常皮膚內(nèi)會引起疼痛，而其外用則會引起瘙癢。動物實驗發(fā)現(xiàn)，TRPV1拮抗劑可阻止小鼠皮內(nèi)注射辣椒堿誘導(dǎo)的皮膚搔抓反應(yīng)，表明皮膚炎癥能夠改變TRPV1通道活化后引起的繼發(fā)反應(yīng)[10]。本實驗研究結(jié)果顯示，馬齒莧揮發(fā)油可顯著下調(diào)CAP誘導(dǎo)的Trpv1基因和蛋白的過表達，表明馬齒莧揮發(fā)油可顯著抑制濕疹狀態(tài)下TRPV1通道活性，其結(jié)果與文獻報道相似。臨床上馬齒莧止癢機制的發(fā)揮可能是通過

表3 各實驗組KC中TRPV1基因表達量(±s，n=10)

表3 各實驗組KC中TRPV1基因表達量(±s，n=10)

注：與正常組相比，**P＜0.01，與模型組相比，#P＜0.05。

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圖6 各實驗組KC中TRPV1蛋白表達量

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Impacts of Volatile Oil from Portulaca Oleracea L. on the Inner Cellular Signaling of Itch Model Stimulated by Capsaicine

Hu Yimei1, Ge Yiman1, Wang Hua1, Zhong Zhendong2, Yan Linxia2
(1. Clinical College/Teaching Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075, China;
2. Experimental Animals Institute of Sichuan Province People's Hospital, Sichuan Academy of Medical Sciences, Chengdu 610212, China;
3. Chengdu Lilai Biological Technology Co., Ltd., Chengdu 610000, China)

This study aimed to explore the mechanism of volatile oil from purslane in treating itch induced by eczema through establishing the itch model, stimulating the keratinocyte with capsaicine (CAP). SD rats were divided into the control group, the model group, the high dose group of volatile oil from purslane, and low dose group of volatile oil from purslane. After finishing the experiment, the morphology of keratinocytes was observed by immunofluorescence technique, while Ca2+concentration was detected by flow cytometry, and the contents of leukotriene A4 methyl ester (LTA4), interleukin-31 (IL-31) and hydroxy trptamine H1 (HTH1) were quantified by ELISA assay. The expression of TRPV1 mRNA in keratinocytes was tested by RT-PCR, while the protein level of TRPV1 was quantified by western blot. Compared with the model group, it was found that the cell count of positive keratinocytes, the Ca2+concentration, the levels of LTA4, IL-31 and HTH1, and the mRNA and protein expressions of TRPV1 in the high dose and low dose groups were significantly decreased (P ＜ 0.05). In conclusion, it was demonstrated that the volatile oil from purslane may relieve itch through inhibiting the activation of TRPV1 and reducing secondary inflammatory reaction.

Volatile oil from purslane, capsaicine, intracellular signaling of itch, transient receptor potential vanilloid 1

（責(zé)任編輯：朱黎婷，責(zé)任譯審：朱黎婷）

10.11842/wst.2016.07.020

R285

A

2016-03-31

修回日期：2016-06-10

＊ 國家自然科學(xué)基金委青年科學(xué)基金項目（81403405）：馬齒莧提取物激活TRPV1調(diào)控癢信號通路治療急性濕疹的分子機制研究，負(fù)責(zé)人：胡一梅。

＊＊ 通訊作者：鐘振東，副研究員，主要研究方向：毒性病理學(xué)。